Interferon-alpha ELISA

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1 Fiche technique Interferon-alpha ELISA Test immunoenzymatique pour le dosage quantitatif de l Interféron-alpha humain (IFN-alpha) dans le sérum, plasma et les surnageants de culture cellulaire humains. BE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 INFORMATIONS SUR LE PRODUIT ET MANUEL 1. BUT DE TEST 2 2. SOMMAIRE 2 3. PRINCIPE DU TEST 3 4. REACTIFS FOURNIS 4 5. INSTRUCTIONS DE STOCKAGE 4 6. COLLECTE DES ECHANTILLONS ET INSTRUCTIONS DE STOCKAGE 4 7. MATERIEL REQUIS MAIS NON FOURNIS 5 8. PRECAUTIONS D EMPLOI 5 9. PREPARATION DES REACTIFS PROTOCOLE DE TEST CALCUL DES RESULTATS LIMITES PERFORMANCE DU TEST INFORMATION DE COMMANDES RESUME PREPARATION DES REACTIFS RESUME DU PROTOCOLE LITTERATURE DE REFERENCE SUR LE PRODUIT (27) 1/18

3 1. But du Test L Interferon-alpha ELISA est un test immuno-enzymatique pour la détection quantitative du IFN-α humain. L Interferon-alpha ELISA est destinée à une utilisation diagnostique in vitro. Ne pas utiliser dans les procédures thérapeutiques. 2. Sommaire Les interférons représentent des protéines ayant une activité antivirale, secrétés par des cellules en réponse à une grande variété de stimuli. Chez les mammifères, les gènes (IFN-) interféron de classe I forment une superfamille composée de trois familles de gènes, les gênes de l'interféron alpha (IFN-α), de l'interféron bêta (IFN-β) et de l'interféron oméga (IFN-ω). Chez l'homme, la famille des INF- comprend plus de 20 gènes et pseudogènes à l origine de 15 produits géniques fonctionnels différents. Les différentes espèces d'ifn- humains sont étroitement liées aux séquences d'acides aminés avec des homologies de l'ordre de 80 à 100 %. Le poids moléculaire des espèces de l'ifn- humain recombinant est d'environ 19 kda composé de 166 résidus d'acide animés (165 pour IFN- 2) sans N-glycosylation ( 14 est N-glycosylé). Les ponts disulphures médiés par cystéine sont indispensables à l'activité biologique de l'ifn-. La structure secondaire de l'ifn- a été déterminée comme étant principalement -hélicoïdale. L'analyse cible de l'ifn- humain suggère que l'unité fonctionnelle est un monomère. Les gènes codant pour tous les interférons de classe I connus ont été localisés sur le chromosome 9, les séquences codantes (ADNc) sont sous-clonées et caractérisées. Un haut niveau d expression des interférons a été réalisée chez E. coli codant pour une protéine identique pour l'essentiel à la protéine naturelle. Les interférons présentent un nombre important d'effets biologiques. Leur activité antivirale est à l'origine du nom interféron et sert à définir l'unité d'activité de l'interféron. En purifiant les interférons de leucocytes humains naturels (IFN- ), on a constaté que toutes les fractions qui présentaient une activité antivirale présentaient aussi une activité anti-croissance. Cette observation a été confirmée avec des interférons recombinants purifiés et étendue à d'autres activités comme : la stimulation d'activités cytotoxiques de lymphocytes et de macrophages, l'activité de cellules tueuses naturelles (NK) ainsi que l'augmentation de l'expression de certains antigènes associés aux tumeurs. Les activités anti-prolifératives et anti-tumorales de l'interféron ont conduit à son application comme agent anti-tumoral. Les interférons modulent aussi la différenciation cellulaire. Un effet important des interférons est leur modulation des antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH). Tous les interférons induisent une augmentation de l'expression de surface des antigènes CMH de classe I. L'expression des récepteurs Fc est aussi stimulée par l'interféron. Les altérations dans les antigènes de surface peuvent constituer un mécanisme important par lequel l'interféron peut moduler des interactions cellulaires. L'interaction des interférons avec leurs récepteurs détermine les événements biochimiques et leur modulation des fonctions cellulaires. Il s'agit d'un processus complexe que l'on commence juste à disséquer. Le rôle de l'ifn- comme marqueur de maladie et marqueur pour des approches immunothérapeutiques a été démontré pour un certain nombre d'indications et de situations pathologiques différentes: - Durant la phase aiguë d'une infection virale les taux d'ifn- sont significativement élevés chez la plupart des patients. Les taux d'ifn- baissent significativement durant la période de convalescence au moment où l'infection virale est indiquée par des tests de séroconversion. - On a observé des taux élevés d'inf- chez la majorité des patients souffrant d'arthropathies inflammatoires comme la polyarthrite juvénile, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylosante, la polychondrite, l'arthrite psoriasique, la pseudomyalgie rhumatismale et la sclérodermie. Des taux élevés d'ifn- ont aussi été rapportés pour d'autres troubles auto-immuns comme le lupus érythémateux systémique et la vascularite systémique. - Les taux sériques d'ifn- peuvent aider à distinguer entre des enfants souffrant de douleurs abdominales non spécifiques ou d'une adénite mésentérique, et ceux atteints d appendicite aiguë. - Pour les récidives locales résistantes dans par ex. le cancer du sein et la propagation métastatique, l'infiltration locale d'ifn- constitue une nouvelle approche intéressante. L'interféron administré par voie intrapleurale provoque des concentrations sériques mesurables qui sont corrélées avec la dégénérescence des cellules malignes (27) 2/18

4 3. Principe du Test Un anticorps anti-ifn-α humain est coaté sur des micropuits. Figure 1 Micropuits Coaté Anticorps Coaté Figure 2 L IFN-α humain présent dans l'échantillon ou l étalon se lie aux anticorps adsorbés dans les puits, un anticorps anti-ifn-α humain conjugué HRP est ajouté et se lie au IFN-α humain capturé par le premier anticorps. Première Incubation Etalon ou Echantillon Conjugué HRP Figure 3 Après l'incubation l anticorps anti-ifn-α humain non fixé au conjugué HRP est enlevé au cours d'une étape de lavage, et la solution substrat réactive à la HRP est ajoutée aux puits. Deuxième Incubation Substrat Un produit coloré est formé en proportion de la quantité en IFN-α humain présente dans l'échantillon ou l étalon. La réaction est arrêtée par addition d'acide et l'absorbance est mesurée à 450 nm. Un courbe étalon est préparé à partir de sept dilutions d étalon IFN-α humain et la concentration en IFN-α humain déterminée. Figure 4 Substrat Réagi (27) 3/18

5 4. Réactifs Fournis 1 pochette en aluminium contenant une Plaque de Microtitration recouverte d'anticorps monoclonaux anti-ifn-α humain. 1 flacon (200 μl) de Conjugué HRP anticorps monoclonaux anti-ifn-α humain 2 flacons d Étalon IFN-α humain lyophilisé, 1000 pg/ml après reconstitution 1 flacon Contrôle elevé, lyophilisé 1 flacon Contrôle bas, lyophilisé 1 flacon (5 ml) Tampon pour Essai Concentré 20x (PBS avec 1% Tween 20 et 10% BSA) 1 bouteille (50 ml) de Tampon de Lavage Concentré 20x (PBS avec 1% du Tween 20) 1 flacon (15 ml) de Solution Substrat (tétraméthyle-benzidine) 1 flacon (15 ml) de Solution d Arrêt (1M Acide Phosphorique) 2 Couvre-Plaques Adhésifs 5. Instructions de Stockage ELISA Kit Conserver les réactifs du kit entre 2 et 8 C à exception des contrôles. Stocker les contrôles lyophilisés à -20 C. Immédiatement après l'utilisation, les réactifs doivent être conservés au frais (2 à 8 C) et les contrôles à -20 C. Pour les dates de péremption du kit et des réactifs veuillez consulter les étiquettes. Le délai de péremption du kit ne peut être garanti que si les composants sont conservés correctement et si, en cas d'utilisation répétée d'un composant, le réactif n'a pas été contaminé lors d'une première utilisation. 6. Collecte des Echantillons et Instructions de Stockage Surnageants de culture cellulaire, sérum et plasma (EDTA, citrate, héparine) ont été testés avec ce kit. D autres échantillons biologiques sont applicables dans ce test. Séparer le sérum ou le plasma des coagulants ou érythrocytes dès que possible après coagulation ou séparation. Les échantillons contenant un précipité visible doivent être clarifiés avant leur emploi. Ne pas utiliser de spécimens hémolytiques ou lipémiques. Les échantillons doivent être aliquotés et doivent être conservés congelés à -20 C pour éviter la perte de IFN-α humain bioactif. Si les échantillons doivent être dosés dans les 24 heures, ils peuvent être conservés entre 2 et 8 C (pour la stabilité des échantillons se référer à 13.5). Éviter les cycles répétés de congélation / décongélation. Avant le test, l'échantillon congelé doit être amené lentement à température ambiante et mélangé doucement (27) 4/18

6 7. Materiel Requis Mais Non Fourni - Pipettes graduées de 5 ml et 10 ml - Micropipettes à monocanaux de 5 μl à 1000 μl ajustables avec embouts plastiques - Micropipettes à multicanaux de 50 μl à 300 μl ajustables avec embouts plastiques - Réservoir pour micropipettes à multicanaux - Bêcher, éprouvettes, verres de mesure nécessaires pour la préparation des réactifs - Appareil pour l ajout de solution de lavage (bouteille de lavage multicanaux ou système de lavage automatique) - Lecteur de barrettes de microplaque capable de lire à 450 nm (620 nm comme longueur d onde de référence) - Eau distillée ou désionisée dans un récipient en verre - Calculateur statistique avec programme pour réaliser l analyse de régression linéaire 8. Precautions d Emploi - Tout réactif doit être considéré comme potentiellement dangereux. Pour cela il est recommandé que ce produit ne soit utilisé que par des personnes ayant une qualification de laboratoire et qu il soit utilisé en suivant les codes de bonne conduite du laboratoire. Une tenue correspondante comme blouse de travail, lunettes protectrices et gants de travail doit être portée. Evitez tous contacts des réactifs avec la peau ou les yeux. En cas de contact, rincez immédiatement avec de l eau. Veuillez consulter tous les conseils spécifiques dans les fiches de donnés de sécurité et/ou les règles de sécurité. - Les réactifs sont réservés exclusivement au diagnostique et non pas au thérapeutique. - Evitez de mélanger et d échanger les réactifs de lots différents et de provenances différentes. - Evitez l utilisation des réactifs périmés (voir étiquette). - N exposez pas les réactifs à la lumière pendant le stockage ou l incubation. - Ne pas pipeter avec la bouche. - Ne pas manger ou fumer dans les zones de manipulation de réactifs et d échantillons. - Evitez le contact de la peau et des muqueuses avec les réactifs. - Pendant le travail avec les réactifs, utilisez des gants appropriés. - Evitez le contact de substrats avec des métaux/oxydant. - Evitez de gicler des liquides et la formation d aérosols. - A fin d éviter des contaminations avec microbes ou contaminations de réactifs et d échantillons qui pourraient rendre le test sans valeur, veuillez utiliser des pointes de pipettes jetables. - Utilisez des tubes appropriés pour dispenser le conjugué et le substrat. - Toute exposition aux acides inactive le conjugué. - Pour la préparation des réactifs, utilisez de l eau distillée ou désionisée. - La solution de substrat doit être amenée à température ambiante avant usage. - Décontaminez et éliminez les échantillons et tous matériaux contaminés comme s ils contenaient des germes de maladies infectieuses. La méthode préférée de décontamination est par l autoclave pour au moins une heure à C. - Traitez les déchets liquides non-acides tel que des déchets neutralisés par l hypochlorite de sodium (concentration finale d hypochlorite: 1.0 %). Après 30 minutes la décontamination effective est atteinte. Les déchets liquides contenant de l acide doivent être neutralisés avant la décontamination (27) 5/18

7 9. Préparation des Réactifs Amener les Tampons concentrés à température ambiante et les diluer avant de commencer le test. Si des cristaux se sont formés, chauffer doucement ces derniers jusqu'à fin de les dissoudre et d atteindre la dissolution totale des cristaux Tampon de Lavage (1x) Verser tout le contenu (50 ml) du concentré de Tampon de Lavage (20x) dans un cylindre gradué propre de 1000 ml. Remplir au volume final à 1000 ml avec de l'eau distillée ou désionisée dans un alambic en verre. Mélanger doucement pour éviter la formation de mousse. Transférer tout dans une bouteille de lavage et conserver à une température comprise entre 2 et 25 C. Noter que le Tampon de Lavage (1x) reste stable pendant 30 jours. Le Tampon de Lavage (1x) peut être préparé selon le tableau suivant: Nombre de Barrettes Tampon de Lavage Concentré (20x) (ml) Eau Distillée (ml) Tampon pour Essai (1x) Ajouter le contenu entier (5 ml) du Tampon pour Essai Concentré (20x) dans un cylindre gradué propre de 100 ml. Remplir au volume final de 100 ml avec d'eau distillée ou déionisée. Mélanger doucement pour éviter la formation de mousse. Stocker le tout entre 2 et 8 C. Noter que le Tampon pour Essai reste stable pendant 30 jours. Le Tampon pour Essai (1x) peut être préparé selon le tableau suivant: Nombre de Barrettes Tampon de Lavage Concentré (20x) (ml) Eau Distillée (ml) Préparation du Conjugué HRP Noter que le Conjugué HRP doit être utilisé dans les 30 minutes qui suivent la dilution. La solution de Conjugué HRP concentré doit être diluée au 1:100 avec le Tampon pour Essai (1x) juste avant l'utilisation dans un tube à essais en plastique propre. Le Conjugué HRP peut être préparé selon le tableau suivant : Nombre de Barrettes Conjugué HRP (ml) Tampon pour Essai (1x) (ml) Étalon IFN-α Humain Reconstituer Étalon IFN-α humain en ajoutant de l eau distillée. Le volume de reconstitution est indiqué sur l étiquette de flacon de l étalon. Agiter et mélanger avec précaution pour assurer une solubilisation homogène complète (concentration d étalon reconstitué = 1000 pg/ml). Laisser reconstituer l étalon pendant min. Bien mélanger avant de préparer les dilutions. Apres utilisation le surplus d étalon ne doit pas être gardé et doit être éliminé. Des dilutions d Étalon peuvent être préparées directement dans la microplaque (voir 10.c) ou alternativement dans des tubes (voir 9.4.1) (27) 6/18

8 Dilution Externe des Étalons Etiqueter les 7 tubes, un pour chaque point d étalon. S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7. Puis préparer séries de dilutions 1:2 pour la courbe d étalonnage de manière suivante: Pipeter 225 μl de Tampon pour Essai (1x) dans chaque tube. Pipeter 225 µl d étalon reconstitué (concentration = 1000 pg/ml) dans le premier tube marqué S1 et agiter (concentration d Étalon 1 = 500 pg/ml). Pipeter 225 µl de cette dilution dans le deuxième tube marqué S2, et mélanger soigneusement avant le transfer suivant. Répéter des séries de dilutions 5 fois pour créer les dilutions d étalon pour la courbe d étalonnage (voir Figure 5). Le Tampon pour Essai (1x) sert comme contrôle vide. Figure 5 Transférer 225 µl S1 S2 S3 S4 - S7 IFN-α humain Etalon Reconstitué Tampon pour Essai (1x) 225 µl Eliminer 225 µl 9.5. Contrôles Solubiliser en ajoutant 100 μl d eau distillée aux contrôles lyophilisés. Laisser reconstituer les contrôles pendant min. Agiter doucement jusqu à la dissolution complète et homogène. Traiter ensuite les contrôles comme les échantillons dans le test. Pour la gamme étalon référez au certificat d analyse ou l étiquette des flacons. Conserver les contrôles reconstitués aliquotés à 20 C. Eviter la congélation et le dégel répété (27) 7/18

9 10. Protocole de Test a. Déterminer le nombre de barrettes de micropuits nécessaires pour tester le nombre souhaité d'échantillons plus les barrettes nécessaires aux blancs et aux étalons. Chaque échantillon, étalon et blanc doit être testé en double. Retirer les barrettes de microtitration inutiles du support et les stocker à 2-8 C dans une pochette hermétiquement refermée, avec le dessiccatif fourni. b. Laver deux fois les barrettes de puits avec environ 400 μl de Tampon de Lavage pour chaque puits et en aspirant à fond le contenu des puits entre les lavages. Laisser le Tampon de Lavage dans les puits pendant secondes avant l aspiration. Veiller à ne pas rayer la surface des puits de microtitration. Après le dernier lavage, vider les barrettes de puits et les tapoter sur un tampon absorbant ou une serviette en papier pour éliminer l'excès de Tampon de Lavage. Utiliser les barrettes de micropuits immédiatement après le lavage ou les placer renversées sur un papier absorbant pendant 15 minutes au maximum. Ne pas laisser sécher les puits. c. Dilution d Étalon sur la plaque de microtitration (Comme alternative des dilutions d étalon peuvent être préparées dans des tubes voir 9.4.1): Ajouter en double 100 μl de Tampon pour Essai (1x) dans tous les puits d étalon. Pipeter en double 100 μl d étalon préparé (voir Préparation d Étalon 9.4, concentration = 1000 pg/ml), dans les puits A1 et A2 (voir le Tableau 1). Mélanger bien le contenu des puits A1 et A2 par aspiration et éjection répétée (concentration d étalon 1, S1 = 500 pg/ml), et transférer 100 μl dans les puits B1 et B2, respectivement. (voir Figure 6). Veiller à ne pas rayer la surface des puits de microtitration. Continuer la procédure 5 fois en préparant deux séries de dilutions d étalon IFN-α humain, de 500 a 7.8 pg/ml. Eliminer 100 μl du contenu des derniers puits (G1, G2) (27) 8/18

10 Figure 6 Transférer 100 µl S1 S2 S3 S4 - S7 IFN-α humain Etalon Reconstitué Tampon pour Essai (1x) 100 µl Eliminer 100 µl Dans le cas d une dilution externe d étalon (voir 9.4.1), pipeter 100 µl des dilutions d étalon (S1 - S7) dans les puits de façon montrée dans le Tableau 1. Tableau 1 Exemple d arrangement d'échantillons, d étalons et de blancs dans les barrettes de puits de microtitration A Étalon 1 (500.0 pg/ml) Étalon 1 (500.0 pg/ml) Échantillon 1 Échantillon 1 B Étalon 2 (250.0 pg/ml) Étalon 2 (250.0 pg/ml) Échantillon 2 Échantillon 2 C Étalon 3 (125.0 pg/ml) Étalon 3 (125.0 pg/ml) Échantillon 3 Échantillon 3 D Étalon 4 (62.5 pg/ml) Étalon 4 (62.5 pg/ml) Échantillon 4 Échantillon 4 E Étalon 5 (31.3 pg/ml) Étalon 5 (31.3 pg/ml) Échantillon 5 Échantillon 5 F Étalon 6 (15.6 pg/ml) Étalon 6 (15.6 pg/ml) Échantillon 6 Échantillon 6 G Étalon 7 (7.8 pg/ml) Étalon 7 (7.8 pg/ml) Échantillon 7 Échantillon 7 H Blanc Blanc Échantillon 8 Échantillon (27) 9/18

11 d. Ajouter 100 µl de Tampon pour Essai (1x) en double dans tous les puits de blanc. e. Ajouter 80 µl de Tampon pour Essai (1x) dans les puits d échantillon. f. Ajouter 20 μl de chaque échantillon, en double, dans les puits d échantillon. g. Préparer du Conjugué HRP (se reporter à la Préparation des Réactifs Conjugué HRP 9.3). h. Ajouter 50 μl de Conjugué HRP dans tous les puits. i. Recouvrir avec un couvre-plaque et incuber à température ambiante (entre 18 C et 25 C) pendant 2 heures, si possible sur un agitateur rotateur réglé à 400 tr/min. j. Retirer le couvre-plaque et vider les puits. Laver 3 fois les barrettes de puits de microtitration comme indiqué au point b de ce protocole. Utiliser les barrettes de micropuits immédiatement après le lavage. k. Pipeter 100 μl de Solution de Substrat TMB dans chaque puits. l. Incuber les puits de microtitration à température ambiante (entre 18 C et 25 C) pendant environ 10 minutes. Éviter toute exposition directe à une source de lumière intense. Le développement de couleur au niveau de la plaque doit être surveillé et la réaction du substrat stoppée (voir le point prochain) avant que les puits positifs ne soient plus correctement mesurables. La durée de l incubation pour le développement de couleur doit être déterminée pour chaque essai individuellement. Il est recommandé d ajouter la solution d arrêt quand une couleur bleu sombre se développe à la concentration la plus haute de la gamme étalon. Une autre alternative consiste à suivre le développement de la couleur par lecteur ELISA à 620 nm. La réaction du substrat doit être arrêtée dès que la DO atteint 0.9 à m. Arrêter la réaction enzymatique en pipetant rapidement 100 μl de Solution d'arrêt dans chaque puits. Il est important que la Solution d'arrêt soit répandue rapidement et uniformément dans les puits pour inactiver complètement l'enzyme. Les résultats doivent être lus immédiatement après l'ajout de la solution d'arrêt ou dans l'heure qui suit si les barrettes de microtitration sont conservées à l'obscurité entre 2 C et 8 C. n. Lire l'absorbance de chaque puits sur un spectrophotomètre avec 450 nm comme longueur d'onde primaire (éventuellement 620 nm comme longueur d'onde de référence; nm sont acceptables). Mesurer le blanc du lecteur de plaque conformément aux instructions du fabricant, en utilisant les puits de blanc. Déterminer l'absorbance des échantillons et des étalons. Note: Si la plaque n est pas agitée pendant l incubation, les valeurs de densité optique peuvent être inférieures à valeurs indiquées plus haut. Néanmoins ces valeurs sont valables (27) 10/18

12 11. CALCUL DES RESULTATS - Calculer les valeurs absorbance moyennes pour chaque étalon et échantillons dosés en double. Les doubles doivent se trouver dans les 20 pour cent de la moyenne. - Créer un courbe étalon en reportant la moyenne de l absorbance pour chaque concentration étalon en ordonnée, en fonction de leur concentration en l IFN-α humain sur l abscisse. Relier les points du graphe pour obtenir une belle courbe (un ajustement de courbe 5-paramètre est recommandé). - Pour déterminer la concentration du IFN-α humain de chaque échantillon, tracer une ligne horizontale à partir du point de l absorbance moyenne (sur l ordonnée) jusqu au courbe étalon. Tracer une ligne verticale à partir de l intersection pour lire la concentration en IFN-α humain correspondante. - Si les instructions de ce protocole ont été bien suivies, les échantillons ont été dilués au 1:5 (20 µl échantillon + 80 µl Tampon pour Essai (1x)), la concentration lue à partir de la courbe étalon doit donc être multipliée par le facteur de dilution (x 5). - Calcul des échantillons avec une concentration supérieure à l'étalon 1 peut entraîner des niveaux incorrects et faibles en IFN-α humain. Ces échantillons requièrent une prédilution extérieure supplémentaire selon les valeurs attendues en IFN-α humain avec le Tampon pour Essai (1x) afin de quantifier précisément les niveaux réels en IFN-α humain. - Nous recommandons de passer à chaque analyse un échantillon contrôle de concentration en IFN-α humain connue. Si les valeurs obtenues pour le contrôle ne sont pas dans le domaine de concentration attendu, les résultats du test peuvent être non valides. - Un courbe étalon représentatif est montré en figure 7. Cette courbe ne peut pas être utilisée pour lire les résultats des tests effectués au laboratoire. Il appartient à chaque laboratoire de préparer un courbe étalon pour chaque groupe de barrettes testées. Figure 7 Courbe étalon représentative pour l IFN-α humain ELISA. L IFN-α humain a été dilué en 2 séries le Tampon pour Essai (1x). Ne pas utiliser ce courbe étalon pour calculer les résultats des tests. Un courbe étalon doit être exécuté pour chaque groupe de barrettes dosées Interferon-alpha ELISA DO (450 nm) (pg/ml) (27) 11/18

13 Tableau 2 Données typiques utilisant l IFN-α humain ELISA Mesure de longueur d'onde: 450 nm Longueur d'onde de référence: 620 nm Étalon Concentration IFN-α humain (pg/ml) D.O. (450 nm) Blanc D.O. Moyenne (450 nm) C.V. (%) Les valeurs de DO du courbe étalon peuvent varier en fonction des conditions de performance du test (par exemple l'opérateur, pipetage, technique de lavage ou effets de la température). En outre la durée de conservation de la trousse peut altérer l'activité enzymatique et donc l'intensité des couleurs. Les valeurs mesurées sont toujours valables. 12. LIMITES Etablir un courbe étalon à chaque test puisque les conditions d analyses peuvent varier d une analyse à l autre. Une contamination bactérienne ou fongique des échantillons à analyser ou réactifs, ou une contamination croisée entre les réactifs peuvent causer des résultats erronés. Il est préférable d utiliser des embouts de pipettes, flacons et verrerie à usage unique. La verrerie réutilisable doit être lavée efficacement et bien rincée avant l emploi. Un lavage mal effectué ou insuffisant lors de la procédure provoque de faux résultats positifs ou négatifs. Bien égoutter les puits avant d ajouter la solution de lavage, les remplir avec le tampon de lavage comme indiqué pour chaque cycle de lavage et ne pas laisser les puits découverts ou sécher trop longtemps. L utilisation d immunothérapie a augmenté le nombre de patients avec des anticorps humains anti-souris IgG (HAMA) de façon significative. HAMA peuvent interférer avec les essais utilisant des anticorps murins monoclonaux, menant à de faux résultats à la fois positifs et négatifs. Les échantillons de sérum contenant des anticorps contres les immunoglobulines murins peuvent être tout de même analysées dans ces tests lorsque les immunoglobulines murines (sérum, fluide ascitique, ou anticorps de souris monoclonal de spécificité non importante) ont été ajoutées au diluant pour échantillons (27) 12/18

14 13. Performance du Test Sensibilité La limite de détection du test IFN-α humain, définie par la concentration de l analyte ayant une absorption significativement supérieure à l absorption du milieu de dilution (moyenne plus deux déviations standard) a été déterminée à 3.2 pg/ml (moyenne de 6 tests indépendants) Reproductibilité Intra-essai La reproductibilité intra-essai a été évaluée dans trois analyses différentes. Chaque essai a été mené avec 6 doubles de 8 échantillons sériques contenant différentes concentrations en IFN-α humain. Deux courbes étalon ont été tracées pour chaque microplaque. Les données ci-dessous montrent la concentration moyenne en IFN-α humain et le coefficient de variation pour chaque échantillon (voir tableau 3). Le coefficient de variation intra-essai calculé est de 4.0 %. Tableau 3 La concentration moyenne en IFN-α humain et le coefficient de variation pour chaque échantillon Échantillon Expérience Concentration Moyenne IFN-α humain (pg/ml) Coefficient de Variation (%) (27) 13/18

15 Inter-essai La reproductibilité inter-essai a été évaluée dans trois analyses indépendantes. Chaque essai a été mené avec 6 doubles de 8 échantillons sériques contenant différentes concentrations en IFN-α humain. Deux courbes étalon ont été tracées pour chaque microplaque. Les données ci-dessous montrent la concentration moyenne de IFN-α humain et le coefficient de variation calculé avec 18 déterminations pour chaque échantillon (voir tableau 4). Le coefficient de variation intra-essai calculé est de 7.2 %. Tableau 4 La concentration moyenne en IFN-α humain et le coefficient de variation pour chaque échantillon: Échantillon Concentration Moyenne Coefficient de IFN-α humain (pg/ml) Variation (%) Etudes de Récupération La récupération a été évaluée en dosant 4 niveaux d IFN-α humain dans les différents échantillons de sérum humain. Les récupérations ont été déterminées dans les 3 expériences indépendantes avec 6 répétitions chacune. La concentration en IFN-α humain dans le sérum non enrichi a été soustraite aux valeurs enrichies. Les récupérations ont été trouvées entre 85 % et 98 % avec une récupération moyenne totale de 92 % Parallélisme de Dilution Des échantillons de sérum à différentes concentrations en IFN-α humain ont été dilués en série avec 4 répétitions chacune. Les récupérations ont été trouvées entre 88 % et 123 % avec une récupération moyenne totale de 108 %. (voir tableau 5). Tableau 5 Échantillon Dilution 1:5 1:10 1:20 1:40 1:5 1:10 1:20 1:40 1:5 1:10 1:20 1:40 1:5 1:10 1:20 1:40 Concentration attendue d IFN-α humain (pg/ml) Concentration observée d IFN-α humain (pg/ml) Récupération de concentration attendue d IFN-α humain (%) (27) 14/18

16 13.5. Stabilité des Échantillons Stabilité Congélation - Décongélation Des aliquots de sérum (enrichis ou non) ont été stockés à -20 C, décongelés jusqu à 5 fois, et les taux en IFN-α humain ont été dosés. Il n y a pas eu de perte significative en IFN-α humain en congelant et décongelant Stabilité de Conservation Des aliquots d un échantillon sérique (enrichi ou non) ont été stockés à -20 C, 2-8 C, température ambiante (TA) et à 37 C, puis les taux en IFN-α humain ont été dosés après 24 h. Il n y a pas eu de perte significative en immunoréactivité IFN-α humain durant le stockage dans les conditions citées ci-dessus Spécificité Le test détecte de l'ifn-α humain non seulement le naturelle mais encore le recombinante. L interférence des facteurs circulant dans le système immun a été évaluée en enrichissant ces protéines à des concentrations physiologiques pertinentes dans un échantillon de sérum positive d IFN-α humain. Une réactivité croisée a été démontrée avec l'ifn-(ifn- ), l'ifn- 2, l'ifn- 2b et l'ifn- 2c humains de leucocytes naturels. Aucune réactivité croisée n a été observée avec les IFN- 1, IFN- (Fibroblaste IFN-), IFN-, IFN-, TNF, TNF, IL-2, IL-6, IL-8 et IL-10 humains Valeurs Attendues Un panel de 40 échantillons de sérum ainsi que de plasma EDTA, citrate et héparine choisis au hasard à partir de donneurs apparemment sains (hommes et femmes) a été testé en IFN-α humain. Les niveaux mesurés peuvent varier avec la collecte de l'échantillon utilisé. Les niveaux élevés de l'ifn-α humain dépendent du type de troubles immunologiques. Pour des niveaux de l'ifn-α humain détectés voir le tableau 6. Tableau 6 Echantillon Matrice Numéro d Echantillons Evalués Gamme (pg/ml) Moyenne (pg/ml) Déviation Standard (pg/ml) Sérum 40 nd* 0 -- Plasma (EDTA) 40 nd* Plasma (Citrate) 40 nd* 0 -- Plasma (Héparine) 40 nd* * n.d. = non détectable, échantillons mesurés en dessous du point étalon le plus bas sont considérés comme non détectables 14. INFORMATION DE COMMANDES Pour les commandes s'il vous plaît contacter: Voir la dernière page. Pour des renseignements techniques s'il vous plaît contacter: (27) 15/18

17 15. Résumé: Préparation des Réactifs Tampon de Lavage (1x) Ajouter le Tampon de Lavage Concentré 20 x (50 ml) à 950 ml d eau distillée. Nombre de Barrettes Tampon de Lavage Concentré (ml) Eau Distillée (ml) Tampon pour Essai (1x) Ajouter le Tampon pour Essai Concentré 20x (5 ml) à 95 ml d eau distillée. Nombre de Barrettes Tampon de pour Essai Concentré (ml) Eau Distillée (ml) Conjugué HRP Etablir une dilution du Conjugué HRP au 1:100 dans le Tampon pour Essai (1x) selon le tableau suivant: Nombre de Barrettes Conjugué HRP (ml) Tampon pour Essai (1x) (ml) Étalon IFN-α Humain Reconstituer l'étalon lyophilisé IFN-α humain avec de l'eau distillée. (Le volume de reconstitution est indiqué sur l'étiquette du flacon étalon.) Contrôles Ajouter 100 μl d eau distillée aux contrôles lyophilisés (27) 16/18

18 16. Résumé du Protocole de Test 1. Déterminer le nombre de barrettes nécessaires. 2. Laver les puits deux fois avec du Tampon de Lavage. 3. Dilution de l étalon dans la plaque: Ajouter 100 μl de Tampon pour Essai (1x) en double, dans les puits étalon. Pipeter 100 μl d étalon préparé dans les premiers puits et créer en transférant 100 μl de puits à puits. Jeter 100 μl des derniers puits. Alternativement dilution externe des étalons dans des tubes (voir 9.4.1): Pipeter 100 μl de ces dilutions étalons dans les puits de la microplaque. 4. Ajouter 100 μl de Tampon pour Essai (1x), en double, dans les puits blancs. 5. Ajouter 80 μl de Tampon pour Essai (1x) dans les puits d échantillon. 6. Ajouter 20 μl d échantillons en double dans les puits prévus. 7. Préparer le Conjugué HRP. 8. Ajouter 50 μl du Conjugué HRP dans tous les puits. 9. Couvrir les barrettes et incuber 2 heures à température ambiante (18-25 C). 10. Vider et laver les puits 3 fois avec du Tampon de Lavage. 11. Ajouter 100 μl de Solution Substrat TMB dans tous les puits. 12. Incuber les barrettes pour environ 10 minutes à température ambiante (18-25 C). 13. Ajouter 100 μl de Solution d Arrêt dans tous les puits. 14. Ajuster le lecteur avec les puits blanc et mesurer l intensité de couleur à 450 nm. Note: Si les instructions ont bien été suivies, les échantillons ont été dilués au 1:5 (20 μl échantillon + 80 μl Tampon pour Essai (1x)), la concentration lue sur le courbe étalon doit être multipliée par le facteur de dilution (x 5) (27) 17/18

19 17 Littérature de Référence sur le Produit 1. Adolf, G. R.. Antigenic structure of human interferon omega 1 (interferon alpha II1): comparison with other human interferons. J.Gen.Virol. 1987; 68 (Pt 6): Grau, G. E.; Roux-Lombard, P.; Gysler, C.; Lambert, C.; Lambert, P. H.; Dayer, J. M.; Guillevin, L.. Serum cytokine changes in systemic vasculitis. Immunology 1989; 68: Mazuran, R.; Ikic-Sutlic, M.; Jereb, B.; Stabuc, B.; Krasovec, M. U.; Cerar, O.; Soos, E.. Intrapleural application of natural IFN alpha in breast cancer patients with pleural carcinomatosis. Monitoring of immunotherapy by assaying serum interferon levels. J.Biol.Regul.Homeost.Agents 1992; 6: Pestka, S.; Langer, J. A.; Zoon, K. C.; Samuel, C. E.. Interferons and their actions. Annu.Rev.Biochem. 1987; 56: Henco, K.; Brosius, J.; Fujisawa, A.; Fujisawa, J. I.; Haynes, J. R.; Hochstadt, J.; Kovacic, T.; Pasek, M.; Schambock, A.; Schmid, J.;.. Structural relationship of human interferon alpha genes and pseudogenes. J.Mol Biol. 1985; 185: Chia, Y. W.; Carachi, R.; Armstrong, A. A.; McGarry, G. W.; Carrington, D.. Serum alpha interferon in children with right iliac fossa pain. J.R.Soc.Med. 1993; 86: Bernier, J.; Reuter, A.; Vrindts-Gevaert, Y.; Franchimont, P.. Radioimmunoassay of leukocyte (alpha) interferon and its application to some clinical conditions. J.Nucl.Med. 1984; 25: (27) 18/18

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