Notice d utilisation M Epigenomics AG, Berlin, Allemangne

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1 Notice d utilisation Avant d utiliser ce kit, veuillez lire attentivement la notice et suivre scrupuleusement les instructions afin de garantir la fiabilité et la pertinence des résultats des tests. IFU 0003FR, rév 6, tous droits réservés, octobre 2010, Epigenomics AG M Epigenomics AG, Berlin, Allemangne

2 Contenu 1. Informations importantes Usage prévu Explication de la procédure du test Principes technologiques fondamentaux Réactifs Instruments, consommables et réactifs nécessaires, mais non fournis Précautions Stockage et stabilité des réactifs Réactifs du test et leur préparation avant utilisation Protocole expérimental relatif au système de PCR LightCycler Préparation du PCR Master Mix pour le LightCycler Préparation des plaques pour le LightCycler Chargement des plaques dans le LightCycler Analyse et transfert des résultats de la PCR sur le LightCycler Protocole expérimental relatif au système de PCR rapide en temps réel Applied Biosystems 7500 Fast Préparation du PCR Master Mix pour le système de PCR rapide en temps réel Applied Biosystems 7500 Fast Préparation de la microplaque pour le système de PCR rapide en temps réel Applied Biosystems 7500 Fast Chargement de la microplaque dans le système de PCR rapide en temps réel Applied Biosystems 7500 Fast Analyse et transfert des résultats de la PCR sur le système de PCR rapide en temps réel Applied Biosystems 7500 Fast Marche à suivre pour le contrôle de qualité Contrôles externes Contrôles internes Interprétation des résultats Validité des préparations et des réalisations des essais Epi procolon Interprétation des résultats d une réaction PCR pour un échantillon Interprétation des résultats des échantillons des patients Limites du procédé Données de performance spécifiques Capacité de performance analytique Reproductibilité Performance clinique Concordance des deux protocoles expérimentaux Interférence Références bibliographiques Pour nous contacter...18 Page 2 sur 18

3 Notice d utilisation 1. Informations importantes Important: avant d utiliser le kit de PCR en temps réel Epi procolon, les utilisateurs doivent se familiariser avec les composants du kit et lire attentivement les instructions. Signification des symboles utilisés: Veuillez suivre les instructions Référence du Kit Destiné aux examens diagnostiques in-vitro Numéro de lot Date de péremption Fabricant Température de stockage Nombre de tests Page 3 sur 18

4 2. Usage prévu Le Kit de PCR en temps réel Epi procolon est un test PCR (réaction en chaîne par polymérase) in vitro servant à la détermination qualitative de la méthylation du gène SEPT9 ( m SEPT9) dans de l ADN converti au bisulfite provenant d échantillons de plasma EDTA humain. La présence de la m SEPT9 est associée à la présence d un adénocarcinome colorectal invasif et peut aider à diagnostiquer ce carcinome. 3. Explication de la procédure du test Le test de m SEPT9 est basé sur la mise en évidence d une méthylation anormale de l ADN de la région v2 du gène Septine 9. Dans un tissu colorectal cancéreux, les résidus de cytosine de la région v2 sont méthylés contrairement au tissu intestinal normal. Cette méthylation anormale peut être mise en évidence par une amplification spécifique de l ADN provenant des cellules tumorales passant dans le système sanguin. L identification de l ADN d un carcinome colorectal (CCR) à l aide de la méthylation du gène SEPT9 ( m SEPT9) a été démontrée dans plusieurs études indépendantes portant sur des patients souffrant de CCR et sur des groupes de contrôle ayant une coloscopie négative 1-4. Ce kit est basé sur une réaction en chaîne par polymérase en temps réel (PCR real-time) qui détermine qualitativement la méthylation du gène SEPT9 ( m SEPT9), à partir d ADN provenant d échantillons de plasma EDTA humain, converti au bisulfite et obtenu conformément aux instructions du Kit de préparation pour extraction d ADN de plasma Epi procolon (M ). Ce test PCR en temps réel est basé sur une PCR duplex, au cours de laquelle sont amplifiées en même temps l ADN cible de la m SEPT9 et l ADN de l ACTB (ß-actine), afin de réaliser un contrôle interne de l adéquation de l ADN extrait. Les résultats de l analyse PCR sur l ACTB sont indispensables à la validation des résultats obtenus. Le produit doit être utilisé avec des contrôles externes et internes. Il faut notamment utiliser les contrôles externes inclus dans le kit de contrôle de procédure Epi procolon (M ). Les échantillons de plasma doivent être traités uniquement au moyen du Kit de préparation pour extraction d ADN de plasma Epi procolon (M ), car ce kit a été explicitement validé pour être utilisé avec le kit de PCR en temps réel Epi procolon. 4. Principes technologiques fondamentaux Le principe de détection de la méthylation de l ADN du gène Septine 9 est composé de trois étapes; la première est le prélèvement du plasma à partir de sang total en utilisant les méthodes standard. La méthylation de l ADN se déroule principalement au niveau des dinucléotides CpG, un nucléotide de cytosine, suivi d un nucléotide de guanine. L ADN plasmatique est extrait en isolant l acide nucléique au moyen de particules magnétiques. L ADN extrait est ensuite modifié chimiquement au bisulfite de sodium afin de détecter la méthylation de l ADN. Au cours de ce traitement chimique, la cytosine non méthylée est transformée en uracile dans un dinucléotide CpG, alors que la cytosine méthylée reste inchangée. Ceci conduit à une substitution spécifique de chaque cytosine non méthylée. Les bloqueurs et les sondes de détection, qui sont utilisés lors d une PCR ultérieure, reconnaissent ces modifications de base et font la distinction entre les séquences méthylées et les non-méthylées. Avec le test Epi procolon, la méthylation des sites CpG de la région v2 du gène Septine 9 ( m SEPT9) et l ADN total d une région du gène ACTB sont mis en évidence dans une réaction PCR duplex. L analyse Page 4 sur 18

5 Notice d utilisation de m SEPT9 par PCR duplex utilise une paire d amorces, qui se fixe au niveau de deux régions exemptes de dinucléotide CpG. On y ajoute un bloqueur, qui reconnaît spécifiquement les séquences nonméthylées de cette région, converties au bisulfite et bloque leur amplification, de sorte que les séquences méthylées sont amplifiées en priorité. Enfin, afin de mettre en évidence les séquences méthylées, qui ont été amplifiées au cours de la PCR, on utilise une sonde fluorescente spécifique permettant de détecter la m SEPT9 lors de la réaction 5. Pour le kit de PCR en temps réel Epi procolon (M ), le matériel de départ est de l ADN converti au bisulfite issu d échantillons de plasma isolés. Pour chaque échantillon d ADN de patient converti au bisulfite, on procèdera à une réaction PCR duplex en double détermination. Conformément aux critères de ces instructions, les résultats des deux réactions PCR doivent être pris en compte afin de déterminer le résultat pour m SEPT9. 5. Réactifs Ce kit de test contient les réactifs nécessaires à l analyse de 24 échantillons de patients ou contrôles, (la PCR sera réalisée en double détermination, et donc 48 réactions PCR duplex seront réalisées). Epi procolon PCR Mix: 2 tubes de 700 µl chacun, prêts à l emploi; contenant une paire d amorces, un bloqueur et une sonde pour Septine 9; une paire d amorces et une sonde pour ACTB; des dntps, la solution tampon, du MgCl 2, de l eau. Epi procolon Polymerase: 1 tube de 59 µl prêt à l emploi; contenant la Taq Polymérase. Epi procolon AB 7500 Mix: 1 tube contenant 60 µl de solution de référence prête à l emploi (ROX) à utiliser avec le Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System. 6. Instruments, consommables et réactifs nécessaires, mais non fournis Eau pour la biologie moléculaire. Pointes à filtre pour pipettes: 0,5-10 µl, µl, µl. Gants à usage unique. Vortex (VWR International GmbH, N de référence: ), ou équivalent. Thermomixer comfort (N de référence: ) avec bloc chauffant pour séchage pour tube à réaction 2 ml (Eppendorf AG, N de référence: ), ou équivalent. Tubes PCR 2 ml Safe-Lock (par ex. Eppendorf AG, N de référence: ), ou équivalent. Centrifugeuse 5810 (Eppendorf AG) ou Centrifugeuse Sigma 4-15C (Qiagen) à utiliser avec des plaques pour PCR, ou équivalent. À l attention des utilisateurs du système de PCR en temps réel LightCycler 480 LightCycler système avec bloc chauffant (96 puits) (Roche Molecular Systems) avec logiciel version Plaque multi-puits 96 pour LightCycler 480 (Roche, N de référence: ). Film scellable pour LightCycler 480 (Roche, N de référence: ). Page 5 sur 18

6 À l attention des utilisateurs du Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, N de référence catalogue: ) avec le module logiciel SDS v1.4 21CFRp11 ou le logiciel 7500 v2.0 Microplaque optique à 96 puits MicroAmp rapide avec code-barres, 0,1 ml (Applied Biosystems, N de référence catalogue: ) Film adhésif optique à 96 et 384 puits MicroAmp (Applied Biosystems, N de référence catalogue: ) 7. Précautions Les composants du Kit de PCR en temps réel Epi procolon ne contiennent aucune substance dangereuse pour la santé. Toujours porter une blouse de laboratoire et des gants à usage unique. Pour le lavage des surfaces contaminées, utiliser de l eau. 8. Stockage et stabilité des réactifs -25 C -15 C Conserver l Epi procolon PCR Mix et l Epi procolon Polymerase à une température comprise entre -15 et -25 C. L Epi procolon PCR Mix peut être décongelé et re-congelé jusqu à trois fois. Conserver le mélange Epi procolon AB 7500 Mix à une température comprise entre -15 et -25 C. Après la première utilisation, le conserver à une température comprise entre 2 et 8 C pendant un maximum de 1 mois. Ne pas congeler/décongeler plusieurs fois. Ne pas utiliser les produits au-delà de la date de péremption. Ne pas mélanger les composants provenant de Kit de différents lots. 9. Réactifs du test et leur préparation avant utilisation A chaque fois, un Positive Control et un Negative Control (provenant de l Epi procolon kit de contrôle de procédure, M ) doivent être traités en même temps que les échantillons des patients. Les échantillons des patients ou les contrôles à analyser doivent être mesurés en double détermination. Ce qui signifie qu avec un kit de test, il est possible d analyser au maximum 22 échantillons de patients, ainsi qu un Epi procolon Positive control et un Epi procolon Negative control. Le Kit de PCR en temps réel Epi procolon a été conçu et validé pour une utilisation à partir d ADN provenant de plasma, sulfoné et converti au bisulfite, qui a été obtenu à l aide du kit de préparation pour extraction d ADN de plasma Epi procolon (M ). L ADN converti au bisulfite peut être conservé à une température comprise entre 2 et 8 C pendant un maximum de 24 heures ou à une température comprise entre - 15 et 20 C jusqu à 72 heures. Page 6 sur 18

7 Notice d utilisation 10. Protocole expérimental relatif au système de PCR LightCycler 480 Afin d obtenir des résultats corrects, chaque échantillon d ADN converti au bisulfite, sulfoné, (échantillons de patients ou Epi procolon Positive Control/Negative Control) doit être mesuré en double détermination Préparation du PCR Master Mix pour le LightCycler 480 Décongeler une quantité suffisante d Epi procolon PCR Mix pour le nombre voulu d échantillons de patients et de contrôles à analyser (voir tableau 1 pour les calculs avec 15 % de surplus pour simplifier le pipetage). Mélanger dans un tube de 2 ml, l Epi procolon PCR Mix et l Epi procolon Polymérase comme indiqué dans le tableau 1. Pour une seule PCR, il faudra 27,7 µl d Epi procolon PCR Mix et 1,1 µl d Epi procolon Polymérase. Remarque 1: Centrifuger rapidement le tube contenant l Epi procolon Polymérase avant son utilisation, afin de faire tomber les gouttelettes du couvercle. Remarque 2: Ne pas utiliser l Epi procolon AB 7500 Mix dans le protocole d utilisation avec le LightCycler 480. Tableau 1: Préparation du PCR Master Mix (MM) pour le LightCycler 480 Composants Epi procolon PCR Mix Epi procolon Polymerase Volumes pour 8 prép. d essais PCR (4 déterminations) Volumes pour 12 prép. d essais PCR (6 déterminations) Volumes pour 24 prép. d essais PCR (12 déterminations) Volumes pour 48 prép. d essais PCR (24 déterminations) 221,2 µl 331,7 µl 663,5 µl 1327,0 µl 8,8 µl 13,2 µl 26,5 µl 53,0 µl Préparation des plaques pour le LightCycler 480 Remarque: Veuillez respecter exactement l ordre spécifié, afin d éviter toute contamination croisée. 1. Pipetter 25 µl de PCR Master Mix (MM) dans chaque puit de la plaque multipuits 96 pour le LightCycler Ajouter 15 µl d ADN converti au bisulfite dans chaque puit de la plaque PCR. 3. Sceller les plaques avec un film optique adhésif. 4. Centrifuger brièvement la plaque dans la centrifugeuse à plaques (voir manuel d utilisaton de la centrifugeuse). Remarque: la plaque PCR préparée peut être ainsi conservée au réfrigérateur pendant 1 heure maximum à une température comprise entre 2 et 8 C Chargement des plaques dans le LightCycler Placer la plaque préparée dans le cadre (en mettant le côté aux coins obliques à l avant de l instrument). 2. Lancer la PCR sur l instrument LightCycler 480 avec le programme PCR suivant: Page 7 sur 18

8 Tableau 2: Programme PCR conseillé pour le LightCycler 480 Paramètres du programme Dénaturation Cycles Refroidissement LC 480* Mode analyse aucune Mode quantification aucun Cycles Segment Temperature [ C] Durée [hh:mm:ss] 00:30:00 00:00:10 00:00:05 00:00:30 00:00:30 Taux de chauffage [ C/s] Momodede mode de détection None None None Single None * Système LightCycler 480: Choisir «Dual Color Hydrolysis probe / UPL probe» comme format de détection, combinaison de filtres active nm et nm. Pour le LightCycler 480 II, activer la combinaison de filtres nm et nm Analyse et transfert des résultats de la PCR sur le LightCycler 480 Remarque: Les utilisateurs du LightCycler 480 I doivent sélectionner Color Compensation ON et charger le fichier approprié Epi procolon Color Compensation pour la PCR en temps réel Epi procolon. 1. Sélectionner Analysis du module du logiciel de base LightCycler 480 afin d ouvrir la fenêtre Analysis Overview. 2. Sélectionner Abs Quant/Fit Points pour tous les échantillons. 3. Sélectionner Epi procolon Color Compensation. 4. Activer le Filter Comb ( pour le LightCycler 480 II). 5. Régler le First Cycle sur 1 et le Last Cycle sur Regler le bruit de fond (cliquer sur le bouton bleu «Background») sur «2-21» en réglant «Min Offset» sur «1» et «Max Offset» sur «20» dans la fenêtre «Cycle Range». 7. Régler le seuil du bruit de fond sur Noise Band (fluorescent) sur 2.0 dans la fenêtre Noise Band. 8. Fixer la valeur limite Treshold (Manual) sur 2.0 dans la fenêtre Analysis. 9. Régler le nombre de Fit Points sur 2 dans la fenêtre Analysis 10. Appuyer sur Calculate. Le m SEPT9 Crossing Point ( CP ) est automatiquement calculé pour chaque échantillon et apparaît dans le tableau des résultats. Remarque: Si le bruit de fond est supérieur à 2,0, ou si les courbes d amplification restent en dessous de 2,0, régler le seuil de façon à ce qu il soit légèrement supérieur au bruit de fond pour assurer une lecture correcte. Les courbes d amplification sans hausse exponentielle significative doivent être considérées comme négatives. 11. Exporter les valeurs CP en cliquant sur le tableau des résultats en utilisant la touche droite de la souris. Sélectionner Export. Sauvegarder l enregistrement des données sous un nom unique et pertinent. Page 8 sur 18

9 Notice d utilisation 12. Activer le Filter Comb ( pour LightCycler 480 II). 13. Régler le First Cycle sur 1 et le Last Cycle sur Régler le bruit de fond (cliquer sur le bouton bleu «Background») sur «2-21» en réglant «Min Offset» sur «1» et «Max Offset» sur «20» dans la fenêtre «Cycle Range». 15. Régler le seuil du bruit de fond sur Noise Band (fluorescent) sur 2.0 dans la fenêtre Noise Band. 16. Fixer la valeur limite Treshold (Manual) sur 2.0 dans la fenêtre Analysis. 17. Régler le nombre de Fit Points sur 2 dans la fenêtre Analysis 18. Appuyer sur Calculate. Les valeurs CP du gène ACTB pour chaque échantillon sont automatiquement calculées et apparaissent dans le tableau des résultats. Remarque: Si le bruit de fond est supérieur à 2,0, ou si les courbes d amplification restent en dessous de 2,0, régler le seuil de façon à ce qu il soit légèrement supérieur au bruit de fond pour assurer une lecture correcte. Les courbes d amplification sans hausse exponentielle significative doivent être considérées comme négatives. 19. Exporter les valeurs CP en cliquant sur le tableau des résultats au moyen de la touche droite de la souris. Sélectionner Export. Sauvegarder l enregistrement des données sous un nom unique et pertinent. Page 9 sur 18

10 11. Protocole expérimental relatif au Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System 7 Pour obtenir des résultats corrects, chaque échantillon d ADN sulfoné converti au bisulfite (échantillon de patient ou Epi procolon Positive Control/Negative Control) doit être analysé en double détermination Préparation du PCR Master Mix pour le Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System Décongeler une quantité suffisante d Epi procolon PCR Mix pour le nombre souhaité d échantillons de patient et de contrôles à analyser (voir Tableau 3 pour les calculs avec 15 % de surplus pour simplifier le pipetage). Mélanger l Epi procolon PCR Mix, l Epi procolon AB 7500 Mix et l Epi procolon Polymérase dans un tube de 2 ml. Pour une seule PCR, il faut 26,8 µl d Epi procolon PCR Mix, 0,9 µl d Epi procolon AB 7500 Mix et 1,1 µl d Epi procolon Polymérase. Remarque: Avant utilisation, centrifuger la solution Polymérase Epi procolon pour éliminer les gouttes du couvercle. Tableau 3: Préparation du PCR Master Mix (MM) pour le Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System Composants Volume for 8 PCRs (4 determinations) Volume for 12 PCRs (6 determinations) Volume for 24 PCRs (12 determinations) Volume for 48 PCRs (24 determinations) Epi procolon PCR Mix Epi procolon Polymerase Epi procolon AB 7500 Mix µl µl µl µl 8.6 µl 12.8 µl 25.7 µl 51.3 µl 7.1 µl 10.7 µl 21.4 µl 42.8 µl Préparation de la microplaque pour le Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System Remarque: Veuillez respecter exactement l ordre spécifié, afin d éviter toute contamination croisée. 1. Pipetter 25 µl de PCR Master Mix (MM) dans chaque puit PCR de la microplaque optique rapide 96 puits MicroAmp. 2. Ajouter 15 µl d ADN converti au bisulfite dans chaque puit de la microplaque PCR. 3. Sceller la microplaque avec un film adhésif optique MicroAmp. 4. Centrifuger brièvement la microplaque à l aide d une centrifugeuse pour microplaque (voir notice d utilisaton de la centrifugeuse). Remarque: La microplaque PCR préparée peut être ainsi conservée au réfrigérateur à une température comprise entre 2 et 8 C pendant une heure maximum. Page 10 sur 18

11 Notice d utilisation Chargement de la microplaque dans le Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System 1. Placer la microplaque PCR préparée dans le cadre (la position A1 correspond au coin supérieur gauche). Vérifier que la microplaque est bien calée dans le cadre. 2. Démarrer la PCR sur le Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System à l aide du programme de cycle ci-dessous. Tableau 4: Programme de PCR recommandé sur le Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System Program Parameter Denaturation Cycling Cooling Stage Holding Cycling Holding Cycles Step Target [ C] Hold [hh:mm:ss] 00:27:00 00:00:05 00:00:30 00:00:10 00:00:05 Ramp rate [%] Detection mode none none Data Collection On none Utiliser ROX comme référence passive et régler le volume de réaction sur 30 µl Analyse et transfert des résultats de la PCR sur le Applied Biosystems 7500 Fast Real- Time PCR System Remarque: Applied Biosystems recommande d analyser une expérience PCR directement sur le système de PCR rapide en temps réel plutôt que sur un ordinateur externe afin d éviter les divergences des valeurs CT. 1. Pour les utilisateurs du module logiciel SDS v1.4 21CFRp11: Sélectionner «Results» puis «Amplification Plot» pour entrer le paramètre d analyse comme suit. Pour les utilisateurs du logiciel 7500 v2.0: Sélectionner «Analysis» dans le menu «Experiment», sélectionner l onglet «Analysis settings» pour entrer le paramètre d analyse comme suit. 1. Sélectionner «auto baseline» pour les deux «targets» (FAM et R6G). 2. Régler le seuil pour la «target» FAM sur 0,1. 3. Régler le seuil pour la «target» R6G sur 0,05. Remarque: Si le bruit de fond est supérieur au seuil, ou si les courbes d amplification restent en dessous du seuil, régler le seuil de façon à ce qu il soit légèrement supérieur au bruit de fond pour assurer une lecture correcte. Les courbes d amplification sans hausse exponentielle significative doivent être considérées comme négatives. 2. Pour les utilisateurs du module logiciel SDS v1.4 21CFRp11, cliquer sur «Analyze». Pour les utilisateurs du logiciel 7500 v2.0, cliquer sur «save changes» puis cliquer sur «Apply Analysis Setting». none Page 11 sur 18

12 Les valeurs de seuil de cycle m SEPT9 («CT») et les valeurs ACTB CT sont calculées automatiquement pour chaque échantillon. Enregistrer les valeurs CT dans un fichier sous un nom de fichier unique et pertinent. 12. Marche à suivre pour le contrôle de qualité Contrôles externes Le kit de contrôle de procédure Epi procolon (M ) contient le contrôle positif et négatif Epi procolon (Positive Control et Negative Control). Ces contrôles doivent être utilisés lors de chaque test afin de controler la bonne réalisation du test et de garantir la validité des résultats. Les contrôles positifs et négatifs Epi procolon (Positive Control et Negative Control) doivent se situer dans leurs limites de validité spécifiée (voir tableau 5a/b). Si un contrôle se situe en dehors de ses limites de validité, les résultats des tests afférents sont invalides et ne peuvent pas être pris en compte. Dans ce cas, tous les patients concernés par cet essai doivent être testé une nouvelle fois. Si les procédures de Contrôle-Qualité au sein de votre laboratoire exigent des vérifications plus fréquentes, veuillez respecter ces instructions Contrôles internes Le contrôle interne sert à mettre en évidence l ADN de l ACTB (ß-actine) et permet ainsi d évaluer l adéquation de l ADN pour chaque échantillon de patients. Ce contrôle vérifie la qualité de l échantillon, sa préparation et détermine si la concentration d ADN dans l échantillon est suffisante. La courbe d amplification pour la m SEPT9 quantifiée par PCR doit coïncider avec une valeur CP/CT, approprié au système PCR en temps réel, utilisé pour le gène ACTB déterminée par PCR (voir Tableau 6a/b). L utilisation d échantillons de plasma obtenus sans avoir respecté scrupuleuseument les instructions, peut entrainer des valeurs CP/CT faibles pour le gène ACTB quantifiée par PCR ce qui peut provoquer de faux positifs. Un résultat No curve pour la m SEPT9 quantifiée par PCR doit coïncider avec une valeur CP/CT, approprié au système PCR en temps réel, du gène ACTB déterminée pour donner un résultat valide (voir Tableau 6a/b). Des valeurs CP/CT très élevées pour le gène ACTB déterminées par PCR indique une très faible teneur en ADN ou une inhibition de la PCR. 13. Interprétation des résultats Validité des préparations et des réalisations des essais Epi procolon Chaque préparation ou réalisation d essai (doubles déterminations d un ou plusieurs échantillons de patient avec les contrôles Epi procolon correspondants sur une plaque) est considérée comme étant valide, si LES DEUX déterminations PCR pour les contrôles positifs et négatifs Epi procolon (Positive Control et Negative Control) répondent aux critères du tableau 5a pour le LightCycler 480 ou tableau 5b pour le Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System. Page 12 sur 18

13 Notice d utilisation Tableau 5a: LightCycler 480: Limites de validité pour les Positive Control et Negative Control Epi procolon. Les réalisations des tests ne sont valides que lorsque tous les critères sont respectés. Résultat des contrôles Détermination Resultat m SEPT9 1 Resultat ACTB 2 Positive Control Epi procolon valide Negative Control Epi procolon valide PCR 1 + courbe CP* < 31,1 PCR 2 + courbe CP* < 31,1 PCR 1 - courbe CP* < 35,2 PCR 2 - courbe CP* < 35,2 1 méthylation du gène septine 9 ; ADN 2ß-actine ; *Crossing Point (Seuil de cycle) Tableau 5b: Applied Biosystems 7500 Fast: Limites de validité du Applied Biosystems 7500 Fast Real- Time PCR System pour les Epi procolon Positive Control et Negative Control. Les réalisations des tests ne sont valides que lorsque tous les critères sont respectés. Résultat des contrôles Determination Resultat m SEPT9 1 Resultat ACTB 2 Positive Control Epi procolon valide Negative Control Epi procolon valide PCR 1 + courbe CT* < 30.6 PCR 2 + courbe CT* < 30.6 PCR 1 - courbe CT* < 34.7 PCR 2 - courbe CT* < méthylation du gène septine 9 ; ADN 2ß-actine ; *Cycle Threshold (Seuil de cycle) Page 13 sur 18

14 13.2. Interprétation des résultats d une réaction PCR pour un échantillon L interprétation d une détermination d une réaction PCR isolée se fait en se servant des critères du tableau 6a pour le LightCycler 480 ou tableau 6b pour le Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System. Tableau 6a: Interprétation des résultats pour une réaction PCR isolée sur le système LightCycler 480. Détermination de PCR isolée m SEPT9 1 ACTB 2 m SEPT9 par PCR valide positive m SEPT9 par PCR valide négative + Courbe CP* 24,3 - Courbe CP* 34,4 m SEPT9 par PCR non-valide - Courbe CP* > 34,4 m SEPT9 par PCR non-valide + Courbe CP* < 24,3 1 méthylation du gène septine 9; 2 ADN ß-actine; *Crossing Point (Seuil de cycle) Tableau 6b: Interprétation des résultats pour une PCR unique sur le Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System. Détermination de PCR isolée m SEPT9 1 ACTB 2 m SEPT9 par PCR valide positive + Courbe CT* 23.8 m SEPT9 par PCR valide négative - Courbe CT* 33.9 m SEPT9 par PCR non-valide - Courbe CT* > 33.9 m SEPT9 par PCR non-valide + Courbe CT* < méthylation du gène septine 9; 2 ADN ß-actine; *Cycle Threshold (Seuil de cycle) Page 14 sur 18

15 Notice d utilisation Interprétation des résultats des échantillons des patients Les résultats de test pour les échantillons d un patient sont interprétés de la manière suivante: PCR 1 PCR 2 PCR 1 PCR 2 PCR 1 PCR 2 PCR 1 PCR 2 PCR 1 PCR 2 PCR 1 PCR 2 PCR 1 PCR 2 Échantillon de patient m SEPT9 par PCR valide positive m SEPT9 par PCR valide positive Résultat quelconque m SEPT9 par PCR valide positive m SEPT9 par PCR valide positive Résultat quelconque m SEPT9 par PCR valide négative m SEPT9 par PCR valide négative Positive Control Negative Control Valide Valide Valide Valide Interprétation Échantillon patient m SEPT9 positif Échantillon patient m SEPT9 positif Échantillon patient m SEPT9 positif Échantillon patient m SEPT9 négatif m SEPT9 par PCR valide négative Valide Échantillon patient invalide m SEPT9 par PCR invalide m SEPT9 par PCR invalide m SEPT9 parpcr valide négative m SEPT9 par PCR invalide m SEPT9 par PCR invalide Valide Valide Échantillon patient invalide Échantillon patient invalide Remarque: seules les mesures m SEPT9 par PCR issues de réalisations ou de préparations d'essais valides doivent être prises en compte. 14. Limites du procédé Ce produit est validé pour être utilisé avec de l ADN converti au bisulfite, obtenu à partir d échantillons de plasma EDTA humain à l aide du kit de préparation pour extraction d ADN de plasma Epi procolon (M ). Ce produit doit être manipulé par du personnel expérimenté, maîtrisant les techniques de biologie moléculaire, et en particulier la PCR. Les recommenations générales portant sur l organisation et les procédures dans le laboratoire doivent être respectés pour éviter toute contamination Afin d éviter toute contamination entre les échantillons des patients, il est conseillé d utiliser des pipettes à usage unique et des pointes à usage unique pour pipettes. Page 15 sur 18

16 Des résultats de test positifs ont été recensés occasionnellement chez certains patients souffrant des maladies suivantes: cancer de la vessie, cancer des poumons, maladies inflammatoires chroniques intestinales, lupus érythémateux disséminé, insuffisance cardiaque chronique, maladies de l appareil respiratoire, polyarthrite rhumatoïde, polyarthrite nonrhumatoïde, infection du bassinet (pyélonéphrite), inflammation de la vésicule biliaire (cholécystite) Données de performance spécifiques Capacité de performance analytique La limite de détection a été déterminée en testant trois échantillons techniques différents. La matrice de ces échantillons techniques est constituée d ADN génomique dissous dans du tampon à une concentration de 10 ng/ml. Dans cette matrice, l on a ajouté deux concentrations différentes (8 pg/ml et 16 pg/ml) d ADN lyophilisé, détectable par la PCR pour m SEPT9. La matrice constitué seulement d ADN génomique, ainsi que les deux échantillons techniques ont été réalisés par trois assistant(e)s de laboratoire en suivant un protocole de NCCLS EP 17-A 8. L ADN converti au bisulfite a été obtenu au moyen des kits de préparation pour extraction d ADN de plasma Epi procolon (M ) provenant de différents lots et l ADN converti a été analysé avec les kits de PCR en temps réel Epi procolon provenant de différents lots sur les deux appareils en temps réel: le LightCycler 480, et le Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System. Toutes les mesures issues des essais répétés sur l ADN génomique de la matrice étaient toutes négatives pour m SEPT9, et plus de 95% des mesures issues des essais répétés sur chacun des échantillons techniques (matrice avec 8 pg/ml et 16 pg/ml d ADN lyophilisé) étaient positives pour m SEPT Reproductibilité La reproductibilité des résultats du test a été vérifiée par la répétition des essais sur quatre pools d échantillons issus de plasma EDTA humain. Deux de ces pools sont constitués de plasma EDTA humain de patients diagnostiqués avec un adénocarcinome colorectal invasif. Les deux autres pools utilisés comme control sont constitués de plasma EDTA humain d individus ne présentant pas de symptômes correspondants au cancer colorectal. Pour chaque pool de plasma de patients cancéreux, 9 expériences ont été réalisées. Pour chaque pool de contrôles, 18 expériences ont été réalisées. Les différentes expériences ont été réalisés par trois assistant(e)s de laboratoire en utilisant des kits de préparation Epi procolon pour extraction d ADN de plasma (M ) et des kits de PCR en temps réel Epi procolon provenant de différents lots de fabrication. Pour 51 des 54 déterminations, la quantification de la m SEPT9 correspondait au résultat attendu (pool cancer: m SEPT9 positive; pool contrôle: m SEPT9 négative) Performance clinique La performance clinique du test a été vérifiée au cours d une étude de cas-contrôle. Pour cela, des échantillons de plasma de patients, souffrant d adénocarcinome invasif histologiquement confirmé à des stades différents (stades I à IV), ont été éxaminés. Pour le groupe de contrôle, on a analysé des échantillons de plasma d individus, chez lesquels la coloscopie était négative et qui ne présentaient aucun symptôme de cette maladie. De l ADN converti au bisulfite a été obtenu à partir de chacun des 261 échantillons de plasma en utilisant des kits de préparation pour extraction d ADN de plasma Epi procolon (M ) et analysé en utilisant le kit de PCR en temps réel Epi procolon. En se basant Page 16 sur 18

17 Notice d utilisation sur les résultats des contrôles de procédure externes et internes, 257 des 261 échantillons de plasma analysés ont donné des résultats valides pour m SEPT9 (98,5 %). Parmi les 154 individus sans symptômes (contrôles cliniques), 135 ont un résultat qui s est révélé négatif pour m SEPT9. Ce résultat correspond à une spécificité clinique estimée à 88 % (95 % d intervalle de confiance [82 %; 92 %]). Parmi les 103 patients souffrant d adénocarcinome invasif (cas cliniques), 69 ont un résultat positif pour la m SEPT9. Ce résultat correspond à une sensibilité clinique estimée de 67 % (95 % d intervalle de confiance [57 %; 76 %]). Parmi les 66 patients souffrant d adénocarcinome au stade précoce (44 au stade I, 22 au stade II), 44 échantillons étaient positifs pour la m SEPT9. Le tableau suivant récapitule ces résultats. Contrôles cliniques Adénocarcinome (total) Adénocarcinome (stade précoce) Adénocarcinome (stade avancé) Résultats valides m SEPT9 positive m SEPT9 négative Concordance des deux protocoles expérimentaux Le test an été validé sur le LightCycler 480 et le Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System. La concordance des méthodes an été déterminée sur l ADN converti au bisulfite par une mesure parallèle sur les deux systèmes. Ces ADN ont été préparés à partir d échantillons provenant de 44 patients présentant un adénocarcinome colorectal invasif histologiquement confirmé, tous stades confondus, et 52 échantillons provenant de sujets sans maladie du côlon apparente, vérifié par coloscopie, utilisant le kit de préparation pour extraction d ADN de plasma Epi procolon (M ). Dans 93 % (89/96) des cas, les deux systèmes d analyse ont généré des résultats concordants pour msept Interférence Aucune interférence avec les résultats du test n a été observée, lorsque des concentrations élevées des substances suivantes ont été déterminées dans les échantillons de m SEPT9 positive ou de m SEPT9 négative: bilirubine (20 mg/dl), triglyzéride (1200 mg/dl), protéine (12 g/dl), érythrocytes (0,4 % v/v), hémoglobine (1 g/dl) ou de K 3 EDTA (20 mg/ml). Page 17 sur 18

18 16. Références bibliographiques 1. De Vos, T. et al. Circulating methylated SEPT9 ADN in Plasma is a Biomarker for Colorectal Cancer, Clinical Chemistry 55:7, (2009) 2. Lofton-Day, C. et al. ADN methylation biomarkers for blood-based colorectal cancer screening. Clinical Chemistry 54:2, (2008) 3. Gruetzmann, R. et al. Sensitive Detection of Colorectal Cancer in Peripheral Blood by Septin 9 ADN Methylation Assay. PLoS ONE, Volume 3, Issue 11, e3759 (2008) 4. Model, F. et al. Identification and validation of colorectal neoplasia-specific methylation markers for accurate classification of disease. Mol Cancer Res 5, (2007) 5. Cottrell, S. et al. A real-time PCR assay for ADN-methylation using methylation-specific blockers. Nucleic Acids Research, Vol. 32, No. 1 e10 (2004) 6. Brochure du système LightCycler PCR en temps réel et manuel d utilisation du LightCycler 480, Roche-Applied-Science 7. Guide d initiation aux Dosages avec/sans le système de PCR rapide en temps réel Applied Biosystems 7500/7500 et à l analyse Plus/Moins, Applied-Biosystems 8. NCCLS EP 17-A, Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation; approved guideline. 17. Pour nous contacter Le kit de PCR en temps réel Epi procolon est fabriqué par: Epigenomics AG, Kleine Präsidentenstrasse 1, Berlin, Allemagne Pour obtenir de plus amples informations et pour toute assistance, veuillez envoyer un courriel à: ou appelez-nous au numéro suivant : Informations pour le client En achetant ce produit, le client, conformément à certains brevets de Roche, obtient la permission, d utiliser celui-ci dans le domaine des diagnostics in-vitro chez les humains. Aucun brevet général ou autre licence de tout autre nature que ce droit spécifique d utilisation de l achat est accordée par les présentes. Le système LightCycler 480 est une marque déposée de l entreprise Hoffmann-La Roche Ltd. Applied Biosystems est une marque déposée de l entreprise Life Technologies Corporation. Page 18 sur 18

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