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1 altona DIAGNOSTICS altona DIAGNOSTICS RealStar CMV PCR Kit /2015 altona Diagnostics GmbH Mörkenstr Hamburg Germany phone fax always a drop ahead.

2 RealStar CMV PCR Kit 1.0 Pour utilisation avec Mx 3005P QPCR System (Stratagene) VERSANT kpcr Molecular System AD (Siemens) ABI Prism 7500 SDS and 7500 Fast SDS (Applied Biosystems) LightCycler 480 Instrument II (Roche) Rotor-Gene 3000/6000 (Corbett Research) Rotor-Gene Q5/6 plex Platform (QIAGEN) 0483 Usage en diagnostic in vitro N o de produit: réactions MAN FR-02 Conserver à -25 C C Avril 2015 altona Diagnostics GmbH Mörkenstraße 12 D Hamburg

3 Sommaire 1. Usage prévu Composants du kit Interprétation des résultats Analyse qualitative Analyse quantitative Conservation Matériel requis non fourni Informations générales Description du produit Mises en garde et précautions Mode d emploi Préparation de l échantillon Préparation du Mastermix Préparation de la réaction Evaluation des performances Sensibilité analytique Sensibilité analytique indépendante de la méthode d extraction Sensibilité analytique considérant une méthode d extraction... particulière Spécificité analytique Linéarité Précision Evaluation en diagnostic Répétabilité Limitations et précautions Contrôle qualité Programmation des instruments de PCR en temps réel Paramètres Marqueurs de fluorescence (fluorophores) Profil de température et aquisition du fluorophore Analyse des données Validité du test de diagnostic Test de diagnostic valide (qualitatif) Test de diagnostic invalide (qualitatif) Test de diagnostic valide (quantitatif) Test de diagnostic invalide (quantitatif) Assistance technique Marques commerciales et avis de non-responsabilité Explication des symboles...35 Notes

4 1. Usage prévu Le kit est un test de diagnostic in vitro, basé sur la technologie de PCR en temps réel, pour la détection et la quantification de l ADN spécifique du cytomegalovirus (CMV) dans le plasma humain. Il convient d éviter des cycles répétés de congélation-décongélation (plus de deux fois) car cela peut affecter les performances du test. Les réactifs doivent être congelés en aliquote en cas d utilisation occasionnelle. La conservation à +4 C ne doit pas excéder une période de deux heures. Le Master A et le Master B doivent être conservés à l abri de la lumière. 2. Composants du kit 4. Matériel requis non fourni Couleur du couvercle Bleu Violet Vert Rouge Blanc Composants Master A Master B Nombres de tubes Contrôle interne 1 Étalons 2 Eau ultra-pure Volume [µl/tube] contrôle interne (CI), internal control (IC) 2 Le kit contient quatre étalons (QS1-QS4) 3 pour biologie moléculaire, PCR grade water Instrument adapté à la PCR en temps réel (Chapitre 6: Description du produit) Système ou kit approprié à l extraction des acides nucléiques Centrifugeuse de paillasse avec rotor pour tubes réactionnels de 2 ml Centrifugeuse avec rotor pour microplaques, si sont utilisées des plaques de 96 puits de réaction Vortex Plaques de 96 puits ou tubes de réaction avec matériel de fermeture (optique) correspondant Pipettes (réglables) Cônes avec filtres (jetables) Gants non talqués (jetables) 3. Conservation Le kit est expédié sous glace carbonique. Les composants du kit doivent arriver congelés. Si un ou plusieurs composants ne sont pas congelés à la réception, ou si l un des tubes a été endommagé pendant le transport, merci de contacter altona Diagnostics GmbH pour assistance. Tous les composants doivent être conservés à -25 C C dès leur réception. NOTE Merci de vous assurer que les instruments ont été installés, calibrés, vérifiés et entretenus selon les instructions et les recommandations du fabricant. 6 7

5 5. Informations générales Le cytomégalovirus humain (CMV) est un membre de la famille des Herpesviridae et appartient à la sous famille des Betaherpesvirinae. Il est composé d une capside icosaédrique à double brin d ADN d environ 230 kpb, d un tégument et d une enveloppe externe. Le CMV est présent partout dans le monde et infecte les hommes à tout âge, sans suivre un modèle saisonnier ou épidémique. La séroprévalence du CMV augmente avec l âge dans toutes les populations et s échelonne de 40 à 100%. Comme pour les autres infections par les virus de l herpes, une infection primaire par le CMV se manifeste par des infections latentes ou persistantes. La réactivation du virus peut se produire suite à différents stimuli, en particulier en cas d immunodépression. La grande majorité des infections par le CMV sont asymptomatiques ou subcliniques mais les infections congénitales et les infections chez les patients immunodéprimés peuvent être symptomatiques et sérieuses. Chez les hôtes immunodéprimés, comme les patients greffés, ceux atteints par le VIH ou par un cancer, une infection par le CMV ou sa réactivation peut être fatale. 6. Description du produit Le kit, basé sur la technologie de PCR en temps réel, est un test de diagnostic in vitro conçu pour la détection et la quantification de l ADN spécifique du CMV. Le kit comprend un système d amplification hétérologue (contrôle interne, internal control (IC)) afin d identifier d éventuelles inhibitions de la PCR et de confirmer l intégrité des réactifs du kit. Le test repose sur la technologie de PCR en temps réel, utilisant une réaction d amplification en chaîne par polymérase (PCR) pour l amplification de séquences de cibles spécifiques ainsi que des sondes spécifiques à ces cibles pour la détection de l ADN amplifié. Les sondes sont marquées par un reporter fluorescent et un quencher. Les sondes spécifiques à l ADN du CMV sont marquées par le fluorophore FAM. La sonde spécifique au contrôle interne (IC) est marquée par le fluorophore JOE. L utilisation de sondes associées à des fluorophores différents permet la détection en parallèle de l ADN spécifique du CMV et du contrôle interne (IC) dans les canaux correspondants de l instrument de PCR en temps réel. Le test consiste en deux processus réalisés dans un même tube réactionnel: l amplification par PCR de l ADN cible et du contrôle interne (IC) la détection simultanée des amplicons par des sondes marquées par fluorescence Le kit a été développé et validé pour être utilisé avec les instruments de PCR en temps réel suivants: Mx 3005P QPCR System (Stratagene) VERSANT kpcr Molecular System AD (Siemens) ABI Prism 7500 SDS and 7500 Fast SDS (Applied Biosystems) LightCycler 480 Instrument II (Roche) Rotor-Gene 3000/6000 (Corbett Research) Rotor-Gene Q 5/6 plex Platform (QIAGEN) Le kit est composé de: Deux Masters (Master A et Master B) Un contrôle interne (IC) Quatre étalons (QS1 QS4) De l eau ultra-pure (pour biologie moléculaire) 8 9

6 Les réactifs du Master A et du Master B contiennent tous les composants nécessaires (tampon, enzymes, amorces et sondes) afin de réaliser en une seule étape l amplification par PCR et la détection spécifique de l ADN du CMV ainsi que le contrôle interne (IC). Les étalons contiennent des concentrations standardisées en ADN spécifique du CMV. Ces étalons ont été calibrés selon les standards internationaux de l OMS pour les techniques d amplification des acides nucléiques du CMV (code NIBSC: 09/162). Les étalons peuvent être utilisés soit individuellement comme contrôle positif soit tous ensembles pour la réalisation d une courbe d étalonnage afin de quantifier le virus CMV dans l échantillon. Les concentrations suivantes sont utilisées: 7. Mises en garde et précautions L utilisation de ce produit est limitée au personnel qualifié et formé aux techniques de PCR en temps réel et aux procédures de diagnostic in vitro. Manipuler les échantillons comme s ils étaient infectieux et/ou dangereux, en accord avec les procédures de sécurité en vigueur dans le laboratoire. Porter des gants jetables non talqués, une blouse de laboratoire et des lunettes de protection lors de la manipulation des échantillons. Eviter les contaminations microbiennes et nucléaires (par ADNase/ARNase) de l échantillon et des composants du kit. Toujours utiliser des pipettes à cônes jetables avec filtre, non contaminées par de l ADNase et de l ARNase. Toujours porter des gants de protection non talqués lors de la manipulation des composants du kit. Étalons QS1 QS2 QS3 QS4 Concentration [UI/µL] 1.00E E E E+01 Utiliser des zones de travail séparées les unes des autres pour les différentes activités de (i) préparation des échantillons, (ii) préparation de la réaction et (iii) les étapes d amplification/détection. Le sens de travail dans le laboratoire doit être unidirectionnel. Porter des gants dans chaque zone de travail et les changer avant d entrer dans une zone différente. Dédier des fournitures et du matériel pour chaque zone de travail et ne pas les déplacer d une zone à une autre. Conserver le matériel positif et/ou potentiellement positif séparément des autres composants du kit. Ne pas ouvrir les tubes/plaques de réaction après l amplification afin d éviter toute contamination par les amplicons. Des témoins additionnels peuvent devoir être testés selon les directives des organisations locales/gouvernementales ou des organismes d accréditation. Ne pas utiliser des composants au-delà de leur date d expiration. Eliminer les échantillons et les déchets de l essai conformément aux règles de sécurité

7 8. Mode d emploi 8.1 Préparation de l échantillon Pour toute information complémentaire ou assistance technique sur le prétraitement et la préparation des échantillons, merci de contacter notre support technique: L ADN extrait constitue l échantillon de départ pour le kit RealStar CMV PCR Kit 1.0. La qualité de l ADN extrait a un impact significatif sur les performances de l ensemble du test. Il est important de s assurer que le système d extraction des acides nucléiques utilisé est compatible avec la technologie de PCR en temps réel. Le kit d extraction des acides nucléiques suivant a été validé pour être utilisé avec le kit : QIAamp MinElute Virus Spin Kit (QIAGEN) Afin d augmenter la sensibilité du système, le protocole du kit QIAamp MinElute Virus Spin (QIAGEN) peut être modifié selon le tableau 3: Adaptation du protocole pour le kit QIAamp MinElute Virus Spin (QIAGEN) (page 24). téléphone: +49-(0) Préparation du Mastermix Tous les réactifs doivent être complètement décongelés, homogénéisés (par pipetage ou léger vortexage) et brièvement centrifugés avant utilisation. Le kit contient un contrôle interne (IC) hétérologue pouvant être utilisé soit comme contrôle d inhibition de la PCR soit comme contrôle de la préparation de l échantillon (extraction de l acide nucléique) et de l inhibition de la PCR. Si la préparation des échantillons s effectue sur une colonne comportant des tampons de lavage à l éthanol, une étape de centrifugation supplémentaire de 10 minutes à environ x g (~ tr/min), dans un nouveau tube à essai, est vivement recommandée avant l élution des acides nucléiques. NOTE Si le contrôle interne (IC) est utilisé comme contrôle d inhibition de la PCR, mais non comme contrôle de préparation de l échantillon, le Mastermix doit être préparé selon le schéma de pipetage suivant: Nombre de réactions 1 12 Master A 5 µl 60 µl L utilisation d ARN porteur (carrier) est crucial pour l efficacité de l extraction et la stabilité de l acide nucléique extrait. L éthanol est un fort inhibiteur de la PCR en temps réel. Si votre système de préparation des échantillons utilise des tampons de lavage à l éthanol, assurez vous d éliminer toute trace d éthanol avant de procéder à l élution de l acide nucléique. Master B 15 µl 180 µl Contrôle interne (IC) 1 µl 12 µl Volume de Mastermix 21 µl 252 µl 12 13

8 Si le contrôle interne (IC) est utilisé comme contrôle de préparation de l échantillon et d inhibition de la PCR, le contrôle interne (IC) doit être ajouté au moment de la procédure d extraction de l acide nucléique. Quelque soit la méthode ou le système utilisé pour l extraction de l acide nucléique, le contrôle interne (IC) ne doit jamais être ajouté directement à l échantillon. Il doit toujours être ajouté au mélange échantillon/tampon de lyse. Le volume du contrôle interne à ajouter dépend toujours et uniquement du volume d élution, dont il représente 10%. Par exemple si l acide nucléique doit être élué dans 60 µl de tampon d élution ou d eau, 6 µl du contrôle interne par échantillon doivent être ajoutés au mélange échantillon/tampon de lyse. NOTE Ne jamais ajouter le contrôle interne directement à l échantillon! 8.3 Préparation de la réaction Pipeter 20 µl de Mastermix dans chacun des puits nécessaires d une plaque 96 puits ou d un tube permettant les détections optiques. Ajouter 10 µl de l échantillon (éluat issu de l extraction des acides nucléiques) ou 10 µl des contrôles (étalons, contrôles positifs ou négatifs). Veiller à ce qu au moins un contrôle positif et un contrôle négatif soient utilisés par essai. Pour une analyse quantitative, tous les étalons (QS1 à QS4) doivent être utilisés. Homogénéiser avec soin les échantillons et les contrôles avec le Mastermix par pipettage. Couvrir la plaque de 96 puits avec un film adhésif transparent approprié et les tubes réactionnels à l aide des couvercles appropriés. Centrifuger les plaques de 96 puits à l aide d un rotor à microplaques pendant 30 secondes à environ 1000 x g (~ 3000 tr/min). Si le IC a été ajouté pendant la phase de préparation de l échantillon, le Mastermix doit être préparé selon le schéma de pipetage suivant: Nombre de réactions (rxns) 1 12 Préparation de la réaction Mastermix 20 µl Echantillon ou contrôle 10 µl Volume total 30 µl Master A 5 µl 60 µl Master B 15 µl 180 µl Volume de Mastermix 20 µl 240 µl 9. Programmation des instruments de PCR en temps réel Pour obtenir des informations générales sur la préparation et la programmation des différents instruments de PCR en temps réel, veuillez consulter les manuels d utilisation des instruments respectifs. Pour des instructions de programmation relative à l utilisation du kit avec un instrument de PCR en temps réel spécifique, merci de contacter notre support technique

9 9.1 Paramètres 10. Analyse des données Définir les paramètres suivants: Paramètres Volume de réaction 30 µl Pour des informations de base concernant l analyse des données sur un instrument de PCR en temps réel spécifique, merci de se référer au manuel concerné. Pour des informations détaillées concernant l analyse des données avec le kit sur différents instruments de PCR en temps réel, merci de contacter notre support technique. Taux de rampe Référence passive par défaut ROX 10.1 Validité du test de diagnostic 9.2 Marqueurs de fluorescence (fluorophores) Test de diagnostic valide (qualitatif) Définir les marqueurs de fluorescence (fluorophores): Détection Nom du marqueur Reporter Quencher ADN spécifique au CMV CMV FAM (aucun) Contrôle interne IC JOE (aucun) Pour qu un test de diagnostic qualitatif soit valide, les valeurs suivantes des contrôles doivent être obentues: Nom du contrôle Canal de détection FAM Canal de détection JOE Contrôle positif (QS) POSITIF POSITIF Contrôle négatif NEGATIF POSITIF 9.3 Profil de température et aquisition du fluorophore Définir le profil de température et l aquisition du fluorophore: Test de diagnostic invalide (qualitatif) Dénaturation Étape Nombre cycles Aquisition Temperature Durée Stationnaire C 10:00 min Amplification Cyclique C 0:15 min 58 C 1:00 min Un test de diagnostic qualtitatif est invalide, (i) si l essai n est pas complet ou (ii) si les différentes conditions de contrôle pour un test de diagnostic valide ne sont pas remplies. En cas d invalidité du test de diagnostic, répéter le test avec les acides nucléiques purifiés restants ou recommencer depuisc l échantillon de départ. 1 hold, 2 cycling 16 17

10 Test de diagnostic valide (quantitatif) 10.2 Interprétation des résultats Un test de diagnostic quantitatif est valide si toutes les conditions de validation des contrôles sont remplies (Chapitre : Test de diagnostic valide (qualitatif)). De plus, pour des résultats quantitatifs précis, il est nécessaire de s assurer de la validité de la courbe d étalonnage générée. Pour un test de diagnostic quantitatif valide, les paramètres de contrôles suivants doivent être obtenus: Analyse qualitative N de Canal de Canal de l échantillon détection FAM détection JOE Interprétation des résultats A POSITIF POSITIF* ADN spécifique au CMV détecté. Paramètres de contrôle Valeurs valides Pente / Efficacité de la PCR 85% / 115% R carré (R 2 ) > 0.98 B NEGATIF POSITIF C NEGATIF NEGATIF ADN spécifique au CMV non détecté. L échantillon ne contient pas de quantités détectables d ADN au CMV. Inhibition de la PCR ou défaillance des réactifs. Répéter le test à partir de l échantillon d origine ou bien prélever et tester un nouvel échantillon. NOTE Les différents instruments de PCR en temps réel n affichent pas tous les paramètres donnés par le logiciel. Pour des informations détaillées, merci de vous référer au manuel de votre instrument Test de diagnostic invalide (quantitatif) Un test de diagnostic quantitatif est invalide, (i) si l essai n est pas complet ou (ii) si les différentes conditions de contrôle pour un test de diagnostic valide ne sont pas remplies. * La détection du contrôle interne (IC) dans le canal de détection JOE n est pas requise pour des résultats positifs dans le canal de détection FAM. De hautes charges virales en CMV dans l échantillon peuvent conduire à des signaux absents ou très faibles pour le contrôle interne. Un résultat positif spécifique du CMV peut être attendu avec un taux supérieur à 95%, si l échantillon analysé contient au moins UI de CMV par ml d échantillon d origine (intervalle de confiance 95%: UI/mL). Ainsi que pour tout test de diagnostic, les résultats obtenus avec le kit RealStar CMV PCR Kit 1.0 doivent être interprétés en prenant en compte tous les symptômes cliniques et les résultats du laboratoire. En cas d invalidité du test de diagnostic, répéter le test avec les acides nucléiques purifiés restants ou recommencer depuis l échantillon de départ

11 Analyse quantitative NOTE Le kit fournit quatre étalons (QS). Afin de générer une courbe d étalonnage pour les analyses quantitatives, les QS doivent être définis comme des standards avec des concentrations appropriées (chapitre 6: description du produit). Pour l analyse quantitative, une courbe d étalonnage est générée à partir d étalons de concentration connue. C t = Cycle seuil C t = m log (N 0 ) + b m = Pente N o = Concentration initiale b = Ordonnée à l origine La concentration de l échantillon est affichée en UI/µL et se réfère à la concentration de l éluat. Afin de déterminer la charge virale de l échantillon d origine, la formule suivante doit être appliquée: Charge virale (échantillon) [UI/mL] = Volume (Eluat) [µl] x Charge virale (Eluat) [UI/µL] Volume d échantillon [ml] La concentration de l échantillon peut alors être déterminée comme suit: N 0 = 10 (Ct-b)/m 11. Evaluation des performances A B La performance analytique du kit a été évaluée à l aide de l ADN spécifique du CMV préalablement quantifié. Les étalons ont été calibrés en accord avec le 1 er standard international de l OMS concernant les techniques d amplification des acides nucléiques pour le CMV (code NIBSC: 09/162). Fluorescence Threshold Cycle Cycle Number Log Concentration Figure 1: (A) Etalons de quantification (en noir), un échantillon positif au CMV (en rouge) et un échantillon négatif (en bleu) affichés dans l écran d amplification; (B) analyse de la courbe d étalonnage 11.1 Sensibilité analytique La sensibilité analytique (ou limite de détection LoD) du kit RealStar CMV PCR Kit 1.0 est définie comme étant la concentration de molécules d ADN spécifique au virus CMV qui peuvent être détectées avec un taux supérieur à 95%. La sensibilité analytique peut être déterminée soit de manière indépendante de la méthode d extraction des acides nucléiques à partir d échantillons de concentration connue en ADN du CMV, soit en prenant en considération une méthode d extraction des acides nucléiques à partir d échantillons de plasma de concentration connue en ADN du CMV connue

12 Sensibilité analytique indépendante de la méthode d extraction Des dilutions en série de l ADN du CMV ont été réalisées de 1.21 UI/µL à nominal UI/µL et analysées en utilisant le kit en combinaison avec les instruments de PCR en temps réel suivants: Mx 3005P QPCR System (Stratagene) ABI Prism 7500 SDS and 7500 Fast SDS (Applied Biosystems) LightCycler 480 Instrument II (Roche) Rotor-Gene 3000/6000 (Corbett Research) / Rotor-Gene Q 5/6 plex Platform (QIAGEN) Les essais ont été réalisés sur deux jours différents, chacun avec huit réplicats par concentration à chaque fois. Les résultats ont été déterminés par analyse probit. Tableau 1: Résultats de PCR pour le calcul de la sensibilité analytique du kit RealStar CMV PCR Kit 1.0 sur l instrument Mx 3005PTM QPCR System (Stratagene) [C] initiale [UI/µL] Nombre de cycles Nb de résultats positifs Taux de succès [%] Tableau 2: Sensibilité analytique indépendante de la méthode d extraction des acides nucléiques avec le kit déterminée par analyse Probit sur les différents instruments de PCR en temps réel. Instrument LoD (p 0.05) Intervalle de confiance (IC: 95%) ABI Prism 7500 Fast SDS UI/µL UI/µL Rotor-Gene 6000/Q 5/6 plex UI/µL UI/µL LightCycler 480 Instrument II UI/µL UI/µL Mx 3005P TM QPCR System UI/µL UI/µL Sensibilité analytique considérant une méthode d extraction particulière La sensibilité analytique considérant une méthode particulière d extraction des acides nucléiques a été déterminée en utilisant des dilutions en série selon le 1 er standard international de l OMS pour les techniques d amplification des acides nucléiques pour le CMV (code NIBSC: 09/162), soit de 316 UI/mL à 0.03 UI/mL dans des plasmas EDTA négatifs au CMV. Sur deux jours, huits aliquots par concentration ont été soumis à l extraction de l acide nucléique, en utilisant le kit QIAamp MinElute Virus Spin (QIAGEN). Le protocole du kit QIAamp MinElute Virus Spin (QIAGEN) a été adapté comme décrit dans le tableau 3 (page 24) NTC

13 Tableau 3: Adapations du protocole pour le kit QIAamp MinElute Virus Spin (QIAGEN) Protocole Qiagen [µl] Adaptation [µl] Echantillon Protease Tampon de lyse (AL) Ethanol 1 (abs.) Tampon de lavage (AW1) Tampon de lavage (AW2) Ethanol 2 (abs.) ajouté au mix échantillon/tampon de lyse 2 3 ème étape de lavage Chaque éluat a été analysé en utilisant le kit en combinaison avec les instruments de PCR en temps réel suivants: Tableau 4: Les résultats de PCR utilisés pour le calcul de la sensibilité analytique considérant la méthode d extraction des acides nucléiques du kit en combinaison avec l instrument LightCycler 480 Instrument II (Roche): [C] initiale [UI/mL] Nombre de cycles Nb de résultats positifs Taux de succès [%] NTC Mx 3005P QPCR System (Stratagene) ABI Prism 7500 Fast SDS (Applied Biosystems) LightCycler 480 Instrument II (Roche) Rotor-Gene 6000 (Corbett Research) / Rotor-Gene Q 5/6 plex Platform (QIAGEN) Tableau 5: Sensibilité analytique considérant la méthode d extraction des acides nucléiques pour le kit déterminée par analyse Probit en combinaison avec les différents instruments de PCR en temps réel. Les résultats ont été déterminés par analyse Probit. Instrument LoD (p 0.05) Intervalle de confiance (I 95%) ABI Prism 7500 Fast SDS UI/mL UI/mL Rotor-Gene 6000/ Q 5/6 plex UI/mL UI/mL LightCycler 480 Instrument II UI/mL UI/mL Mx 3005P TM QPCR System UI/mL UI/mL 24 25

14 11.2 Spécificité analytique La spécificité analytique du kit est assurée par une sélection minutieuse des oligonucléotides (amorces et sondes). Les séquences de ces derniers ont été comparées aux séquences publiques disponibles afin de s assurer que toutes les souches intéressantes de CMV seront détectées. Plus d une centaine d échantillons de plasma négatifs au CMV ont été analysés avec le kit. Aucun n a présenté de signal positif spécifique au CMV, alors que tous ont montré un signal valide pour le IC. De plus, la spécificité du kit a été évaluée en testant un panel d ADN/ARN génomique extrait à partir d autres herpèsvirus ou d autres pathogènes importants chez des patients immunodéprimés. Tableau 6: Les organismes testés afin de démontrer la spécificité analytique du kit RealStar CMV PCR Kit 1.0 Organismes Canal FAM (CMV) Canal JOE (IC) Herpes simplex virus 1 Négatif Valide Herpes simplex virus 2 Négatif Valide Varicella-Zoster virus Négatif Valide Epstein-Barr virus Négatif Valide Human herpesvirus 6 A Négatif Valide Human herpesvirus 6 B Négatif Valide Human herpesvirus 7 Négatif Valide Human herpesvirus 8 Négatif Valide Parvovirus B19 Négatif Valide BK virus Négatif Valide JC virus Négatif Valide Simian virus 40 Négatif Valide Hepatitis A virus Négatif Valide Hepatitis B virus Négatif Valide Hepatitis C virus Négatif Valide Human immunodeficiency virus I Négatif Valide Le kit n a présenté aucune réaction croisée avec l un des organismes spécifiés ci-dessus

15 11.3 Linéarité La linéarité du kit a été évaluée par l analyse d une série de dilutions logarithmiques d ADN spécifique du CMV en utilisant des concentrations variants de 1.21 UI/µL à 1.21 x 10 9 UI/µL, avec les instruments de PCR en temps réel suivants: A Mx 3005P QPCR System (Stratagene) ABI Prism 7500 Fast SDS (Applied Biosystems) LightCycler 480 Instrument II (Roche) Rotor-Gene 6000 (Corbett Research) / Rotor-Gene Q 5/6 plex Platform (QIAGEN) Chaque concentration a été analysée en huit réplicats par instrument de PCR en temps réel. Result [UI/µL] B y = 1.035x R 2 = Result [UI/µL] C y = 1.023x R 2 = Log 10 Nominal CMV DNA Input Concentration [UI/µL] Log 10 Nominal CMV DNA Input Concentration [UI/µL] Result [UI/µL] D y = 1.028x R 2 = Result [UI/ µl] E y = 1.041x R 2 = Log 10 Nominal CMV DNA Input Concentration [UI/µL] Log 10 Nominal CMV DNA Input Concentration [UI/µL] Figure 2: Courbes d amplification sur ABI Prism 7500 Fast SDS (Applied Biosystems) [A] et de régression linéaire des dilutions en série sur ABI Prism 7500 Fast SDS (Applied Biosystems) [B], sur Mx 3005PTM QPCR System (Stratagene) [C], sur LightCycler Instrument 480 II (Roche) [D], et sur Rotor-Gene 6000 (Corbett Research) / Rotor-Gene Q 5/6 plex Platform (QIAGEN) [E]

16 11.4 Précision 11.5 Evaluation en diagnostic Les données de précision du kit ont été déterminées comme étant la variabilité intra-essai (variabilité au sein d une expérience), la variabilité inter-essai (variabilité entre différentes expériences) et la variabilité inter-lot (variabilité entre différents lots de production). La variabilité des données est exprimée en termes d écart type, de variance et de coefficient de variation. Les données sont basées sur l analyse quantitative d un contrôle positif fort (HPC: 121 UI/µL), sur la valeur du cycle seuil (C t ) d un contrôle positif faible (LPC: 1.8 UI/µL) et sur le contrôle interne (IC). Au moins huit réplicats par échantillon ont été analysés. Le kit a été évalué par une étude comparative avec un test de PCR en temps réel marqué CE de chez Abbott Diagnostics. 124 échantillons de plasma EDTA ont été évalués lors de tests de routine de dépistage du CMV. Le système d extraction des acides nucléiques utilisé est le m2000sp (Abbott Diagnostics). Les échantillons ont ensuite été analysés par le kit de détection du CMV par RT-PCR d Abbott Diagnostics, marqué CE, sur l instrument m2000rt (Abbott Diagnostics). Les éluats d ADN ont été conservés à -20 C puis réutilisés avec le kit sur l instrument m2000rt (Abbott Diagnostics). Tableau 7: Données de précision pour le kit en terme de coefficient de variation de la variance totale sur différents instruments de PCR en temps réel. Tableau 8: Resultats de l évaluation de la sensibilité et de la spécificité en diagnostic du kit. Instrument de PCR en temps réel Contrôle positif fort Variance totale / Coefficient de Variation (%) Contrôle positif faible Contrôle interne (IC) POSITIF NEGATIF ABI Prism 7500 Fast SDS LightCycler 480 Instrument II Rotor-Gene 6000 / Q 5/6 plex Mx 3005P TM QPCR System Abbott CMV PCR Kit POSITiF NEGATIF La sensibilité et la spécificité du kit comparée au kit de RT-PCR de détection du CMV d Abbott Diagnostic est de 99.04% et 100% respectivement

17 Log Results y = = 0.988x 0,988x R 2 = Log Log 10 Results 10 Results Abbott Abbott CMV CMV System System Figure 3: Corrélation des résultats de quantification du CMV entre le kit RealStar CMV PCR Kit 1.0 et le kit de PCR en temps réel d Abott. La corrélation est de R = Répétabilité La spécificité, la sensibilité et la précision du kit ont été évaluées à l aide de panel de compétence établis pour le CMV. Afin de s assurer de la répétabilité du kit, un panel de compétence ainsi que des échantillons cliniques caractérisés ont été analysés de manière régulière. 12. Limitations et précautions L utilisation de ces produits est limitée au personnel compétent et formé aux techniques de PCR en temps réel et aux procédures de diagnostic in vitro. Le respect des bonnes pratiques de laboratoire est essentiel pour garantir le bon fonctionnement de ce test. Une attention particulière doit être aportée à la préparation des échantillons afin de préserver la pureté des composants du kit. Tous les réactifs doivent faire l objet d une surveillance étroite afin d éviter impuretés et contaminations. Tout réactif suspect doit être éliminé. Il est nécessaire de respecter les procédures de prélèvement, de transport, de conservation et de traitement des échantillons afin d assurer les performances optimales du test. Ce test n est pas destiné à être réalisé directement sur l échantillon. Des méthodes appropriées d extraction des acides nucléiques doivent être employées avant son utilisation. La présence d inhibiteurs de PCR est susceptible d entraîner des résultats faussement négatifs ou erronés. De potentielles mutations dans les zones cibles du génome du virus couvertes par l amorce et/ou les sondes du test peuvent empêcher la détection de pathogènes. Le kit est un test de diagnostic. En conséquence, ses résultats doivent être interprétés en prenant en considération l ensemble des symptômes cliniques et des résultats obtenus en laboratoire

18 13. Contrôle qualité 16. Explication des symboles Conformément au système de management de la qualité d altona Diagnostics GmbH, certifié ISO EN 13485, chaque lot du est testé selon des spécifications prédéfinies afin de garantir une qualité constante des produits. 14. Assistance technique Pour obtenir une assistance sur nos produits, merci de contacter notre support technique: téléphone: +49-(0) Dispositif médical de diagnostic in vitro Référence produit Numéro de lot Contient suffisament pour réaliser n tests (rxns) Limites de température 15. Marques commerciales et avis de non-responsabilité RealStar (altona Diagnostics GmbH); Mx 3005P (Stratagene); ABI Prism (Applied Biosystems); HighPure, LightCycler (Roche); Rotor-Gene, QIAamp (QIA- GEN); VERSANT (Siemens). Version À utiliser avant le Les noms et marques déposés cités dans ce document, même si non mentionnés comme tels, ne doivent pas être considérés comme non protégés par la loi. Attention Le kit est un test de diagnostic in vitro, marqué CE conformément à la Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs de diagnostic in vitro. Produit distribué dans certains pays uniquement. Lire les instructions d utilisation Fabricant 2015 altona Diagnostics GmbH; tous droits réservés

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