Mise en évidence des agents infectieux par Biologie Moléculaire

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1 UE de l agent infectieux à l hôte Janvier 2012 Mise en évidence des agents infectieux par Biologie Moléculaire Dr Isabelle GARRIGUE Laboratoire de Virologie Professeur FLEURY isabelle.garrigue@chu-bordeaux.fr

2 Diagnostic indirect détection AC : sérologies Diagnostic direct traditionnel culture détection d antigènes microscopie Diagnostic direct moléculaire

3 moléculaire Echantillons pour le diagnostic écouvillons : plvts cutanéo-muqueux, orifices, sécrétions.. tube ou flacon stérile urines selles liquides céphalo-rachidien gastrique broncho-alvéolaire amniotique pleural biopsies.. sang sur tube EDTA ou tube sec (jamais d'héparine) sang total cellules plasma sérum EDTA : acide éthylène diamine tétra acétique

4 qualité du prélèvement transport rapide au laboratoire extraction des acides nucléiques totaux (ADN / ARN) = libérer les ac. nucléiques de leur environnement Méthode manuelle ou automatisée «extrait d acides nucléiques» ½ h à qq heures diagnostic moléculaire Détection / caractérisation des ac.nucléiques de l agent infectieux 1 h à 1-2 jours

5 Diagnostic moléculaire détecter ou caractériser le génome de l agent infectieux repose sur la capacité d une séquence monocaténaire d ac. nucléiques (ADN ou ARN) à se lier spécifiquement avec une séquence complémentaire. Hybridation : - en milieu liquide (ex : capture d hybrides) - avec amplification du signal d hybridation (ex : ADN branché) - sur membrane ou sur puce Amplification génique : PCR +++ polymerase chain reaction = réaction de polymérisation en chaîne Séquençage nucléotidique

6 Diagnostic moléculaire détecter ou caractériser le génome de l agent infectieux repose sur la capacité d une séquence monocaténaire d ac. nucléiques (ADN ou ARN) à se lier spécifiquement avec une séquence complémentaire. Hybridation : - en milieu liquide (ex : capture d hybrides) - avec amplification du signal d hybridation (ex de l ADN branché) - sur membrane ou sur puce Amplification génique : PCR +++ polymerase chain reaction = amplification en chaîne par polymérase Séquençage nucléotidique

7 Hybridation en milieu liquide Ex : papillomavirus (HPV) ADN viral Sonde ARN Digene

8 Hybridation principe: del ADNbranché :Ex virusde l hépatite B(VHB) Chiron / Bayer

9 Hybridation sur puces :Ex Virusdel immun humaineodéficience (VIH) RT

10 Diagnostic moléculaire détecter ou caractériser le génome de l agent infectieux repose sur la capacité d une séquence monocaténaire d ac. nucléiques (ADN ou ARN) à se lier spécifiquement avec une séquence complémentaire. Hybridation : - en milieu liquide - avec amplification du signal d hybridation (ex de l ADN branché) - sur membrane ou sur puce Amplification génique : PCR +++ polymerase chain reaction = amplification en chaîne par polymérase Séquençage nucléotidique

11 les nucléotides naturels chaîne d ac.nucléiques Base Base Ppi O Base 3 OH 3 OH R Pour réaliser une PCR : amplification enzymatique in vitro matrice ADN amorces : oligonucléotides complémentaires enzyme : Taq polymérase nucléotides synthétiques (dntp) MgCl 2+,

12 ADN Transcription inverse ARN PCR Etape 1 Amplification génomique 95 C Nucléotides C n cycles 72 C 2 n Amplicons D après B. Pozzetto et JM Huraux

13 PCR Etape 2 Détection des amplicons Analyse après la fin des cycles d amplification 2 n Amplicons Signal positif Lecture en point final Analyses «traditionnelles» Nombre de cycles d amplification

14 PCR en temps réel : la PCR 2 en 1! Amplification + détection simultanées Analysepe ndant les cycles d amplification Signal positif Lecture en phase exponentielle Nombre de cycles d amplification Amplification/détection de la cible simultanée et sans intervention humaine Détection de la fluorescence de sondes ou agents se liant à l ADN dble brin Système fermé : risque de contaminations Quantification possible Rapidité, sensibilité, automatisation

15 Un exemple de PCR en temps réel : la sonde Taqman amorce «Emetteur» «Suppresseur ou Absorbeur» Hybridation de la sonde doublement marquée intacte : la fluorescence émise par le reporter est absorbée par le quencher. Débutd élongation nucléotidique parl a Taq polymérase. Activité d 5-3 e la Taq polymérase. Hydrolyse de la sonde : la fluorescence n estpl us absorbée par le quencher. La fluorescence émise par le reporter est proportionnelle au nombre présentesciblesde dans l échantillon. D après

16 Polymerase Chain Reaction Limites Risques de contamination : organisation locaux sens de circulation des manipulateurs changement blouse/gants, Coût encore élevé Attention à l interprétation : détection du génome infection active en cours ex : viroses latentes, génomes intégrés Avantages Sensibilité +++ Automatisation Quantification possible selon techniques Rapidité

17 B. Pozzetto et JM Huraux

18 Diagnostic moléculaire détecter ou caractériser le génome de l agent infectieux repose sur la capacité d une séquence monocaténaire d ac. nucléiques (ADN ou ARN) à se lier spécifiquement avec une séquence complémentaire. Hybridation : - en milieu liquide - avec amplification du signal d hybridation (ex de l ADN branché) - sur membrane ou sur puce Amplification génique : PCR +++ polymerase chain reaction = amplification en chaîne par polymérase Séquençage nucléotidique

19 Séquençage nucléotidique selon SANGER Principe Déterminer une séquence ADN ou ARN : - effectuer la synthèse d un brin d ADNc de cette séquence - déterminer la séquence de ce brin d ADNc Technique de Sanger : technique enzymatique aux «didésoxynucléotides» ADNc = ADN complémentaire

20 Séquençage nucléotidique selon SANGER 1 ADN 3 ou 5 AMORCE Terminateurs de chaîne Chacun marqué par un fluorochrome différent

21 2 Taq A partir de l amorce, la Taq ajoute de façon aléatoire un déoxy- ou un didéoxynucléotide complémentaire de la séquence d ADN. La synthèse du nouveau brin s arrête dès l addition d un didéoxynucléotide.

22 3 Après 20 à 30 cycles, on obtient de multiples copies de fragments de toutes les longueurs possibles. Chacun se termine par un didéoxynucléotide.

23 4

24 Séquençage automatique

25 Indications des méthodes moléculaires établir le diagnostic d une infection détection d un agent pathogène dans un prélèvement infections aiguës ou chroniques urgence diagnostique intéressant si culture lente (résultat plus rapide par biologie moléculaire) quand culture difficile - laboratoire ne cultivant pas tous les agents - certains agents ne se cultivent pas (ex : VHC) - certains prélèvements se prêtent mal à la culture cellulaire (toxicité) suivi de patients infectés = suivi thérapeutique (résultats quantitatifs) séquençage : identifier les génotypes des virus ex : pronostic thérapeutique différent selon génotype VHC haut ou bas risque de cancer du col selon génotype HPV détecter des mutations nucléotidiques associées à la résistance aux traitements ex : VIH, VHB

26 Exemple : Infection par le VIH 1) Diagnostic de contact avec le virus : - sérologie + WB - confirmation sur 2ème prélèvement 2) Suivi du patient infecté en virologie : - charge VIH plasmatique ARN VIH quantitatif : PCR temps-réel - génotype de résistance le virus est-il résistant au traitement? séquençage des gènes cibles du traitement antiviral : transcriptase inverse, protéase, gp41, intégrase

27 Une petit idée des prix Recherche d Ag rotavirus dans les selles 6 euros PCR ADN CMV 52 euros PCR ARN VIH 60 euros Séquençage VIH 300 euros (recherche de mutations de résistance) Sérologie VIH 16 euros