De prochains outils pour le diagnostic des infections respiratoires communautaires?

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1 De prochains outils pour le diagnostic des infections respiratoires communautaires? Elyanne Gault Laboratoire de Bactériologie-Virologie Hôpital Ambroise Paré Université de Versailles St. Quentin en Yvelines UFR des Sciences de la Santé

2 Les voies respiratoires (vues par un virologue) pharynx nasopharynx oropharynx trachée Bronches souche bronches lobaires, segmentaires, sous-segmentaires (x12-15) 3000 bronchioles lobulaires parenchyme pulmonaire

3 VIRUS RESPIRATOIRES (communautaires) Famille Genre Exemple d espèce Génome env Orthomyxoviridæ Influenzavirus grippe ARN (-) seg oui Paramyxoviridæ (Pneumovirinae) Pneumovirus VRS, HMPV ARN (-) oui (Paramyxovirinæ) Paramyxovirus HPIV-1, -2, -3 et-4 ARN (-) oui Picornaviridæ Enterovirus entérovirus ARN (+) non Rhinovirus HRV ARN (+) non Paréchovirus paréchovirus ARN (+) non Coronaviridæ Coronavirus coronavirus ARN (+) oui Adenoviridæ Mastadénovirus adénovirus ADN non Polyomaviridæ Polyomavirus KIpyV ADN non WUpyV

4 VIRUS RESPIRATOIRES (autres) Herpesviridae HSV, VZV, CMV Paramyxoviridae Rougeole

5 Les infections respiratoires virales Réinfections Porte d entrée: VAS CoronaV Diffusion variable selon le terrain

6 Les infections respiratoires virales Rhino-pharyngite Bronchiolite, pneumopathie Diffusion de proche en proche: statut immunitaire / âge Quels agents infectieux rechercher?

7 Saisons au CHU de Caen Freymuth, Réanimation 2007

8 Saison à Ambroise Paré 760 échantillons (65% pédiatriques) 54% prélèvements positifs 60% 50% 40% 30% 20% 60% grippe A / 40% grippe B 10% 0 Grippes A+B VRS HMVP PIV-1 PIV-3 HMPV associé dans 25% des cas à un autre virus

9 Milieu hospitalier: autres virus? rhinov Fréquence+++ bronchiolites, pneumopathies, décompensations Conséquences pratiques du diagnostic?? adenov Pneumopathies sévères (immunodéprimé) CMV Pneumopathies sévères (immunodéprimé) Traitement anti-viral spécifique HSV, VZV Complications spécifiques (contexte) Traitement anti-viral spécifique rougeole Y penser Mesures prophylactiques

10 Et les bactéries? Streptococcus pneumoniae Mycoplasma pneumoniae Legionella pneumophila Chlamydophila pneumoniae Bordetella pertussis

11 Et les bactéries? Tests rapides Tests conventionnels Streptococcus pneumoniae Antigène urinaire peu spécifique Examen direct crachat peu sensible Culture 24h Hémoculture 24h Culture plusieurs jours Bordetella pertussis Legionella pneumophila Antigène urinaire Sensible et spécifique Examen direct crachat peu sensible Culture 24h

12 Approches diagnostiques: bactéries Mycoplasma pneumoniae Chlamydophila pneumoniae Sérologie Peu spécifique chez l adulte Délais (interprétation sur l augmentation des titres d Ac entre 2 sérums prélevés à 15j)

13 Approches diagnostiques: virus Techniques traditionnelles Isolement viral en culture cellulaire Technique de référence Influenza VRS PIV HMPV Adénovirus Coronavirus Rhinovirus Délais 5-10 jours

14 Approches diagnostiques: virus Techniques traditionnelles Recherche d Antigènes viraux par immunofluorescence Influenza VRS PIV HMPV Adénovirus

15 Immunofluorescence approche «multiplexe rapide» Anticorps monoclonaux Marqués à la fluorescéine flu A flu B PIV-1 PIV-2 PIV-3 VRS ADV HPMV Défaut de sensibilité

16 Tests rapides grippe A/B - VRS Recherche d Antigènes viraux par immunochromatographie Cible limitée Sensibilité (et spécificité) très médiocre surtout vis-à-vis de la grippe, surtout H1N1v

17 Biologie moléculaire: approche innovante? Ultra-sensibilité Multiplex Biologie moléculaire

18 Biologie moléculaire: approche innovante? Ultra-sensibilité Multiplex Biologie moléculaire Compliqué (techniquement) Coût

19 Biologie moléculaire: approche innovante? PCR «traditionnelle» simplex multiplex Belau-Pujol, 2005 Très long Peu de prélèvements gérables Interprétation délicate Risque de contaminations Complémentaire d approches traditionnelles

20 Biologie moléculaire: approche innovante? PCR «temps réel» simplex multiplex Grippe A (VIC) Papillard, 2011 Grippe B (NED) VRS (FAM)

21 Biologie moléculaire: approche innovante? PCR «temps réel» simplex multiplex PIV-1 (VIC) hmpv (NED) PIV-3 (FAM)

22 Biologie moléculaire: approche innovante? PCR «temps réel» simplex multiplex C. pneu (VIC) Alb (NED) M. pneu (FAM)

23 Biologie moléculaire: approche innovante? PCR «temps réel» simplex multiplex Grippe A (VIC) Papillard, 2011 Grippe B (NED) ½ journée 8 agents respiratoires majeurs VRS (FAM) 1 ère intention Pas adenov ni rhinov (ni pneumocoque) Technique «maison»

24 Biologie moléculaire: les techniques innovantes Les plus complètes Trousses commerciales PCR multiplex (15-20 agents détectés) analyse sur séquenceur automatique

25 Seeplex RV/PB18 ASE Detection / RespiFinder SMART Virus respiratoires 13 Virus respiratoires Influenza A virus Influenza B virus RSV A - RSV B rhinovirus coronavirus OC43-229E/NL63 adenovirus parainfluenza virus 1, 2, 3 bocavirus enterovirus 5 Bactéries Mycoplasma pneumoniae Haemophilus influenzae Streptococcus pneumoniae Chlamydophila pneumoniae Legionella pneumophila Influenza A virus Influenza A virus/h1n1v Influenza B virus RSV A - RSV B rhinovirus/enterovirus coronavirus OC43-229E-NL63- HKU1 metapneumovirus adenovirus parainfluenza virus 1, 2, 3,4 bocavirus 4 Bactéries Mycoplasma pneumoniae Streptococcus pneumoniae Chlamydophila pneumoniae Legionella pneumophila

26 Seeplex RV/PB18 ASE Detection / RespiFinder SMART 22 Extraction RT Hybridation-ligation Amplification marquage-détection 2 journées Risque de contamination Coût élevé (60 /test) accès à un séquenceur

27 Biologie moléculaire: les techniques innovantes Un peu plus simple (à peine) Trousses commerciales PCR multiplex (15-20 agents détectés) analyse par approche Luminex

28 Luminex xtag Respiratory Viral Panel (RVP) I. Multiplex PCR A multiplexed PCR reaction is performed to amplify the regions of interest in the target human or infectious agent genes. II. Exo/SAP treatment of PCR Product The PCR reaction is treated to remove excess nucleotides and primers. III. Multiplex ASPE/TSPE The PCR reaction is then subjected to a primer extension step that is specific for the allele or the infectious agent that is being analyzed: Allele Specific Primer Extension (ASPE) or Target Specific Primer Extension (TSPE). The 5 end of the ASPE or TSPE primers is attached to an xtag universal tag sequence. IV. Universal Array Sorting The 5 universal tag sequence is hybridized to the complementary anti-tag sequence coupled to a particular xmap bead set. Wash (Remove in Streamlined) V. Detection The hybridized beads are read by the Luminex xmap system and results are analyzed by the data analysis software.

29 Luminex xtag Respiratory Viral Panel (RVP)

30 Luminex xtag Respiratory Viral Panel (RVP) RSV A - RSV B Influenza A Non-specific influenza A H1 subtype H3 subtype H5 subtype Influenza B Parainfluenza 1, 2, 3, 4 Metapneumovirus Adenovirus Entero-Rhinovirus Corona NL63-HKU1-229E-OC43 SARS Bocavirus Pas de bactéries Extraction RT Hybridation-ligation Amplification marquage-détection 1 journée Risque de contamination Coût élevé (150$/test pour 24 tests) accès à un luminex

31 Film Array Respiratory Panel (Idaho)

32 Film Array Respiratory Panel (Idaho)

33 Film Array Respiratory Panel (Idaho) RSV Influenza A Non-specific influenza A Influenza H1 - H H3 Influenza B Parainfluenza 1, 2, 3, 4 Metapneumovirus Adenovirus Entero-Rhinovirus Corona NL63-HKU1 Pas de bactéries, pas de bocavirus, pas tous les corona 1 heure (dont 5 minutes de manips) mais test unitaire Pas de risque de contamination Coût élevé (130$/test) équipement dédié

34 Pourquoi tout ça? Conséquences (prise en charge) Terrain Pertinence du résultat microbiologique

35 Pédiatrie VRS Bronchiolites du nourrisson Risque de décompensation brutale Risque d apnée du sommeil influenza A et B Syndrome grippal tableaux atypiques (neurologiques, myocardites ) parainfluenza 1,2,3 metapneumovirus

36 Pédiatrie VRS Hospitalisation du tout-petit influenza A et B Tableau neurologique arrêt des investigations Virus Moins d examens complémentaires d antibiotiques diagnostic dans la journée

37 Réanimation influenza A et B VRS parainfluenza 1,2,3 metapneumovirus Syndrome grippal, surinfections Décompensations BPCO Grippe adenovirus rougeole Virus Pneumopathies sévères Moins d examens complémentaires d antibiotiques (+ PCT)

38 Milieu hospitalier Services de pédiatrie Services de médecine - Réanimation influenza A et B rougeole Infections nosocomiales Mesures d isolement Traitement prophylactique

39 Le terrain Pédiatrie En urgence VRS / grippes Rapidement Mycoplasme Coqueluche Tous virus respiratoires

40 Le terrain Réanimation (adulte) En urgence Grippes Rougeole Pneumocoque Legionnelle Rapidement Adenovirus Tous virus respi

41 Le terrain Immunodéprimé En urgence VRS/Grippes Rougeole Adenovirus Rapidement Tous virus respi Toutes bactéries

42 Pertinence du résultat microbiologique Pertinence d un résultat négatif Pertinence d un résultat positif

43 Pertinence d un résultat négatif Sensibilité des moyens diagnostiques Test rapide < Immunofluorescence < Biologie moléculaire Biologie moléculaire Evaluation des tests? Multiplex < simplex Tests maison/trousses commerciales

44 Pertinence d un résultat négatif Nature / Qualité du prélèvement Pédiatrie Adulte Aspiration nasopharyngée Ecouvillonnage des fosses nasales

45 Ecouvillonnage des fosses nasales Prélèvement Écouvillon stérile Ajouter 1ml de sérum physiologique Virocult

46 Pertinence d un résultat négatif Nature / Qualité du prélèvement Pédiatrie Adulte Aspiration nasopharyngée Ecouvillonnage des fosses nasales Formes sévères Aspiration bronchique LBA (négatif au niveau des fosses nasales)

47 Pertinence d un résultat positif 17 Virus respiratoires Influenza A virus Influenza A virus/h1n1v Influenza B virus RSV A - RSV B rhinovirus/enterovirus coronavirus OC43-229E-NL63- HKU1 metapneumovirus adenovirus parainfluenza virus 1, 2, 3,4 bocavirus Résultats inattendus Coronavirus et alors? 4 Bactéries Mycoplasma pneumoniae Streptococcus pneumoniae Chlamydophila pneumoniae Legionella pneumophila Infections multiples virus-virus ou virus/bactérie

48 Et la sérologie?

49 Et la sérologie? Prévalence des Ac dans la population CoronaV M. pneu

50 Sérologie : nouvelles approches Méthodes actuelles (pour les virus respiratoires) Antigènes viraux produits par culture virale ELISA/microplaques: détection d IgG (IgM) réactions de fixation du complément réactions d inhibition de l hemagglutination Ciblage spécifique des antigènes viraux et bactériens Identification et production de protéines / domaines peptidiques antigéniques Profil de réponse anticorps Primo-Infection / réinfection Infection ancienne / infection récente Criblage multiplex des antigènes viraux et bactériens Les «puces sérologiques» - Technologie luminex

51 Puces sérologiques Infections prothèses articulaires S. aureus, S. epidermidis, P. acnes Infections respiratoires S. pneumoniae, L. pneumophila, M. pneumoniae, C. pneumoniae, B. pertussis Infections génitales hautes C. trachomatis, mycoplasmes uro-génitaux Infections materno-néonatales streptocoque B, E. coli Diagnostic par syndrome Exemples en développement

52 De prochains outils pour le diagnostic des infections respiratoires communautaires? Concept Diagnostic «microbiologique» Recherche au «coup par coup» de bactéries et/ou de virus Concept Diagnostic «de pathologie infectieuse respiratoire» Prélèvement Prélèvement respiratoire Biologie moléculaire Prélèvement sanguin Sérologie Approche multiplex Recherche d agents infectieux

53 De prochains outils pour le diagnostic des infections respiratoires communautaires? Approche multiplex Recherche d agents infectieux