- 1 - Cytokines et chimiokines Marc Humbert, Gilles Garcia

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1 - 1 - Cytokines et chimiokines Marc Humbert, Gilles Garcia Service de Pneumologie et Réanimation Respiratoire, Hôpital Antoine-Béclère, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, Université Paris-Sud, 157, rue de la Porte de Trivaux, Clamart, France. * Correspondance: Marc Humbert, Service de Pneumologie et Réanimation Respiratoire, Hôpital Antoine-Béclère, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, Université Paris-Sud, 157 rue de la Porte de Trivaux, Clamart, France. Tel : Fax : humbert@ipsc.u-psud.fr

2 - 2 - Introduction Sous le terme générique de cytokines est regroupée une vaste famille de protéines qui médient et régulent les communications entre cellules (105). Les cytokines sont impliquées dans la croissance et la différenciation cellulaire, la réparation tissulaire, l inflammation et l immunité. Produites lors de la réponse inflammatoire, certaines cytokines sont essentielles à l orientation et au maintien d un phénotype de type allergique. Il s agit en particulier des cytokines régulant la production d immunoglobulines E (IgE) [interleukine (IL)-4 et IL 13)], des cytokines permettant le recrutement éosinophile caractéristique de la phase retardée de la réponse allergique [cytokines actives sur l éosinophile [IL-5, granulocyte-monocyte colony stimulating factor (GM-CSF) et IL-3] et chimiokines (éotaxine, regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted (RANTES), monocyte chimiotactic protein 3 (MCP-3 )] et des cytokines pro-inflammatoires au premier rang desquelles le tumor necrosis factor alpha (TNF-). Par ailleurs certaines ont pour objet le contrôle de la réponse allergique [IL-10, transforming growth factor beta (TGF-), interféron- ] Nous nous attacherons à étudier dans ce chapitre les principales cytokines et chimiokines impliquées dans la réponse inflammatoire allergique et l asthme (19,53,54). Données générales Les cytokines présentent un certain nombre de caractéristiques communes. Ce sont des protéines de faible poids moléculaire (de 6 à 60 kda), sécrétées et le plus souvent glycosylées (105). Leur production est inductible et transitoire : courte période de transcription, demi-vie brève, sécrétion rapide sous forme d'un pic. Leur production est le plus souvent locale et la libération des cytokines se fait souvent au contact de la cellule cible au sein d'une pseudosynapse. Il en résulte que le mode d'action des cytokines est avant tout local (effet paracrine) ou sur la cellule productrice elle-même (effet autocrine). Dans certaines circonstances, les cytokines agissent sur le mode endocrine, par libération dans le courant sanguin et interaction avec leur récepteurs spécifiques exprimés à la surface de divers types cellulaires. Les récepteurs des cytokines présentent certaines particularités (105). Outre les homologies structurales entre les récepteurs de plusieurs cytokines, on a observé que nombre d'entre eux étaient constitués de deux chaînes, l'une assurant la liaison à la cytokine et l'autre transduisant le signal à la cellule cible. Cette dernière peut être associée à des récepteurs liant différentes cytokines d'où l'effet redondant de ces médiateurs. Les récepteurs des cytokines sont généralement de très haute affinité (Kd= 10-9 à ) et faiblement exprimés. L'occupation d'un petit nombre de ces récepteurs est suffisante à l'activation de la cellule cible. Une cytokine peut donc délivrer son message à de très faibles concentrations de l'ordre de la picomole. Il est notable qu'une même cytokine peut exercer de nombreux effets, les récepteurs pour une cytokine étant exprimés en général par de nombreux types cellulaires (effet pléiotrope) et qu'une partie des fonctions d'une cytokine est en général partagée par d'autres (effet redondant). Le réseau des cytokines constitue un système interactif dont les acteurs sont capables d'interagir entre eux en modulant mutuellement leurs effets (effets synergiques ou antagonistes), et en induisant (ou en inhibant) leur expression ou celles de leurs récepteurs (système d'amplification en cascade ou de rétrocontrôle). Ainsi, les cytokines forment un vaste réseau de molécules aux effets pléiotropes et redondants, qui interagissent entre elles pour induire ou inhiber leur production et moduler leurs effets, et jouent un rôle clé dans l'établissement et la régulation de la réponse immunitaire (105). La famille des cytokines comporte aujourd'hui plusieurs centaines de molécules incluant les interleukines (ce terme fut défini en 1979 pour désigner des molécules permettant la communication entre les leucocytes), les interférons (désignés sous ce terme du fait de leur capacité d action antivirale sur des cellules infectées : phénomène «d interférence» virale), les "colony stimulating factors" (facteurs de croissance hématopoïétiques), et divers immunomodulateurs ou facteurs de croissance [TNF-, TGF-, platelet-derived growth factor (PDGF)...] (105). Les chimiokines ou cytokines chimiotactiques sont un groupe de cytokines de petit poids moléculaire (8-10kD) qui ont la faculté d activer et de promouvoir la migration de leucocytes au sein des tissus (122).

3 - 3 - Au delà de leur rôle proinflammatoire, de nombreuses chimiokines sont nécessaires aux mouvements cellulaires physiologiques, en l absence de toute stimulation inflammatoire (75). De nombreux résultats cliniques et expérimentaux ont souligné l'importance du réseau des chimiokines dans la réponse inflammatoire allergique. Il s agit en particulier des chimiokines pouvant lier le récepteur CCR3 (ou récepteur de l éotaxine), essentiel à la migration du polynucléaire éosinophile, acteur majeur de l allergie (66). Cytokines Th1 et Th2 Le système immunitaire a pour fonction de préserver l intégrité de l individu face à son milieu environnant (bactéries, parasites) ou certains désordres internes (développement de cancers). Les grandes caractéristiques de ces réponses sont la spécificité et la mémoire du système immunitaire visà-vis des composants (appelés antigènes) des intrus reconnus. Cette spécificité est rendue possible par l existence de cellules orchestrant toute réponse spécifique, les lymphocytes T, qui disposent d un récepteur membranaire pour l antigène (Tcr, T cell receptor). Cette activation par le biais du Tcr impose la collaboration de cellules présentatrices qui exposent à leur surface des fragments de petite taille (peptides) obtenus après digestion des volumineux antigènes. Les lymphocytes T auxiliaires (Th en anglais pour T helper) constituent un sous-groupe de lymphocytes qui doivent leur nom à leur faculté de production de cytokines qui vont orienter la réponse inflammatoire. La réponse immunitaire, lorsqu elle se déclenche, doit rester parfaitement maîtrisée. En particulier, elle doit être suffisante pour éliminer l intrus, mais pas trop vigoureuse afin de ne pas léser l individu. Dans certaines circonstances, la réponse immunitaire est trop importante. Par exemple, les maladies allergiques correspondent à une hypersensibilité immédiate dirigée contre des antigènes particuliers, les allergènes. Cette hypersensibilité est liée à la production d IgE (qui vont sensibiliser les mastocytes et les polynucléaires basophiles qui portent un récepteur de haute affinité des IgE) et à l activation et l accumulation des polynucléaires éosinophiles (contenant des protéines basiques agressives pour les tissus) (53,54). Ces caractéristiques originales de la réponse inflammatoire allergique sont directement liées au profil particulier de production de cytokines des lymphocytes T spécifiques des allergènes : richesse en IL-4 et IL-13 (qui transmettent l information indispensable à la production d IgE par les plasmocytes) et en IL-5 (qui participe à l activation des polynucléaires éosinophiles). Les lymphocytes T auxiliaires produisant des cytokines favorables aux hypersensibilités immédiates sont appelés lymphocytes Th2 (T helper lymphocyte type 2) (Tableau I et Figure 1) (53,54). Ces lymphocytes jouent un rôle primordial dans l atopie (69). Ils s opposent aux lymphocytes Th1, mis en jeu dans les réactions d hypersensibilité retardée, par exemple au cours de réponses contre des agents infectieux intracellulaires (bacille tuberculeux ) (Tableau I etfigure 2). Les lymphocytes Th1 produisent de l IL-2 et de l interféron, en l absence d IL-4 et d IL-5 (71,91). Les cytokines Th1 permettent le recrutement et l activation de macrophages et de lymphocytes qui jouent un rôle anti-infectieux et sont essentiels à la constitution de granulomes. Bien que très schématique et reposant principalement sur l analyse de modèles murins, cette dichotomie Th1/Th2 correspond à une certaine réalité clinique et biologique humaine (53,54,69). Ainsi, des études récentes confirment que la maladie asthmatique et les maladies allergiques en général s accompagnent d un profil Th2 caractéristique des réactions d hypersensibilité immédiate et que la tuberculose s accompagne d une surproduction de cytokines Th1 promotrices des réactions d hypersensibilité retardée (19,53,54,84). La polarisation Th1/Th2 de la réponse immune serait sous diverses influences encore mal connues. Le terrain génétique, les doses et la nature des antigènes, la voie d administration et des co-stimulations par des récepteurs membranaires joueraient un rôle particulièrement important. À ce titre, les cytokines elles-mêmes orientent la réponse immunitaire : l IL-4 favorise les réponses Th2 et l interféron- soutient les lymphocytes Th1 (20,71,91). La modulation des réponses lymphocytaires par divers traitements (au premier rang desquels les immunothérapies spécifiques), l antagonisme spécifique de cytokines (agents bloquant l IL-4 ou l IL-5 ) et l apport de cytokines modulatrices (interféron-, IL-10, IL-12 ) constituent des enjeux essentiels dans le domaine de l immunologie et de l allergologie.

4 - 4 - L IL-4 et les cytokines de l atopie (IL-13, IL-9) Données générales L IL-4 est principalement produite par les lymphocytes T auxiliaires de type Th2 (53,54). Elle peut également provenir d autres cellules au premier rang desquelles les mastocytes, les polynucléaires basophiles et les polynucléaires éosinophiles, éléments essentiels de la réponse inflammatoire allergique (118). L IL-4 est une cytokine proche de l IL-13, avec laquelle elle partage un récepteur commun et de nombreuses fonctions (20). L IL-4 joue un rôle primordial dans la synthèse des IgE par le lymphocyte B et la polarisation lymphocytaire Th2 (26). Outre ces actions essentielles, l IL-4 augmente l expression mastocytaire du récepteur de haute affinité pour les IgE (FcRI), l expression lymphocytaire et macrophagique du récepteur de faible affinité pour les IgE (FcRII, CD23), l expression endothéliale de VCAM-1, ligand du marqueur éosinophile VLA-4, la production de mucine et l activité de la 15- lipoxygénase (20,94). L IL-4 agit après interaction avec des récepteurs membranaires spécifiques présents à la surface de très nombreux types cellulaires (lymphocytes T et B, polynucléaires éosinophiles, mastocytes, macrophages, cellules musculaires lisses, cellules endothéliales, cellules épithéliales ) (77,98). Le récepteur de type I est un hétérodimère comportant une chaîne alpha (IL- 4R) spécifique de l IL-4 et une chaîne c partagée avec d autres récepteurs de cytokines (IL-2, IL-7, IL- 9 et IL-15) (Figure 3) (98). Le récepteur de type II est un récepteur commun à l IL-4 et à l IL-13 (Figure 3). Il comporte une chaîne IL-4R identique à celle des récepteurs de type I et qui lie donc l IL-4 et une chaîne liant l IL-13 (IL-13R1). Après liaison au récepteur de type I, l IL-4 active les Janus kinases JAK1 et JAK3 pour aboutir à l activation du facteur de transcription STAT6 qui va transloquer dans le noyau pour interagir directement avec le promoteur de gènes dont celui de l IL-4 lui-même (98). Le facteur de transcription STAT6 va ainsi soutenir la production d IgE par les lymphocytes B et le maintien de caractéristiques Th2 des lymphocytes T auxiliaires. De la même façon, l engagement des récepteurs de type II communs à l IL-4 et l IL-13 activeront JAK1 et TYK2 et le facteur de transcription STAT6 (98). L importance de l IL-4 est démontrée par l absence de réponse à IgE chez les souris délétées pour le gène de l IL-4 (15,16). À l inverse, les aérosols d IL-4 recombinante administrée à l homme entraînent une augmentation significative de l hyperréactivité bronchique à la métacholine et de la teneur en polynucléaires éosinophiles des expectorations induites (96). Enfin, les souris démunies d IL-4R sont déficientes en IgE et n ont pas de réponse Th2 soulignant l importance de cette chaîne dans les réponses à l IL-4 et l IL-13 (98). L IL-13 partage de nombreuses propriétés de l IL-4 (20). Principalement produite par le lymphocyte T et le polynucléaire basophile, l IL-13 est un facteur important de promotion et de différentiation du lymphocyte B, favorisant en particulier la production d IgE (20). Par ailleurs l IL-13 induit l expression endothéliale de VCAM-1, la production de mucine et le développement des cellules dendritiques (10,20). En revanche l IL-13 n est pas un facteur d orientation directe du phénotype Th2 des lymphocytes T auxiliaires. Des travaux récents ont souligné l importance d IL-13 dans l asthme (46,114). L IL-9 est également suspectée de jouer un rôle dans les maladies allergiques du fait de sa capacité à amplifier les réponses IgE et la production de médiateurs mastocytaires (6,97,101). Principalement produite par les lymphocytes Th2, cette cytokine stimule la prolifération des lymphocytes T activés, favorise la production des immunoglobulines, et en particulier des IgE, par les lymphocytes B et soutient la prolifération et la différentiation mastocytaire (6,32,101). Les actions de l IL-9 et du stem cell factor (principal facteur de promotion de la différenciation mastocytaire par le biais de son récepteur c-kit) ont des effets synergiques sur le mastocyte (6). Les souris surexprimant IL-9 au niveau pulmonaire sont caractérisées par une éosinophilie et une infiltration parenchymateuse lymphocytaire et des mastocytaire (101). D autres souris surexprimant IL-9 sont caractérisées par une éosinophilie des voies aériennes, une surproduction d IgE, et une hyperréactivité bronchique (101). Par ailleurs, l IL-9 favoriserait la production de mucus. Enfin, des données humaines montrent que l expression d IL-9 et de son récepteur est augmentée au niveau des voies aériennes des asthmatiques (97,101). Génétique de l asthme et de l allergie : IL-4 et IL-4R Les deux principaux facteurs prédisposants au développement d un asthme sont l existence d autres

5 - 5 - cas familiaux et l atopie (81). L atopie est classiquement définie par la prédisposition à développer une réponse à IgE en réponse aux allergènes de l environnement. Par extension, elle pourrait être définie actuellement comme une prédisposition à développer une réponse lymphocytaire de type Th2 vis-à-vis de ces allergènes, ce qui prend en compte non seulement la production d IgE mais aussi l activation des polynucléaires éosinophiles ainsi que le rôle central des lymphocytes T dans ce processus (69). Dans certaines populations, les phénotypes asthme et atopie sont fortement associés à la région 5q31.1- q33.1 (bras long du chromosome 5), où se situent de nombreux gènes codant pour les cytokines Th2 essentielles à la mâturation du polynucléaire éosinophile et à la réponse à IgE (18,81,98). Les gènes codant pour l IL-4 et l IL-13 sont tous deux situés à 25 kb de distance sur la partie proximale du bras long du chromosome 5 en position 5q31 (81,98). Le gène codant pour l IL-9 est situé dans la même région et constitue un autre gène candidat (81). Une association a été démontrée entre atopie et des marqueurs flanquant le gène codant pour IL-4R (sur le bras court du chromosome 16 en position 16p12). Des études récentes ont évalué l influence de variations du gène codant pour IL-4R sur les phénotypes asthmatique et atopique (42,74,78,79,87,98). Après liaison de l IL-4, certains variants induisent une plus forte expression de molécules induites par cette cytokine (dont celle du récepteur de faible affinité pour les IgE) (42). Cette variation de l effet de l IL-4 est probablement liée à une modification de la liaison de la portion intracellulaire d IL-4R à SHP-1, une tyrosine kinase régulant négativement l action d IL-4 (42). Expression bronchique de l IL-4 et de la chaîne alpha de son récepteur chez l asthmatique Chez l asthmatique allergique, les ARNm codant pour l IL-4 sont exprimés de façon accrue dans les cellules recueillies par lavage broncho-alvéolaire ou par biopsie bronchique (45,47,84,86,116). Ces résultats ont été obtenus par différentes méthodes [réaction en chaîne par polymérase après transcription inverse (RT-PCR), hybridation in situ et immunohistochimie] (Figure 4). Certains auteurs ont montré une corrélation entre l expression bronchique d IL-4 et différents marqueurs d atopie (concentrations sériques d IgE) ou des indices de sévérité de la maladie asthmatique (scores cliniques, degré d hyperréactivité bronchique) (86). Les études séquentielles par immunohistochimie et hybridation in situ démontrent que la majorité des cellules exprimant les ARNm codant pour l'il-4 correspondent à des lymphocytes T CD3+ (116,117). Ces lymphocytes sont majoritairement de phénotype CD4+ bien qu'une co-localisation CD8+ soit observée dans environ 10% des cellules (117). Les cellules restantes correspond aux mastocytes et aux polynucléaires éosinophiles (Figure 5) qui sont donc incriminés dans le contrôle et l entretien de la réponse inflammatoire allergique (117). De même, une expression accrue d IL-4R a été identifiée dans les voies aériennes chez l asthmatique (56). L IL- 13 est elle aussi surexprimée au niveau des bronches de patients asthmatiques (46). Antagonisme de l IL-4 dans l asthme Les corticostéroïdes chez l asthmatique induisent une amélioration clinique et, au plan biologique, une réduction de l éosinophilie sanguine et pulmonaire ainsi qu une réduction de l expression de nombreux médiateurs et cytokines dont IL-4 (8). Il est notable de signaler que les très rares patients souffrant d asthmes corticorésistants n ont pas plus de bénéfice clinique de la corticothérapie orale que de modulation significative de l expression des cytokines Th2 dont l IL-4 (61). Plus spécifiquement, l importance cruciale de l IL-4 dans les réponses allergiques a été démontrée formellement chez les souris invalidées pour les gènes de l IL-4, de l IL-4R ou de STAT-6 chez lesquelles la production d IgE et les réactions Th2 sont abolies. Un anticorps bloquant de l IL-4 permet, dans un modèle d asthme murin, de réduire l hyperréactivité bronchique et l éosinophilie pulmonaire induite par l allergène. L inhibition de l IL-4 pourrait donc être utile au contrôle des maladies allergiques. La voie d approche la plus étudiée pour contrer l effet de l IL-4 in vivo chez l homme est l utilisation d un récepteur soluble de l IL-4 correspondant à la partie extramembranaire d IL-4R(11). Ces récepteurs solubles agissent comme des leurres : ils lient l IL-4 sans transmettre aucune information intracelleulaire, rendant donc inefficace cette cytokine. Le bénéfice potentiel de l administration d aérosols d un récepteur soluble de l IL-4 chez des patients asthmatiques a été récemment démontré (11). Malgré ces résultats intéressants, l avenir de cette stratégie thérapeutique très (voire trop?) ciblée reste incertain (6). En effet, une maladie aussi complexe que l asthme ne peut certainement pas

6 - 6 - s expliquer par la perturbation d un seul médiateur et les stratégies visant à bloquer l action d une cytokine, même importante, est probablement incomplète. L interleukine 5 et les cytokines proéosinophiles (GM-CSF et IL-3) Données générales De nombreux travaux tendent à prouver que l'effet combiné de cytokines produites par différents types cellulaires dont le lymphocyte T activé jouent un rôle de tout premier ordre dans la régulation des étapes successives menant à l'inflammation muqueuse riche en polynucléaires éosinophiles caractéristique des maladies allergiques (12,19,21,23,29,46,49,90). Le recrutement tissulaire de polynucléaires éosinophiles à partir du courant sanguin nécessite différentes étapes successives comportant des phases de roulement et d'adhésion des cellules circulantes aux cellules endothéliales et leur migration suivant un gradient de substances chimiotactiques jusqu'à la sous-muqueuse bronchique. De plus, les polynucléaires éosinophiles peuvent être activés par de nombreuses cytokines au premier rang desquelles se trouve l IL-5, l'il-3 et GM-CSF (19,23,30). Il en résulte la constitution de lésions tissulaires résultant au moins en partie de la libération locale de protéines basiques des granules des éosinophiles tissulaires (41,76). Rôle et expression des cytokines pro-éosinophiles IL-5, GM-CSF et IL-3 dans les maladies allergiques L IL-5, l IL-3 et le GM-CSF partagent de nombreuses fonctions principalement du fait de l existence d une chaîne commune à leurs récepteurs. Ces récepteurs comportent une chaîne spécifique et une chaîne commune assurant la transmission de signaux d activation intracellulaires. L IL-5 favorise la maturation, l activation et la survie des polynucléaires éosinophiles (62,109,112). Il est maintenant établi que le gène de l'il-5 est transcrit puis traduit au niveau des réactions inflammatoires allergiques (45). Chez l'asthmatique, les lymphocytes T CD4+ constituent la source principale d'il-5 au niveau de la sous muqueuse bronchique et du liquide de lavage broncho-alvéolaire (45). De plus, des lignées cellulaires T CD4+ et CD8+ produites à partir de lavages broncho-alvéolaires d'asthmatiques allergiques, produisent une quantité accrue d'il-5 (107). D'autres cellules (principalement les mastocytes et les polynucléaires éosinophiles) constituent une source non négligeable d IL-5 in vivo (Figure 5) (14,31,118). L'expression bronchique du gène de l'il-5 est corrélée à la sévérité de la maladie asthmatique évaluée par de nombreuses méthodes [scores cliniques, volume expiré maximum par seconde (VEMS), concentration d histamine provoquant une chute de 20% du VEMS (PC20), variabilité du débit expiratoire de pointe ] (44). Par ailleurs, l'expression de la chaîne du récepteur de l'il-5 (IL-5R) est accrue chez l asthmatique (115). Ce récepteur est exprimé avant tout à la surface des polynucléaires éosinophiles (115). Les tentatives thérapeutiques visant à inhiber l'action de cette cytokine sont maintenant bien développées dans différents modèles animaux (34,59,72). Ainsi, l'inflammation des voies aériennes induites par des aérosols d'ascaris suum chez le singe est réduite de façon importante par l'administration préalable d'un anticorps monoclonal anti-il-5 (72). L'inhibition d'il-5 empêche la constitution d'une inflammation pulmonaire riche en polynucléaires éosinophiles comme cela a été démontré dans divers modèles animaux d'inflammation pulmonaire allergique (59). Les données les plus récentes concernant l utilisation des anticorps monoclonaux anti-il-5 dans l asthme allergique chez l homme montrent un effet net sur l éosinophilie sanguine et tissulaire (60). Néanmoins les résultats sont négatifs sur l hyperréactivité bronchique induite par l allergène (60). Ces résultats remettent en cause la force de l association entre éosinophilie et asthme, mais ils confirment en revanche l action proéosinophile de l IL-5 chez l homme (6,60). Aux côtés de l'il-5, le GM-CSF et l'il-3 jouent probablement un rôle dans la régulation de l'inflammation allergique (88,113). Ainsi, les lignées lymphocytaires T produites à partir de lavages broncho-alvéolaires de patients porteurs d'un asthme allergique peuvent produire des quantités accrues de GM-CSF. L'immunomarquage de crachats de patients asthmatiques a montré qu'il existait un nombre accru de cellules positives pour le GM-CSF (43). Enfin, les cellules épithéliales bronchiques prosuisent GM-CSF chez l'asthmatique (25,100). Les corticostéroïdes inhalés diminuent l'expression épithéliale de GM-CSF et le nombre de polynucléaires éosinophiles intraépithéliaux activés diminue en parallèle (25,100).

7 - 7 - Le TNF et les cytokines pro-inflammatoires Pour se mobiliser du courant sanguin à la muqueuse bronchique, les polynucléaires éosinophiles doivent adhérer à différentes structures dont l'endothélium vasculaire et les composants de la matrice extracellulaire. Ce recrutement cellulaire nécessite au moins trois événements successifs: phase de roulement, d'adhésion ferme et de migration transendothéliale. Le recrutement de cellules inflammatoires dans un site donné semble principalement sous le contrôle de l'expression de molécules d'adhésion endothéliales [P-sélectine, E-sélectine, intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1, CD54), vascular cell adhesion molecule (VCAM-1)...] (102,103). Des cytokines pro-inflammatoires (dont le chef de file est le TNF) favorisent l expression des molécules d adhésion telles que ICAM-1 et soutiennent donc le recrutement local de granulocytes au cours de maladies inflammatoires (39,102,103,106,119). Le TNF et les autres cytokines proinflammatoires comme IL-1 majorent l inflammation allergique de façon non spécifique par le biais de l activation de facteurs de transcription [nuclear factor kappa B (NF-B), activator protein 1 (AP-1) ] qui vont favoriser la production de nombreux médiateurs pro-inflammatoires (TNF, IL-1, IL-2, IL-6, GM-CSF, IL-8, éotaxine, NO synthase inductible, 5-lipoxygénase, ICAM-1, VCAM-1, E-sélectine ) (5,27,106). Les sources cellulaires de TNFsont multiples (macrophages, monocytes, lymphocytes ) (39). Cette cytokine peut aussi être libérée rapidement des granules de stockage du mastocyte au cours des réponses allergiques ou anti-infectieuses (10,73). Par ailleurs, la démonstration que le marqueur very late antigen 4 (VLA-4) est exprimée à la surface des lymphocytes et des polynucléaires éosinophiles (mais pas des polynucléaires neutrophiles) a abouti à l'hypothèse que VCAM-1, le ligand de VLA-4 à la surface endothéliale, pourrait être le régulateur endothélial principal de la réponse inflammatoire allergique. On a vu plus haut que l IL-4 et l IL-13 majorent l'expression de VCAM-1, soutenant l'hypothèse que ces cytokines pourraient réguler l'inflammation asthmatique éosinophile au moins en partie par le biais de l'expression endothéliale de VCAM-1 (10,63,94). Les chimiokines Les molécules chimiotactiques décrites il y a de nombreuses années, telles que le C5a, agissent de façon non spécifique sur les polynucléaires neutrophiles, les polynucléaires éosinophiles, les polynucléaires basophiles et les monocytes. Il a récemment été décrit un groupe de cytokines chimiotactiques (baptisées chimiokines, acronyme pour cytokines chimiotactiques) dont la structure moléculaire est proche et dont l'activité principale consiste en l'attraction et l'activation de leucocytes (granulocytes, monocytes, lymphocytes T...) (92,93). Les chimiokines sont des polypeptides de petit poids moléculaire (de 8 à 14 kd) qui ont été regroupés en différents groupes en fonction de leur structure moléculaire (83,93). À l'exception de la lymphotactine (C chimiokine), les chimiokines ont 4 résidus cystéines conservés (83,93). Les deux premières cystéines peuvent être adjacentes (CC chimiokines RANTES, éotaxine, MCPs ), séparées par un acide aminé (CXC chimiokines :IL-8 ), ou séparées par trois acides aminés (CX 3 C chimiokine : fractalkine) (7,35). Les CC et CXC chimiokines se caractérisent par une certaine spécificité de leur cible (83,122) : les CXC chimiokines sont plus actives sur les polynucléaires neutrophiles alors que les CC chimiokines ont tendance à agir sur les monocytes et parfois les polynucléaires basophiles, les lymphocytes et les polynucléaires éosinophiles (83). Une classification plus récente des chimiokines sépare les chimiokines «inflammatoires» (ou inductibles) des cytokines «homéostatiques» (ou constitutives) (65,75,108). Les chimiokines inductibles sont exprimées après stimulation (par des cytokines pro-inflammatoires ou le contact avec un agent pathogène) au sein des tissus inflammatoires par les cellules résidentes ou recrutées (75). Ces chimiokines sont spécialisées dans le recrutement de cellules effectrices (monocytes, polynucléaires et lymphocytes). Ce groupe comporte de nombreux acteurs de la réponse inflammatoire allergique : RANTES, MCP-3, éotaxine À l inverse, les chimiokines constitutives sont produites localement dans des tissus lymphoïdes ou non lymphoïdes comme la peau (75). Ces chimiokines sont impliquées dans la circulation des cellules essentielles à l hématopoièse et la surveillance immunitaire (75). Cette distinction n est bien sûr pas absolue, certaines chimiokines appartenant aux deux sous familles. Une meilleure connaissance du groupe des CC chimiokines a permis d'en faire des acteurs privilégiés

8 - 8 - de la réponse inflammatoire allergique (3,4,37,67,75,120). Ces chimiokines jouent un rôle pro-allergique majeur par deux biais : recrutement cellulaire d une part et activation leucocytaire d autre part. Les chimiokines peuvent activer et favoriser la dégranulation des principales cellules de l inflammation allergique (mastocytes, polynucléaires basophiles et éosinophiles) (4,24). Les chimiokines sont en effet les principales molécules non IgE capables de promouvoir la libération d histamine (histamine releasing factor). Ainsi les agonistes du récepteur CCR2 (MCP-1, MCP-2, MCP-3 et MCP-4) sont de très puissants histamine releasing factor du polynucléaire basophile (4,24). L'éotaxine, RANTES, MCP-3, MCP-4 et macrophage inflammatory protein 1 alpha (MIP-1) ont la faculté mobiliser les polynucléaires éosinophiles (et basophiles) et il existe maintenant de nombreux éléments faisant penser que ces cytokines jouent un rôle primordial dans l'inflammation allergique (4,33,64,95). Ainsi, l'expression des gènes de RANTES et MCP-3 est élevée au niveau de l'épithélium bronchique et de l'infiltrat inflammatoire sous-muqueux de patients asthmatiques (9,48). Cette expression est corrélée de façon positive à celle de l'il-5, de l'il-3 et du GM-CSF (48). Ceci constitue un élément de plus en faveur de l'existence d'un réseau complexe de cytokines pro-éosinophiles au niveau de la muqueuse bronchique de ces patients. Les cellules épithéliales et endothéliales, de même que les macrophages, les lymphocytes T et les polynucléaires éosinophiles sont les principales sources de chimiokines chez l asthmatique in vivo (118,120). La production de RANTES par les cellules épithéliales bronchiques est réduite par les corticostéroïdes inhalés (52,104,111). L éotaxine joue un rôle de tout premier plan dans l inflammation allergique (36). Cette chimiokine a été décrite initialement dans un modèle d'inflammation pulmonaire allergique chez le cochon d'inde : l'administration cutanée du liquide de lavage broncho-alvéolaire dans ce modèle induisait le recrutement et la stimulation locale des polynucléaires éosinophiles (40,51). Ce recrutement était sélectif et lorsque la protéine responsable de cet effet a été purifiée, elle correspondait morphologiquement à une nouvelle CC chimiokine, l'éotaxine (40,51). Une chimiokine homologue a été décrite chez la souris et l'homme (38,80,89). La séquence de l'éotaxine est très proche de celle des MCPs. On sait maintenant que les polynucléaires éosinophiles humains expriment les récepteurs pour l'éotaxine (CCR3) qui sont également reconnus par MCP-3 et RANTES (cela a été prouvé par des expériences de liaison et de désensibilisation croisée). Néanmoins, l'éotaxine se lie avec une plus grande affinité au CCR3 et ne semble pas interagir de façon efficace avec les autres récepteurs de chimiokines connus. Chez le rongeur, l'expression de l'éotaxine a été observée dans des modèles d'inflammation allergique et des situations associées à des recrutements de polynucléaires éosinophiles. Il a été également démontré chez la souris et le cochon d'inde que l'efficacité de l'éotaxine sur sa cible est augmentée par l'administration simultanée d'il-5, soulignant l'existence probable de mécanismes de recrutement et d'activation de l'éosinophile impliquant deux mécanismes, l'un IL-5 dépendant, l'autre reposant sur l'éotaxine (21). Par ailleurs l'éotaxine a une action autocrine sur le polynucléaire éosinophile humain. Cette production d'éotaxine par l'éosinophile est augmentée après traitement par IL-3, soulignant l'importance du réseau et de l'action concomittante de diverses cytokines in vivo chez l'homme (90). La production bronchique accrue d éotaxine chez l asthmatique est maintenant bien démontrée (Figure 6). Les doubles marquages ont souligné que l'épithélium et l endothélium bronchiques sont des sources importantes de cette cytokine in vivo. Les chimiokines se liant à CCR3 constituent actuellement une cible thérapeutique privilégiée du fait de la possibilité de bloquage de nombreux médiateurs proéosinophiles par le biais d antagonistes de leur récepteur commun CCR3 (66). Cytokines anti-inflammatoires : interleukine 10 et transforming growth factor beta L IL-10 est produite par de nombreux types cellulaires (monocytes, macrophages, lymphocytes B et T ). Le concept selon lequel l IL-10 est en fait une cytokine anti-inflammatoire repose sur de nombreuses données expérimentales : inhibition de la production de cytokines pro-inflammatoires (IL-1, IL-6, IL-8, TNF, GM-CSF, IL-8 ), inhibition de l activité antimicrobienne du macrophage et du polynucléaire neutrophile, diminution de la fonction de présentation de l antigène par diminution de la synthèses des molécules d histocompatibilité de classe II, et des molécules d adhésion B7 et ICAM-1, réduction de la production d IgE par le lymphocyte B (57,82). Les souris invalidées pour le gène de l IL-

9 développent des lésions de colite inflammatoire chronique, soulignant la pertinence du rôle antiinflammatoire de cette cytokine in vivo (58). Une population particulière de lymphocytes régulateurs (parfois appelés Tr1) possède une forte action suppressive du fait de leur grande capacité de production d IL-10 (121). À ce titre, il est intéressant de noter une augmentation de l expression macrophagique alvéolaire d IL-10 après activation allergénique chez l asthmatique allergique. Certains auteurs ont suggéré qu un défaut de production d IL-10 puisse favoriser l émergence de maladies allergiques et que la promotion de la production d IL-10 puisse jouer un rôle bénéfique au cours de l immunothérapie spécifique de l allergène (1). Le TGF est produit par virtuellement tous les types cellulaires. Cette cytokine complexe a de nombreuses propriétés qui semblent particulièrement importantes dans les phénomènes de fibrose et d angiogénèse. Le potentiel anti-inflammatoire de TGF est souligné par l apparition de réactions inflammatoires diffuses léthales chez les souris invalidées pour son gène et l atténuation des conséquences de l injection de lipopolysaccharide bactérien par injection préalable de TGF (99).Au cours des réactions inflammatoires, la production locale de TGF aurait comme action bénéfique le contrôle de ces phénomènes avec comme corrolaire le risque d apparition de lésion de fibrose (55,68). Interféron gamma, interleukine 12 et interleukine 18 L interféron joue un rôle important dans le développement des réponses Th1. Son implication a été démontrée dans des maladies granulomateuses telles que la tuberculose ou la sarcoïdose. L inhibition de l action de cette cytokine in vitro réduit le développement des lymphocytes Th1 et favorise l émergence d une population de lymphocytes Th2. Néanmoins l administration d interféron in vitro ou in vivo n induit pas une réponse Th1. Cette cytokine est donc nécessaire, mais non suffisante au développement d une réponse Th1. Certains auteurs ont montré que l expression bronchique d interféron est élevée dans les lymphocytes circulants CD8+ chez l asthmatique, suggérant un rôle immunomodulateur de ces cellules sur l inflammation Th2 et soulignant la complexité du réseau des cytokines dans cette maladie (70,71,91). Néanmoins, après immunothérapie spécifique de l allergène, on constate une réduction de la réponse retardée à l allergène qui est corrélée avec l augmentation du nombre de cellules exprimant interféron et la réduction marquée des cellules exprimant IL-4 (2). Ces résultats suggèrent que l inhibition de mécanismes dépendant des IgE et la réduction de l éosinophilie tissulaire favorisée par une immunothérapie efficace serait au moins en partie la conséquence d une modulation de la réponse cytokinique T avec apparition d un profil majoritairement Th1 remplaçant un profil antérieurement Th2 (2). L IL-12 pourrait jouer ici un rôle important. L IL-12 est une cytokine principalement produite par les macrophages et les lymphocytes B. Elle oriente vers une polarisation Th1 de façon plus intense que l interféron. Il a récemment été démontré qu une immunothérapie spécifique efficace s accompagnait d une augmentation du nombre de macrophages tissulaires exprimant IL-12. Ce nombre de cellules IL- 12+ est positivement corrélé avec le nombre de cellules exprimant interféron et inversement corrélé avec le nombre de cellules exprimant IL-4. Néanmoins des tentatives de traitement d asthmatiques allergiques légers par perfusion d IL-12 recombinante se sont soldées par des échecs cliniques (pas de modification de l hyperréactivité bronchique) malgré un bon contrôle de l éosinophilie sanguine et pulmonaire évaluée par expectoration induite (17). Par ailleurs ce traitement était à l origine d effets indésirables importants (syndromes pseudogrippaux, trouble du rythme, malaise ), soulignant son absence d intérêt chez l asthmatique allergique (6,17). L IL-18 a été initialement décrite comme un facteur favorisant la production d interféron mais dont le mécanisme d action diffère de celui de l IL-12 (28). IL-18 et IL-12 sont synergiques sur la production d interféron. Il est intéressant de signaler que le transfert d IL-18 chez la souris bloque l inflammation allergique et l hyperréactivité bronchique (110). Les cytokines et chimiokines forment donc un réseau complexe dont l influence sur la réponse immunitaire allergique est majeure. Dans un soucis de clarté, nous avons orienté notre discussion vers des molécules particulièrement pertinentes dans l allergie et l asthme : cytokines pro-atopiques,

10 cytokines pro-éosinophiles et cytokines anti-inflammatoires. Néanmoins il faut souligner ici que de nombreuses autres cytokines interagissent au niveau des tissus cibles et que l avenir affinera notre compréhension de ces médiateurs interdépendants. Afin d aborder le rôle possible de ces médiateurs, les tableaux II et III reprennent de façon non exhaustive certaines cytokines et chimiokines, en soulignant tout particulièrement leur rôle possible chez l allergique.

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17 FIGURES Figure 1 : Réponse lymphocytaire Th2 et réponse immunitaire allergique. Figure 2 : Réponse lymphocytaire Th1 et hypersensibilité retardée. Figure 3 : Représentation schématique des récepteurs de l IL-4 de types I et II. L IL-4 peut lier les deux types de récepteurs par le biais de la chaîne commune IL-4R. En revanche l IL- 13 ne peut lier que les récepteurs de type II par le biais de la chaîne IL-13R1. Après liaison au récepteur de type I, l IL-4 active les Janus kinases JAK1 et JAK3 pour aboutir à l activation du facteur de transcription STAT6 qui va transloquer dans le noyau pour activer directement certains gènes. Ceci va permettre la production d IgE par les lymphocytes B et le maintien de caractéristiques Th2 des lymphocytes T auxiliaires. De la même façon, l engagement des récepteurs de type II communs à l IL-4 et l IL-13 activeront JAK1 et TYK2 et le facteur de transcription STAT6. Figure 4 : Production bronchique d IL-4 chez l asthmatique allergique (biopsie bronchique) Haut : Détection par hybridation in situ de cellules exprimant l ARN messager codant pour l IL-4 Bas : Détection par immunohistochimie de cellules produisant la protéine IL-4 Figure 5 : Origine cellulaire des ARN messagers codant pour l IL-4 chez l asthmatique allergique (résultats obtenus par double marquage sur biopsie bronchique) : les lymphocytes T, polynucléaires éosinophiles et mastocytes étaient respectivement identifiés par immunomarquage CD3, MBP et tryptase. Figure 6 : Production bronchique d IL-4 chez l asthmatique allergique (biopsie bronchique). Détection par hybridation in situ de cellules exprimant l ARN messager codant pour la CC chimiokine éotaxine chez des asthmatiques allergiques et des sujets contrôles. Les résultats sont donnés en nombre de cellules par mm 2.