IMPACT FONCTIONNEL DE L'INTERACTION KERATINOCYTE-LYMPHOCYTE T AU COURS DU PSORIASIS

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1 GUILLAUME MARTIN IMPACT FONCTIONNEL DE L'INTERACTION KERATINOCYTE-LYMPHOCYTE T AU COURS DU PSORIASIS Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l'université Laval dans le cadre du programme de maîtrise en Pharmacie pour l'obtention du grade de maître es sciences (M. Se.) FACULTE DE PHARMACIE UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC 2011 Guillaume Martin, 2011

2 Résumé Un important réseau de cytokines serait en grande partie responsable de la formation des lésions psoriasiques. La présence de cellules immunitaires dans des biopsies de peaux psoriasiques suggère une implication majeure de ces dernières dans la maladie. La présente étude tente d'explorer la communication à caractère pro-inflammatoire entre lymphocytes T et kératinocytes psoriasiques. Notre modèle in vitro consiste en une monocouche de kératinocytes sains ou psoriasiques mis en co-culture avec des lymphocytes T sains isolés du sang humain. Les interactions cellulaires ont été étudiées suivant l'analyse de la production de 22 cytokines/chimiokines (technologie du Luminex xmap) et complétées par ELISA. Nos résultats démontrent que les kératinocytes psoriasiques avec les lymphocytes T augmentent leur production de TNF-a, de GM-CSF, de MCP-1, d'il-6 et d'il-8 ainsi que celle de ltfn-y, du sil-2 Ra et de la Fractalkine lorsque 1TL-2 est présente comparativement à la co-culture kératinocytes sains-lymphocytes T. Des tests additionnels avec le neutrophile montrent que la production de cytokines inflammatoires est suffisante pour influencer ce dernier. Ces résultats démontrent l'interaction fonctionnelle entre les kératinocytes et les lymphocytes T ainsi que la persistance des caractéristiques pathologiques des kératinocytes psoriasiques in vitro. Ce modèle expérimental de coculture sera intéressant pour comprendre en profondeur des désordres cutanés auto-immuns comme le psoriasis.

3 11 Remerciements Avant tout, j'aimerais remercier ma directrice de recherche Roxane Pouliot pour son accueil et son soutien au cours de mes études, pour ses encouragements fort appréciés lors des moments positifs et sa grande patience dans les moments plus difficiles. J'aimerais aussi remercier tous les membres de l'équipe pour leur aide, leur support et leur contribution à la réussite de ce grand projet. Un merci à Marie-Michèle Rosa-Fortin qui a démarré ce projet en force et, bien entendu, à Simon Guérard qui va, j'en suis sûr, mener à bien ce projet au-delà de toutes attentes. Merci aux membres du LOEX qui ont contribué de près ou de loin à ce projet, aux collègues proches et amis qui ont su rendre notre milieu de travail agréable et motivant. Un merci spécial à mon co-directeur Patrice E. Poubelle et à son équipe de recherche au CRRI pour m'avoir accueilli comme un des leurs, m'avoir fait profiter de leur grande expérience et expertise technique. Le projet n'aurait pu aller de l'avant sans vous. Je tiens à remercier ma famille et mes amis qui m'ont toujours supporté moralement dans mes choix et ont tout mis en œuvre pour ma réussite. Merci à ma partenaire de vie Alicia, qui a vécu une grande partie du cheminement de mes études, pour sa patience et ses nombreux sacrifices. Merci d'avoir cru en moi et m'avoir supporté jusqu'au bout.

4 Table des matières Résumé Remerciements Table des matières Liste des tableaux Liste des figures Liste des abréviations i ii iii v vi vii Chapitre 1 : Introduction générale La peau L'hypoderme Le derme L'épiderme Le keratinocyte Le psoriasis Aspects cliniques Facteurs génétiques Facteurs environnementaux Le système immunitaire L'immunité innée L'immunité acquise Histopathologic et formation des plaques Interactions cellulaires dans le psoriasis Traitements Génie tissulaire Problématique et objectifs 28 Chapitre 2 : Matériel et méthodes Extraction et culture cellulaire Extraction des kératinocytes Isolation des cellules mononucléées périphériques du sang (PBMC) Milieu de culture utilisé Réalisation des co-cultures kératinocytes-lymphocytes en monocouche Cytometric en flux (FACS) Luminex et plaque multiplex Dosage par ELISA Co-cultures avec inserts Tests d'adhésion avec neutrophile Analyses statistiques 36

5 IV Chapitre 3 : Résultats Apoptose cellulaire Expression de cytokines Co-cultures avec inserts Adhésion des neutrophiles 51 Chapitre 4 : Discussion Apoptose cellulaire Interactions cellulaires Le neutrophile et le modèle psoriasique 60 Chapitre 5 : Conclusion 61 Bibliographie 63

6 Liste des tableaux Tableau 1.1 : Loci découverts comme étant susceptibles de causer le psoriasis 12 Tableau 2.1 : Caractéristiques des populations cellulaires psoriasiques utilisées 30 Tableau 3.1 : Sécrétion de cytokines et chimiokines par les kératinocytes sains et psoriasiques en monoculture 41 Tableau 3.2 : Sécrétion de cytokines et chimiokines par les kératinocytes sains et psoriasiques en co-culture avec lymphocytes T 42

7 VI Liste des figures Figure 1.1 : Les différentes couches de la peau 3 Figure 1.2 : Représentation des kératinocytes formant les couches de l'épiderme 5 Figure 1.3 : La différenciation du keratinocyte dans l'épiderme 8 Figure 1.4 : Aspect des multiples formes de psoriasis généralement retrouvées dans la population 10 Figure 1.5 : PSORS1 et ses composantes inclus dans le gène du CMH 13 Figure 1.6 : La synapse immunologique entre CPA-Th et cellule cible-tc 16 Figure 1.7 : Hypothèse de formation des lésions psoriasiques 20 Figure 1.8 : Aperçu du réseau de médiateurs chimiques et molécules d'adhésion impliqués dans le psoriasis 21 Figure 1.9 : Interaction des agents biologiques dans la synapse immunologique 26 Figure 2.1 : Schématisation de la méthode de séparation des PBMC du sang sur Ficoll- Hypaque 31 Figure 2.2 : Représentation du type d'insert utilisé dans cette co-culture 35 Figure 3.1 : Évaluation de l'apoptose dans les cultures 40 Figure 3.2 : Production des chimiokines MCP-1 et IL-8 en monoculture 43 Figure 3.3: Production des chimiokines MCP-1 et IL-8 en co-culture 44 Figure 3.4 : Production des cytokines TNF-a, IL-6, IL-lRa/IL-1 et GM-CSF en monoculture 45 Figure 3.5 : Production des cytokines TNF-a, IL-6, IL-lRa/IL-1 et GM-CSF en co-culture 46 Figure 3.6 : Production des cytokines IFN-y, sil-2ra et fractalkine en co-culture 48 Figure 3.7 : L'impact de l'utilisation d'inserts sur la production des cytokines 50 Figure 3.8 : Quantité de neutrophiles adhères aux kératinocytes sains ou psoriasiques suite à une co-culture avec lymphocytes T 52

8 Vil Liste des abréviations BCR Récepteur des lymphocytes B (B cell receptor) CCHCR1 : Coiled-coil alpha-helical rod protein 1 CDSN : CLA : CMH : CPA : Cornéodesmosine (corneodesmosin) Antigène des lymphocytes cutanés (cutanous lymphocyte antigen) Complexe majeur d'histocompatibilité (major histocompatibility complex) Cellule présentatrice d'antigène (antigen-presenting cell) CTLA-4 : Antigène du lymphocyte T cytotoxique 4 (cytotoxic T-lymphocyte antigen 4) DC : DMEM : ELISA : FACS : HBSS : HLA-C : Cellule dendritique (dendritic cell) Dubelcco- Vogt modified Eagle's medium Dosage d'immunoabsorption par enzyme liée (Enzyme-linked immunosorbent assay) Cytometric en flux par fluorescence (fluorescence activated cell sorter) Solution tampon de Hank (Hank's buffered salt solution) Antigène des leucocytes humains C (human leukocyte antigen Q ICAM-1 : Molécule d'adhésion intercellulaire-1 (intercellular adhesion molecule-1) IFN : IL : LFA : LOEX : MAC : MCP-1 : MEC : Interferon (interferon) Interleukine (interleukin) Fonction associée au lymphocyte (lymphocyte function associated) Laboratoire d'organogénèse Expérimentale Complexe d'attaque membranaire (membrane attack complex) Protéine chimiotactique des monocytes-1 (monocyte chemotactic protein-1) Matrice extracellulaire (extracellular matrix) NFAT : Facteur nucléaire des lymphocytes T activés (nuclear factor of activated T- cells) NF-KP : NK Facteur nucléaire rehaussant la chaîne légère kappa des lymphocytes B activés (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) Tueuse naturelle (natural killer)

9 Vlll PAMP : PBMC : PBS : PRR : PSORS : SCID : STAT : TACE : TCR : TGF : TLR : TNF : Treg : Motifs moléculaires répétés associés aux pathogènes (pathogen-associated molecular patterns) Cellule mononucléée périphérique du sang (peripheral blood mononuclear cell) Tampon phosphate salin (phosphate buffered saline) Récepteurs de reconnaissance de motifs répétés (pattern recognition receptors) Psoriasis susceptibility Immunodéficience sévère combinée (severe combined immunodeficiency) Signal Transducer and Activators of Transcription Enzyme de conversion du TNF-a (tumor necrosis factor-a-converting enzyme) Récepteur des lymphocytes T (T cell receptor) Facteur de croissance tumorale (tumor growth factor) Récepteur de type Toll (Toll-like receptor) Facteur de nécrose tumorale (tumor necrosis factor) Lymphocyte T régulateur (regulatory T cell)

10 Chapitre 1 : Introduction générale

11 1.1 La peau La peau n'est pas qu'une enveloppe recouvrant les muscles et organes internes, c'est aussi un ensemble de tissus regroupés pour assurer plusieurs fonctions essentielles. La superficie totale de la peau chez l'adulte moyen est d'environ 1,5 à 2,0 m. En plus de protéger l'organisme contre l'infiltration de pathogènes, de molécules antigéniques ou encore de certaines substances toxiques, la peau empêche la déshydratation et elle permet, par différents mécanismes, une régulation de la température corporelle. Ses propriétés semi perméables favorisent la pénétration de molécules liposolubles et aident légèrement à une détoxication des produits de dégradation entre autres, l'ammoniaque. Dans les couches plus profondes de la peau siègent les terminaisons nerveuses responsables des sensations tactiles ou thermiques. C'est grâce à l'ensemble de ses propriétés, ainsi qu'à sa capacité de régénération que la peau permet au corps de répondre et de s'adapter aux agressions extérieures [1]. La peau est formée de trois parties. L'hypoderme, aussi appelé fascia superficiel, est la couche la plus profonde. Elle donne suite au derme qui est la partie la plus épaisse et est composée surtout de tissu conjonctif. La partie la plus superficielle, l'épiderme, est composée de cellules épithéliales (Figure 1.1 ) [ 1 ] L'hypoderme L'hypoderme est la partie la plus interne. Il sert d'interface entre le derme et les tissus sous-jacents comme les muscles et les tendons. La prédominance du tissu adipeux dans cette couche lui confère les rôles d'isolant thermique et de réserve énergétique [2].

12 Épiderme Derme Hypoderme Figure 1.1 : Les différentes couches de la peau (Géras, A.J. 1990) Le derme Le tissu conjonctif qui compose le derme est principalement peuplé defibroblastes,cellules d'origine mésenchymateuse. Ces fibroblastes vont produire par exocytose une matrice extracellulaire. On retrouve dans cette matrice des fibres de collagènes qui vont s'assembler et donner à la peau une résistance à retirement ou à la compression tout en gardant une certaine souplesse. La présence defibresélastiques avec le collagène permet à cette peau extensible de reprendre sa forme initiale après déformation [3]. La matrice extracellulaire (MEC) présente aussi d'autres macromolécules comme des proteoglycans et

13 4 des glycoprotéines qui ont comme fonction respective de maintenir l'hydratation et de fixer les cellules à la matrice [3]. Selon sa structure histologique, le derme se divise en 2 couches : le stratum papillaire et le stratum réticulaire. Le stratum papillaire s'étend de la jonction dermo-épidermique jusqu'à environ un cinquième de l'épaisseur du derme. On y retrouve les papilles dermiques, des boucles de capillaires, ainsi que les corpuscules de Meissner et des terminaisons nerveuses libres assurant le sens du toucher. Le stratum réticulaire occupe la plus grande partie du derme. À mesure que l'on s'enfonce dans le derme, le tissu conjonctif devient plus dense et irrégulier. On y retrouve aussi des petites artères, des glandes sébacées et sudoripares [1, 4-5]. Le derme étant bien irrigué par des vaisseaux sanguins et lymphatiques, il est la voie d'entrée par extravasation des cellules immunitaires dans la peau. Par exemple, lors d'une réponse inflammatoire cutanée, il y a affluence de neutrophiles, lymphocytes, monocytes et macrophages dans les différentes couches du derme et de l'épiderme au site de la lésion [6-7]. Les fibroblastes du derme vont aussi avoir un rôle majeur dans la réparation d'un tissu lésé. Leur présence ainsi que la sécrétion de facteurs solubles et insolubles vont influencer la différenciation et la morphologie des cellules de la partie supérieure de la peau : l'épiderme [8-10] L'épiderme L'épiderme est la partie superficielle de la peau. Cette partie forme un epithelium stratifié pavimenteux kératinisé. Les cellules qui le composent sont des kératinocytes à environ 90%, 8% des melanocytes, des cellules de langerhans et des cellules de Merkel [1]. L'épiderme se subdivise en quatre ou cinq couches selon la localisation (Figure 1.2). Couche basale (stratum basale) : Cette couche est la plus profonde de l'épiderme. Elle est située juste au-dessus de la membrane basale et du derme. Elle se présente comme une

14 seule couche de kératinocytes rattachés à la membrane basale. On peut apercevoir quelques melanocytes et cellules de langerhans disséminés à travers des kératinocytes de cette couche. Les melanocytes produisent la mélanine, un pigment protecteur du rayonnement ultraviolet (UV). Cette mélanine est acheminée grâce aux longs prolongements entre les kératinocytes environnants [4]. Les cellules de langerhans originent plutôt de la moelle osseuse. Elles vont migrer dans l'épiderme et agir en tant que cellules présentatrices d'antigènes (CPA) avec un profil de marqueurs spécifiques [4]. Cornified envelope Keratin macrofibrils Stratum corneum Granular layer Spinous layer Dermis Figure 1.2 : Représentation des kératinocytes formant les couches de l'épiderme (Segre 2006).

15 Couche épineuse (stratum spinosum) : La couche épineuse vient tout juste après la couche basale. Elle occupe une épaisseur d'environ 8 à 10 kératinocytes polyédriques entassés. Cette couche aide à la résistance mécanique de l'épiderme [11]. Couche granuleuse (stratum granulosum) : Formée de 3 à 5 épaisseurs de kératinocytes en apoptose, cette couche marque la transition entre des cellules nucléées et les cellules mortes des couches supérieures. C'est aussi dans cette couche que commence la libération de lipides dans la zone extracellulaire. Ces lipides vont combler l'espace entre les cellules et former une barrière imperméable afin d'empêcher la perte d'eau ou l'entrée de substances étrangères [1, 12]. Couche claire (stratum lucidum) : Cette couche n'est présente que dans la peau de la paume des mains, du bout des doigts et de la plante des pieds. Elle est formée d'environ 3 à 5 strates de kératynocytes clairs, morts et aplatis [1]. Couche cornée (stratum corneum) : Elle est la couche la plus superficielle et elle est formée de 25 à 30 kératinocytes morts et aplatis, que l'on appelle maintenant cornéocytes. Ces cornéocytes, hautement insolubles, vont s'imbriquer les uns aux autres avec les lipides extracellulaires afin de constituer une barrière résistante aux lésions, à la pénétration d'eau et de microorganismes. Tous les jours, suite aux frictions ou naturellement, les cellules en superficie vont se détacher et tomber. C'est un processus que Ton appelle desquamation. Les cellules de la couche cornée ainsi perdues sont remplacées par des cellules sousjacentes [1,11] Le keratinocyte Les kératinocytes sont les cellules dominantes de l'épiderme. Lors d'une différenciation normale, les kératinocytes vont passer par plusieurs étapes de développement en migrant vers les couches supérieures. On retrouve les cellules progénitrices attachées à la membrane basale par des hémidesmosomes. À ce stade, ces kératinocytes vont exprimer les kératines

16 5 et 14. Les cellules nouvellement formées, suite à la division de ces cellules basales, vont se détacher et migrer vers la couche épineuse pour débuter la différenciation. Le keratinocyte passe d'une forme cubique à une forme plus étoilée, épineuse, et il va former des liaisons avec les kératinocytes voisins à l'aide des desmosomes bien encrés au cytoskelette. À partir d'ici, l'expression des kératines 1 et 10 montre que le processus de différenciation est bien enclenché. Plusieurs transformations du keratinocyte se produisent dans la couche granulaire. Il y a production des protéines qui formeront ou participeront à la formation de l'enveloppe des cornéocytes comme l'involucrine, la loricrine, la profilaggrine et la transglutaminase. Aussi, l'apparition des granules lamellaires qui, par exocytose, déverseront leur contenu lipidique dans l'espace extracellulaire. La morphologie du keratinocyte change. Les cellules s'applatissent, le noyau et les organites commencent à se dégrader. La différenciation terminale va se poursuivre avec l'accumulation des kératines et la formation de l'enveloppe du cornéocyte. Cela semble débuter par le dépôt d'involucrine à la surface interne de la membrane plasmique et avec l'augmentation de la concentration en Ca 2+ qui va activer les transglutaminases. Ces dernières sont impliquées dans la polymérisation des autres protéines composantes de l'enveloppe. Il en résulte une enveloppe d'environ 15 nm très résistante et insoluble, composée d'une partie protéique et d'une partie lipidique [12-14]. Un cycle complet de différenciation du keratinocyte prend environ 4 semaines mais peut être accéléré lors d'un stress dans l'épiderme (Figure 1.3) [1]. Le keratinocyte est une grosse cellule capable de produire et d'exprimer une vaste gamme de protéines membranaires, facteurs de croissances et médiateurs inflammatoires. Il exprime entre autres des récepteurs Toll-like (TLR) capables de reconnaître des substances exogènes et de produire une réponse inflammatoire [15]. Ce sujet sera revu plus en détail dans la prochaine section. Le keratinocyte exprime aussi plusieurs intégrines dont les plus citées sont: a2pi, a3pi, a5pi ou a6p4 (hémidesmosome). Dans l'épiderme, on les retrouve presque toujours sur les kératinocytes de la couche basale. Ils sont nécessaires à l'adhésion du keratinocyte à la membrane basale et aux différentes composantes de la matrice extracellulaire, et semblent jouer un rôle décisif dans la prolifération et la différenciation de celui-ci. Il existe différentes conditions où cette expression d'intégrines

17 est perturbée et se poursuit jusque dans les couches supra basales, altérant la prolifération et la différenciation des kératinocytes. Cela a été observé dans le processus de guérison, avec des carcinomes ou dans le contexte de différentes pathologies inflammatoires comme le psoriasis [13, 16-17]. i i Cornified ceil î Granular cell Loricrin Involucrin Fillagrin \ /\ Squamous cell Keratin 1/10 Keratin S/14 «6 integnn (J 1 integrin p63 Self-renewal n Commitment to differentiation t D Pos:-mitotic Keratin 5/14 _ differentiating cell Keratin 1/10 Transit amplifying -plify cell Epidermal differentiation program Expert Reviews in Molecular Medicinee2005 Cambridge University Press Figure 1.3 : La différenciation du keratinocyte dans l'épiderme (Cambridge University Press 2005). 1.2 Le psoriasis Le psoriasis est une dermatose inflammatoire assez répandue qui touche de 2 à 3 % de la population mondiale. C'est une maladie auto-immune chronique d'origine (étiologie) inconnue. Elle se présente le plus souvent sous forme de plaques rougeâtres, recouvertes de squames blanches argentées, aux contours bien distincts des régions non atteintes. Une caractéristique intéressante des lésions est qu'elles sont distribuées de façon symétrique aux

18 parties du corps les plus exposées aux contraintes mécaniques comme les coudes, les épaules, les genoux, la région lombaire ou le cuir chevelu. Le psoriasis peut apparaître à tous âges mais il débute généralement entre 15 et 25 ans et va évoluer sous forme de poussées suivies de rémissions. On constate souvent, chez les patients, des atteintes au niveau des ongles et 10 à 30% développent une arthrite psoriasique sans facteurs rhumatoïdes. La prévalence du psoriasis varie selon un facteur ethnique et il existe des antécédents familiaux dans la plupart des cas, laissant croire à une forte prédisposition génétique. Cependant, l'exposition à des facteurs environnementaux serait nécessaire au déclenchement de la maladie [18-20] Aspects cliniques Le type de psoriasis le plus commun se présente sous forme de plaques, mais il existe d'autres formes avec des aspects bien caractéristiques à chacune [19, 21]. Le psoriasis en plaques peut couvrir de grandes surfaces. Il est localisé surtout au niveau des coudes, des genoux et du cuir chevelu. Il compte pour plus de 80% des cas (Figure 1.4 A et D). Le psoriasis en gouttes compte pour environ 10% des cas. Les lésions ressemblent à des gouttes de 1 à 5 mm et souvent associées à des antécédents d'infection au streptocoque (Figure 1.4 B). Le psoriasis pustuleux est une forme assez rare, seulement 3% des cas. Il se manifeste par l'apparition de pustules disséminées (Figure 1.4 F et G). Le psoriasis inversé apparaît dans les plis comme sous les aisselles et les aines. Il présente peu ou pas de squames. (Figure 1.4 E) Le psoriasis érythrodermique est une forme sévère et rare. C'est une atteinte généralisée sur tout le corps et peut être une des autres formes de psoriasis qui a dégénéré (Figure 1.4 C). Dans certains cas, il est possible d'observer en plus des atteintes au niveau des ongles (Figure 1.4 H, I, J et K).

19 10 Figure 1.4 : Aspect des multiples formes de psoriasis généralement retrouvées dans la population (Schon 2005).

20 Facteurs génétiques Plusieurs indices nous permettent de faire le lien avec une prédisposition génétique dans le psoriasis. Des études familiales ont permis de souligner plusieurs faits intéressants. D'abord la distribution ne se fait pas selon la génétique mendélienne et l'héritage des gènes entre les générations reste obscur. Par exemple, lorsque les deux parents sont atteints environ 50% des descendants développeront la maladie. Cette prévalence chute à 16% quand seulement un parent est atteint et à 8% si aucun des parents n'a la maladie [22]. Aussi, il y a concordance de 35-72% chez les jumeaux homozygotes comparativement à 12-23% chez les dizygotes. L'implication de facteurs environnementaux expliquerait ces différences [18, 23]. Suite à ces découvertes, plusieurs ont entrepris la quête de trouver le ou les gènes susceptibles de causer le psoriasis. Cette quête se poursuit toujours aujourd'hui. En 2005, il y avait au moins neuf loci visés comme étant impliqués dans le psoriasis; nommés PSORS 1-9 (psoriasis susceptibility) (Tableau 1.1) [24]. PSORS1 serait un déterminant majeur puisqu'il compterait pour 30-50% de la susceptibilité génétique. Il se situe dans la région codante du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), spécifiquement dans la région de HLA-Cw6 du CMH I [25-26]. Une découverte intéressante car HLA-C a un rôle dans la présentation d'antigènes, par contre, son implication dans le développement du psoriasis reste incertain. Le locus PSORS 1 recoupe cependant les régions codantes pour d'autres molécules candidates à de futures explorations (Figure 1.5). Un exemple est le CCHCR1 (coiled-coil a-helical rodpotein 1) qui est régulé positivement par ltfn-y. Cette protéine est surexprimée dans le psoriasis et semble influencer la différenciation des kératinocytes au niveau de la couche basale [24]. Une surexpression de cette protéine dans un modèle de souris engendre l'apparition de caractéristiques retrouvées dans le psoriasis comme l'expression des kératines 6, 16 et 17 [27]. Une autre protéine, la cornéodesmosine (CDSN), est surexprimée dans les lésions de patients psoriasiques. Cette surexpression par les kératinocytes des couches supérieures de l'épiderme peut altérer la desquamation normale et causer les squames aberrantes [24].

21 12 Des études récentes sur un large échantillonnage ont permis de confirmer d'autres associations génétiques comme TNFAIP3, une séquence codante pour la protéine A20. Cette protéine est inductible par le TNF-a et elle vient freiner l'action du NF-KP dans la réponse inflammatoire. On y retrouve aussi une association avec la sous-unité p40, une composante de 1TL-12 et l'il-23. LTL-23 est nécessaire à l'obtention d'un profil de lymphocyte Thl 7 retrouvé dans le psoriasis [26, 28]. Plusieurs autres cibles potentielles ont été identifiées. Une meilleure connaissance de la susceptibilité génétique dans le psoriasis pourrait guider les choix thérapeutiques et permettre l'élaboration de nouveaux traitements afin que ceux-ci soient moins généralisés, plus visés. Possiblement faire ressortir des profils de dérèglement et y associer des traitements adéquats. Tableau 1.1: Loci découverts comme étant susceptibles de causer le psoriasis (Bowcock et al. 2005). PSORS locus Emplacement du chromosome Gène associé PSORS1 6p21 CMH de classe 1 Plusieurs PSORS2 17q25 SLC9A3R1 et NAT9 RAPTOR PSORS3 4q HH ND - Population étudiée Américaine Américaine et Britannique PSORS4 Iq21 EDC Italienne et Américaine (non publiée) PSORS5 3q21 SLC12A8 Suédoise PSORS6 19pl3 ND - PSORS7 ip un ND. PSORS9 4q31-4q34 ND - PSORAS1 16ql2 Possiblement NOD2 -

22 13 Chromosome 6 6p21.1-6p21.3 I II 500 1,000 1,500 2, ,000 3,500 kb CLASS II CLASS III CLASS I DP DN DM LMP/TAP DO DQ DR C4 C2 HSP70 TNF B C E A G F J Mill Ullii." " </ a B a H*«PSCRS1 HCG27, POa5F> CCHCFa, SEEK? i srg. H H HLA-B HLA-C CflvX PSCPS1C3 TCF1& SW f CDSN HLA-E Copyright 2C05 Nature Publishing Group Nature Reviews Immunology Figure 1.5 : PSORS 1 et ses composantes inclus dans le gène du CMH (Bowcock et al. 2005) Facteurs environnementaux Les différents facteurs pouvant causer des poussées de lésion ou aggraver l'état d'un patient atteint de psoriasis sont bien connus. Le stress, l'alcool, la cigarette et la prise de médicaments comme les P-bloquants et le lithium en font partie. Les patients atteints du VIH peuvent développer des lésions sévères et difficiles à traiter [29]. Il est difficile de pointer les facteurs initiateurs de lésions psoriasiques. Il est bien établi qu'une infection au streptocoque M peut déclencher le psoriasis. Ce pathogène présenterait un peptide analogue à la kératine 17 humaine [30-31]. L'activation du système immunitaire se ferait suite à la présence d'un super antigène ou par mimétisme moléculaire. Un fait intéressant est que l'on peut remarquer l'apparition de lésions chez un patient psoriasique suite à un stress mécanique subit par la peau ou suite à une blessure cutanée. Cette observation est nommée le phénomène de Koebner [32]. Ceci est utilisé chez les modèles animaux pour déclencher des lésions selon une technique que l'on appelle : «tape stripping».

23 14 Les mécanismes d'action de ces facteurs environnementaux sont peu connus. Cependant, il serait peu probable qu'à eux seuls, sans prédispositions génétiques, ils puissent initier le psoriasis. C'est plutôt une association de plusieurs faibles dérèglements génétiques combinés à des facteurs environnementaux qui mèneraient à une perte de tolérance au soi et la difficulté à éteindre la réponse inflammatoire Le système immunitaire L'être humain ainsi que les autres vertébrés, se protègent par un réseau complexe de mesures défensives dénommées : «système immunitaire». C'est un système de défense remarquablement adaptatif. Il est capable de faire la discrimination entre des molécules, des cellules ou des protéines d'organismes étrangers et de fournir une réponse effectrice en vue de neutraliser ces envahisseurs. L'immunité a deux composantes : l'immunité innée et l'immunité acquise L'immunité innée La composante innée du système immunitaire comporte un ensemble de mécanismes de défenses qui ne sont pas spécifiques à un pathogène en particulier. Cependant elle offre une défense à action rapide et étendue. Cette composante de l'immunité comprend les phagocytes, les cellules NK et certaines voies du complément. La réponse commence bien sûre par la reconnaissance de molécules étrangères appelées PAMP (Pathogen-associated molecular patterns). Des cellules du système immunitaire inné, comme les macrophages ou les cellules dentritiques, vont exprimer une famille de récepteurs appelés PRR (Pattern-recognition receptors) pouvant fixer ces PAMP. Les PRR les plus étudiés sont de la famille des TLR (Toll-like receptors). Ces TLR vont réagir à des composantes telles que les peptidoglicans, le LPS, des acides nucléiques microbiens et autres composantes bactériennes. L'activation de ces TLR va engendrer l'expression de

24 15 cytokines inflammatoires, de molécules de co-stimulation et de molécules d'adhésion. Cela va favoriser la phagocytose et l'entrée de leucocytes comme le neutrophile dans le tissu. De plus, l'activation des TLR va aider à la présentation d'antigènes par le CMH contribuant ainsi à l'activation de la composante acquise du système immunitaire [33-34] La cellule NK (natural killer) peut reconnaitre le CMH de classe I présent sur tous les types cellulaires. Son activation se fait cependant à l'inverse du CD8+ dans l'immunité acquise. Quand la cellule NK reconnaît une CMH I du soi, un signal inhibiteur est transmis et rien ne se passe. Si le NK ne rencontre pas de CMH I sur la cellule alors il y a activation de la cellule NK. Une fois activée, elle libère des perforines et granzymes qui vont induire la mort cellulaire par apoptose. Ce mécanisme est efficace pour détruire des cellules tumorales ou infectées par un virus qui empêcherait l'expression du CMH [35]. L'activation du complément peut se faire selon 3 voies : la voie classique, la voie alternative et la voie des lectines. Cette activation va mettre en jeu plusieurs protéines qui vont s'assembler en une cascade d'événements ayant comme but commun la formation du complexe d'attaque membranaire (MAC). Ce MAC est en fait un pore qui va s'insérer dans la membrane du pathogène et provoquer la lyse. Chacune des voies est activée différemment mais elles vont tous converger vers la protéine C3. La voie classique nécessite la présence d'anticorps sur le pathogène, tandis que les voies alterne et des lectines peuvent s'activer au contact direct de pathogènes. En plus de provoquer la lyse de pathogènes, les composantes C3a et C5a vont agir comme chimiokines favorisant le recrutement de neutrophiles et de monocytes [36] L'immunité acquise L'immunité acquise est capable de reconnaître et d'éliminer sélectivement des microorganismes ou des antigènes étrangers. Elle possède les propriétés de pouvoir reconnaître le soi et le non soi, d'avoir une spécificité antigénique, une grande diversité, ainsi qu'une mémoire immunitaire. Ce système repose essentiellement sur la maturation et l'action des lymphocytes. Tous les lymphocytes proviennent de précurseurs lymphoïdes. Les

25 16 lymphocytes B vont maturer dans la moelle osseuse tandis que les précurseurs des lymphocytes T vont migrer vers le thymus. À ce stade, le récepteur Notch dicterait le choix de différenciation entre les deux types [37]. Une fois dans le thymus, le précurseur du lymphocyte va prendre le nom de thymocyte et passer par différents réarrangements des composantes a et P de son récepteur TCR. On estime que grâce à ce réarrangement du Q fi TCR, le lymphocyte T peut reproduire 10 spécificités antigéniques et le lymphocyte B, 10 par son BCR [38]. Avant d'atteindre la circulation, le lymphocyte T doit passer par une étape de discrimination dans le thymus. Il doit, par son récepteur TCR, être capable de reconnaître une molécule du CMH du soi (sélection positive). Les lymphocytes T ayant une trop forte affinité pour le CMH et les antigènes du soi sont éliminés par apoptose (sélection négative). Cette discrimination permet de produire des lymphocytes T capables d'interagir avec les CMH du soi sans être auto réactifs protégeant l'organisme des maladies auto-immunes. Le choix de l'engagement en CD4+ ou CD8+ n'est pas bien défini. (b) Cellule!',, Cellule présentatrice dé lantigene/ f Cellule T, Cellule cible Figure 1.6 : La synapse immunologique entre CPA-Th (à gauche) et cellule cible-tc (à droite) (RA. Goldsby, T.J. Kindt, B.A. Osborne, Immunologie. 2001).

26 17 Les molécules du CMH de classe I sont exprimées par toutes les cellules nucléées du corps, alors que les molécules du CMH de classe II se retrouvent principalement sur les cellules dendritiques, les macrophages, les lymphocytes et les cellules épithéliales, suite à une stimulation. Les molécules de CMH ont comme fonction de présenter des antigènes du soi et étrangers. Ils peuvent présenter des peptides d'environ 8 à 20 acides aminés, selon le type de CMH, dans un sillon appelé niche peptidique, formé selon le repliement de chaines moléculaires. Il existe une importante variabilité génétique dans les gènes du CMH et la combinaison des alleles des deux parents font en sorte qu'une personne peut exprimer jusqu'à 6 CMH I et 12 CMH II. Les deux classes de CMH vont apprêter et présenter l'antigène selon des processus différents. Le CMH I va plutôt favoriser la présentation d'antigènes provenant d'infections intracellulaires tandis que le CMH II va présenter des produits de dégradations suite à la phagocytose. Le CMH I sera reconnu par le lymphocyte CD8+ et le CMH II par le CD4+. La figure 1.6 présente bien les molécules importantes impliquées dans la synapse immunologique. L'activation d'un CD4+ par une cellule présentatrice d'antigène se passe généralement comme suit : le TCR du CD4+ va reconnaître l'antigène fixé au CMH II de la cellule. Cette rencontre, avec l'aide de la costimulation par les récepteurs B7 et CD28, va augmenter l'affinité des intégrines LFA et ICAM-1 qui vont s'organiser et solidifier la liaison. Cette action va aussi permettre la liaison entre le CD40 et le CD40L du CD4+, un ligand important dans le développement du lymphocyte. Il en résulte la prolifération de cellules effectrices et de cellules mémoires. La fin de l'activation se fait par le remplacement de CD28 par CTLA-4 entraînant l'anergie ou l'apoptose du lymphocyte [38]. Selon la nature de l'activation, le lymphocyte CD4+ va se développer en l'une des différentes sous-populations avec des profils de cytokines propres à chacune. La présence d'il-12 et d'ifn-y favorisent la sous-population Thl et la sécrétion d'ifn-y alors que IL-4, IL-5 et IL-13 font pencher la balance pour la sous-population Th2 et la production d'il-4. Le rôle principal du Th2 est lié à l'activation des lymphocytes B et la réponse humorale. De nouvelles sous-populations ont été découvertes récemment comme le Thl 7 et le Th22. La combinaison d'il-6 et IL-23 semble favoriser le Thl7. Le Th22 lui semble être dépendant de 1TL-22. On suspecte ces sous-populations d'être impliquées dans les maladies auto-immunes [39-40]. Un autre type de lymphocytes T CD4+ est appelé T

27 18 régulateur (Treg). Son rôle serait de freiner la réponse immunitaire en produisant des cytokines comme 1TL-10 et le TGF- 3. Aussi, il provoquerait l'apoptose ou l'anergie de lymphocytes T activés en exprimant CTLA-4. Certains croient que ces Treg proviendraient des restes de la sélection négative dans le thymus. Même si ces Treg ne peuvent proliférer par activation du TCR, ils sont une bonne protection contre l'auto-immunité [41]. Le neutrophile a toujours été reconnu comme phagocyte faisant partie entièrement de l'immunité innée. Sa sensibilité et sa rapidité à répondre aux chimiokines, font de lui le premier leucocyte à être présent dans bien des contextes inflammatoires. Il est facile à reconnaître car il présente souvent un noyau irrégulier et polylobé. Le neutrophile peut répondre de plusieurs façons à un pathogène, soit par des substances oxydantes ou encore par une gamme de molécules cytotoxiques contenues dans des granules qu'il va relâcher par dégranulation. Néanmoins, le neutrophile semble avoir un rôle beaucoup plus grand et varié que l'on croyait lorsqu'il est placé dans des situations inflammatoires comme c'est le cas avec le psoriasis ou l'arthrite rhumatoïde. Il semble former une population non uniforme avec différentes fonctions adaptées au contexte. Par exemple, sous l'influence de cytokines inflammatoires, on constate déjà une survie prolongée de celui-ci, mais aussi l'expression de CMH de classe II en plus des molécules de co-stimulation comme B7. Alors, le neutrophile ne fait pas que favoriser le recrutement et l'activation des cellules dendritiques et lymphocytes T, il peut agir comme une cellule dendritique et présenter l'antigène. C'est un rôle important pour joindre l'immunité innée à l'immunité acquise [42] Histopathologic et formation des plaques Il est certain que de nombreuses comparaisons on été faites entre une peau lésionnelle de patient psoriasique et une peau normale. Ce que l'on observe dans une peau lésionnelle c'est une hyperprolifération des kératinocytes. Les kératinocytes passent de la couche basale à la couche cornée en seulement 3-5 jours dans une lésion contrairement à jours pour une peau saine. Cela réduit de beaucoup le temps de maturation et explique l'absence de la couche granuleuse [19]. On y retrouve aussi l'expression aberrante des

28 19 kératines 6 et 16 caractéristiques d'une hyperprolifération [19, 43-44]. L'augmentation et la dilatation des vaisseaux superficiels sont en accord avec l'afflux de cellules immunitaires. Une grande quantité de lymphocytes T CD4+ et CD8+ sont présents dans le derme des lésions [45]. On estime que pour un patient atteint d'environ 20%, 8 milliards de lymphocytes circulent dans le sang tandis qu'environ 20 milliards seraient situés dans les lésions [20]. La majorité de ces lymphocytes font partie d'une population mémoire affichant le CLA (cutaneous lymphocyte antigen), cellules normalement impliquées dans l'immuno-surveillance de la peau. Comme la plupart de ceux-ci sont différenciés en type 1 (Thl et Tel), ils vont donc produire de l'ifn-y [46-48]. Un afflux de neutrophiles est souvent observé dans les lésions. Une chimiokine clé dans le recrutement des neutrophiles est 1TL-8 qui peut justement être induite par une stimulation à l'ifn-y [49]. Un autre type cellulaire est retrouvé en quantité anormalement élevée dans les lésions psoriasiques. Il s'agit des cellules dendritiques. On estime que la quantité de cellules dendritiques dans les lésions est égale ou supérieure à celle des lymphocytes T. Pourtant, on en retrouve normalement moins en circulation [20]. On peut ressortir 3 types différents de cellules dendritiques. Il y a les myéloïdes immatures (idc), les myéloïdes matures (mdc) et les plasmacytoïdes (pdc). L'importance de ces cellules est la capacité qu'elles ont d'efficacement présenter des antigènes aux lymphocytes T et de les activer. Suite à ces découvertes, une hypothèse cohérente sur la formation des plaques a été formulée. Cette hypothèse tend à faire le lien entre la présentation d'antigène, la diversité de cytokines et facteurs de croissance impliqués, ainsi que le phénotype d'hyperprolifération observé (Figures 1.7 et 1.8). Voici un résumé des différentes étapes : tout d'abord, il y a reconnaissance d'un antigène, possiblement du soi (Kl3, Kl 7 ou autre) par une cellule présentatrice d'antigène. Celle-ci s'active et quitte la peau afin de migrer vers les organes lymphoïdes secondaires afin d'y rencontrer un lymphocyte T naïf CD45RA+/CLA-. Suite à l'activation de ce lymphocyte, maintenant CD45RO+/CLA+, ce dernier va proliférer, quitter l'organe lymphoïde par la circulation sanguine et se rendre au site d'inflammation en suivant le gradient de chimiokines. Une fois rendu dans le derme ou l'épiderme, il produit des cytokines inflammatoires comme l'ifn-y et IL-17. Ces cytokines

29 20 Antigen Psoriatic plaqi Activation Of CD45RO+ Vigorous cytokine release / ^Antigen/ M MHC complex Migration through ^_j afferent lymphatics ** Figure 1.7: Hypothèse de formation des lésions psoriasiques (J Eur Acad Dermatol Venereol 2003,17: 257). agissent sur les kératinocytes et fibroblastes en passant par la voie de STAT1 et potentialisent la réponse inflammatoire de diverses façons [50]. LTFN-y augmente entre autres l'expression des CMH de classe II et des molécules d'adhésion comme I-CAM sur les cellules présentatrices d'antigènes et les kératinocytes [51-52]. LTFN-y avec le TNF-a vont, ensemble, engendrer la production d'une grande variété de cytokines et facteurs de croissance qui vont agir directement sur la croissance et la différenciation des kératinocytes [53-54]. La figure 1.8 présente quelques cytokines et molécules d'adhésion qui sont impliquées dans les différentes étapes de formation des plaques. Une grande quantité de cellules inflammatoires comme les neutrophiles vont s'installer dans la lésion en réponse aux diverses chimiokines. D'autres lymphocytes T activés viendront contribuer à perpétuer le profil Thl /Tel et l'inflammation dans la lésion. Le TNF-a occupe une place importante dans le psoriasis. Les traitements anti-tnf ont prouvé leur efficacité dans de nombreux cas [55]. Le TNF-a va permettre, par l'action de son récepteur et via NF-KP, la production

30 21 de cytokines comme IL-1 et IL-6, ainsi que l'expression d'intégrines notamment par les vaisseaux sanguins. Cependant, l'importance de son implication dans le psoriasis n'est pas encore clairement définie [50, 56]. Figure 1.8 : Aperçu du réseau de médiateurs chimiques et molécules d'adhésion impliqués dans le psoriasis (J Clin Invest June 15, 113: 1664) Interactions cellulaires dans le psoriasis Un fait intéressant avec le psoriasis est que contrairement à la plupart des maladies autoimmunes, l'implication du système immunitaire n'est pas destructeur mais encourage plutôt une prolifération qui serait sensible à des stimuli activateurs. Il est difficile d'identifier exactement ce qui déclenche les lésions. Certains croient que le keratinocyte est en cause et que le système immunitaire est secondaire tandis que d'autres croient plutôt l'inverse [57].

31 22 D'autres pistes intéressantes et plausibles pouvant contribuer à la pathologie du psoriasis, sont ici présentées. Les cellules dendritiques immatures (idc) CDllc+ peuvent, suite à un signal de danger, produirent de 1TL-12 et se développer en cellules matures (mdc) CD83+. Ces dernières sont des cellules présentatrices d'antigène par excellence qui sont capables de produire de 1TL-23 et d'activer le lymphocyte T. LTL-12 et 1TL-23 sont les cytokines permettant l'emprunt de la voie Thl et Thl 7 respectivement [58-59]. En ce qui concerne les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pdc), elles sont moins abondantes que les 2 autres types, cependant lorsqu'elles sont activées, produisent directement de l'ifn-a, un interferon de type I capable d'engendrer presque toutes les activités des autres interférons [60]. Comme les mdc ont tendance à se regrouper autour des vaisseaux sanguins, il n'est pas impossible que ces cellules puissent développer des fonctions similaires aux organes lymphoïdes secondaires en activant directement sur place, les lymphocytes T [24]. L'expression de CD94 par des lymphocytes dans l'épiderme psoriasique laisse croire à la présence de cellules NK-T. Cette présence de cellules NK-T n'a jamais vraiment été vérifiée. La cellule NK-T peut reconnaître un glycolipide présenté par la molécule CDld. Cette cellule, ainsi activée, se met à produire de ltfn-y. Comme le CDld est fortement exprimé par les kératinocytes psoriasiques, cette hypothèse reste valable [61-62]. Une autre théorie repose sur le fait que les lymphocytes CD8+ peuvent pénétrer dans l'épiderme grâce à l'expression de l'intégrine aep7 sur leur membrane [63-64]. Cette intégrine lie la protéine e-cadherine associée aux desmosomes [20, 65]. L'hypothèse est que l'afflux important de lymphocytes CD8+, traversant la membrane basale de l'épiderme, puisse causer des dommages à cette dernière en plus de détruire plusieurs desmosomes liant les kératinocytes. Ces dommages ainsi causés seraient assez puissants pour engendrer un état de réparation tissulaire dans l'épiderme. Les TLR7 et TLR9 reconnaissent des bouts d'adn viral et microbien. Normalement l'adn du soi libéré lors de bris cellulaires est toléré, car il n'entre pas facilement dans une

32 23 cellule. LL37 est un peptide antimicrobien continuellement surexprimé dans les lésions psoriasiques [66]. Comme ce peptide est fortement exprimé, il pourrait, par sa charge et sa forme en hélice a, lier de l'adn du soi et le présenter aux TLR9 endosomales. Le TLR9 par la voie impliquant MyD88 et IRF7 déclenche la production d'ifn-a notamment par les pdc. Cette théorie est intéressante car elle pourrait expliquer l'apparition de lésions lors de dommage tissulaire (phénomène de Koebner) [67-68]. Il existe tout de même des faits probants que le psoriasis ne viendrait pas uniquement d'un dérèglement des cellules épithéliales mais aussi des cellules immunitaires. Bien entendu, l'efficacité des traitements immunosuppresseurs sur le psoriasis donnent déjà de bons indices. Cependant on ne vient peut-être traiter que les conséquences du dérèglement en éteignant la réponse inflammatoire. Des observations réalisées lors d'interventions de greffes de moelle osseuse amènent des preuves plus convaincantes. Eedy et al. rapportent un cas où un homme, souffrant de psoriasis sévère, a reçu une greffe de moelle osseuse pour une leucémie et fut complètement débarrassé de son psoriasis [69]. Un autre cas rapporté d'une femme sans histoire de psoriasis fut greffée de moelle osseuse d'un patient psoriasique et développa par la suite la maladie [70] Traitements L'histoire de la thérapeutique du psoriasis a toujours démontré une incertitude face aux cibles à traiter. Plusieurs traitements ont été découverts par chance mais maintenant avec une connaissance grandissante de la maladie, il est possible de développer de nouvelles stratégies. Aujourd'hui nous possédons tout de même plusieurs outils afin de contrôler du mieux possible la maladie et d'offrir aux patients une meilleure qualité de vie. Toutefois, on estime que 70 % des patients sont peu satisfaits de leurs traitements [71]. Aucun traitement ne permet de guérir complètement du psoriasis. Voici les différentes catégories de traitements utilisés à l'heure actuelle.

33 24 Les agents topiques : Ces préparations sont employées lors de cas léger ou modéré et peuvent être utilisées en combinaison avec la photothérapie et les traitements systémiques [72]. Les préparations goudronnées sont utilisées depuis plus de 100 ans. Les produits raffinés sont plus appréciés mais leur action antiproliferative est moins efficace que le produit brut. Ils sont plus efficaces en combinaison avec la photothérapie mais augmentent le risque de cancer de la peau [73-74]. Les glucocorticoïdes sont connus pour leurs effets anti-inflammatoires et vasoconstricteurs. Ils semblent agir en supprimant l'action de facteurs de transcription comme AP-1 et NF-KP limitant ainsi la production de cytokines pro-inflammatoires [75]. Les préparations topiques de vitamine A (rétinoïdes) et analogues à la vitamine D vont agir sur les kératinocytes et possiblement les lymphocytes T des lésions. Ils vont réduire la prolifération, réguler la différenciation cellulaire et diminuer l'inflammation [76-77]. La photothérapie : Les traitements UVB ou UVA avec psoralène sont assez efficaces. Ils ont un effet immunosuppresseur en induisant l'apoptose des lymphocytes et en diminuant l'expression des molécules du CMH et de co-stimulation [78]. Les agents systémiques : Le methotrexate est un antiprolifératif puissant. Son action inhibe la synthèse des purines et pyrimidines empêchant la formation d'adn et d'arn. Il semble aussi promouvoir la voie Th2 des lymphocytes T [79-80]. La cyclosporine et autres inhibiteurs de la calcineurine phosphatase agissent sur l'activation des lymphocytes T. L'inhibition de la calcineurine phosphatase bloque la translocation du NFAT et du fait même la production entre autres d'il-2, d'ifn-y ou du récepteur de l'il-2.

34 25 Dermilex (XP-828L) provient du lactosérum de vache. Des tests in vitro ont montré qu'il inhibe la production d'une réponse Thl par les lymphocytes T. Une étude en double aveugle présente son efficacité dans le psoriasis [81]. Comparativement aux autres traitements, c'est un produit sécuritaire. Il pourrait alors être combiné à l'un de ces derniers. Les agents biologiques : Ce sont de nouveaux traitements visant généralement à empêcher l'activation des lymphocytes en agissant au niveau de la synapse immunologique. D'autres permettent de séquestrer des médiateurs chimiques de l'inflammation comme le TNF. Les sites d'actions de quelques-uns de ces agents sont représentés à la figure 1.9. Ethanercept est une protéine de fusion dimérique complètement humanisée. Elle est générée par la fusion de 2 unités p75 du récepteur soluble de TNF avec un IgGl humain. Cette protéine va se lier par compétition avec le TNF-a et P circulant ainsi que celui membranaire [82]. Infliximab est un anticorps monoclonal chimérique (souris/humain) avec une grande spécificité, affinité et avidité pour le TNF-a [83]. Diverses études ont démontré son efficacité à réduire l'inflammation dans le psoriasis [84]. Alefacept est une protéine de fusion LFA-3/IgGl qui se fixe au CD2 du lymphocyte, intervenant ainsi dans la présentation de l'antigène. Une autre propriété importante est qu'il va induire l'apoptose de lymphocytes mémoire CD45RO+ [85]. Efalizumab est un anticorps monoclonal humanisé dirigé contre le CD1 la de l'intégrine LFA-1. Cet anticorps va empêcher la liaison de LFA-1 à ICAM-1 des cellules endothéliales, contrant ainsi la migration des lymphocytes dans l'épiderme [86]. CTLA4Ig est une protéine chimérique soluble constituée de CD 152 humain avec une portion Fc d'un IgGl. Elle va lier les récepteurs de co-stimulation B7-1 et B7-2 sur les cellules présentatrices d'antigènes empêchant l'activation de lymphocytes T par le CD28 [87].

35 26 OKTcdr4A est un anticorps IgG monoclonal dirigé contre CD4 des lymphocytes T. Son action empêche l'activation par le CD4 sans détruire la cellule. Son utilisation est sécuritaire et pourrait donner des rémissions durables [84]. Copyright G 2005 Nature PubSsMng Group Nature Reviews Immunology Figure 1.9 : Interactions des agents biologiques dans la synapse immunologique (Bowcock et al. 2005).

36 Génie tissulaire Le génie tissulaire, selon les Dr Joseph Vacanti et Robert Langer (Massachusetts Institute of Technology), est un champ multidisciplinaire qui applique les principes de l'ingénierie et des sciences de la vie vers de développement de substituts biologiques qui restaurent, maintiennent ou améliorent la fonction d'un tissu ou d'un organe complet. Au tout début de cet axe de recherche dans les années 70, cela relevait beaucoup plus de la fiction. Une des grandes difficultés rencontrées à l'époque était la nécessité d'un support cellulaire adéquat et non immunogène. C'est la combinaison des techniques de cultures cellulaires à des supports de matériaux organiques qui ouvrirent la voie à ce domaine prometteur. À ce jour, plusieurs tissus et structures fonctionnelles ont pu être réalisés et testés en clinique (peau, cornée, cartilage, valve cardiaque, vaisseau sanguin) [88-89]. Un des problèmes que l'on rencontre aujourd'hui est lié à l'irrigation et l'apport en oxygène et nutriments dans des tissus plus larges et complexes. Plusieurs recherches se font à ce sujet avec des avancées énormes dans ce domaine [90]. Avec la demande grandissante en organes à des fins de transplantation, la médecine regenerative est une voie d'avenir qui peut et pourra redonner espoir à des gens atteints de troubles de la santé qu'aucun autre domaine ne pourrait traiter. Un exemple concret de l'utilisation du génie tissulaire en clinique est la demande de greffons de peau chez les patients grands brûlés. Ces patients doivent recevoir rapidement une greffe de peau afin de prévenir la perte de liquide et les infections. Une technique de reconstruction in vitro d'une peau tridimensionnelle exprimant les différents marqueurs de différenciation, et ce, sans l'aide d'un support exogène a été élaborée dans les laboratoires du LOEX [91]. Cela permet de produire des greffons de peau avec des cellules autologues, évitant les rejets associés aux greffes de peau. Depuis quelques années, cette méthode d'auto-assemblage a permis à notre équipe de développer un modèle de peau psoriasique présentant plusieurs des caractéristiques de la maladie [92]. Comme l'obtention d'échantillons de peau psoriasique est limitée et très coûteuse, ce modèle pathologique pourrait, dans un futur proche, servir à l'élaboration et aux tests de nouveaux traitements ainsi qu'à mieux comprendre la pathophysiologie du psoriasis.

37 Problématique et objectifs Le psoriasis ne possède pas de modèle animal de recherche présentant les dérèglements à la fois génétiques et immunitaires de la maladie. Cela vient du fait que c'est essentiellement une maladie humaine qui n'est pas retrouvée chez l'animal [18]. Comme le psoriasis est polygénique, tout essai de produire un modèle transgénique représentatif a échoué. Plusieurs modèles de souris knock-out présentant des phénotypes ressemblant au psoriasis ont tout de même apportés des informations pertinentes et des pistes intéressantes. Les modèles de xénogreffe d'échantillon de peau humaine psoriasique chez la souris (SCID- Hu) sont les seuls qui peuvent reproduire l'ensemble des désordres génétiques cutanés. Cependant, le système immunitaire chez la souris répond différemment de celui de l'humain et ce modèle ne permet pas non plus d'étudier le trafic cellulaire entre les cellules circulantes et les lésions. De plus, le problème pour obtenir des greffons de peau pathologique persiste [93]. Le modèle in vitro de peau psoriasique produit par la méthode d'auto-assemblage du LOEX reproduit plusieurs caractéristiques de ce désordre cutané. Il a été démontré précédemment, par différents exemples, que le système immunitaire joue un rôle important dans l'initiation et la persistance de la pathologie avec l'infiltration de cellules immunitaires dans les lésions. Le lymphocyte T est un acteur de premier plan dans la communication kératinocyte-lymphocyte. L'objectif général de mon projet de maîtrise a été de vérifier si l'interaction entre les kératinocytes psoriasiques et les lymphocytes était fonctionnellement pathologique dans notre modèle. 1- Le premier objectif spécifique a été de comparer la survie cellulaire in vitro de cocultures kératinocytes-lymphocytes à l'aide de différentes populations cellulaires. 2- Le second objectif à été de caractériser l'expression différentielle des cytokines et facteurs de croissance au cours de l'interaction kératinocytes-lymphocytes, ainsi que l'influence de cette interaction sur l'ajout d'autres cellules immunitaires comme les neutrophiles.

38 Chapitre 2 : Matériel et méthodes 29

39 Extraction et culture cellulaire Afin d'atteindre ces objectifs, des populations de kératinocytes sains et psoriasiques ont été mises en culture monocouche avec des lymphocytes pendant 14 jours. Au jour 14, il a été possible de mesurer la survie de chaque type cellulaire à l'aide d'un appareil de cytometric Les surnageants de ces cultures furent récoltés à différents jours, ce qui a permis de poursuivre avec le second objectif et de visualiser l'ampleur de cette communication cellulaire par des dosages réalisés avec l'appareil Luminex et la technique ELISA. Suite à ces découvertes, il fut pertinent d'introduire le neutrophile au modèle Extraction des kératinocytes Les kératinocytes ont été obtenus à partir de biopsies de peau provenant de trois femmes saines et de cinq patientes atteintes de psoriasis. Les cellules humaines normales sont collectées suite à une réduction mammaire tandis que les cellules humaines psoriasiques proviennent d'un punch de 6 mm fait sur des plaques chroniques. Un formulaire de consentement à la recherche a été signé par chaque participante. Les kératinocytes ont été récoltés selon la technique décrite par Germain et al [94]. De ces cellules, les passages (P) de 0 à 3 ont été conservés dans l'azote liquide jusqu'à leur utilisation. Toutes procédures impliquant des patients sont en accord avec la déclaration d'helsinki et ont été réalisées selon le guide de recherche du comité d'éthique du Centre hospitalier affilié universitaire de Québec. Tableau 2.1 : Caractéristiques des populations cellulaires psoriasiques utilisées. Population Âge de la Site de la Étendue du Passage cellulaire patiente biopsie psoriasis utilisé (P) KL.Ç35 35 dos 40% 3 KLÇ65 65 dos 20% 3 KLÇ69 69 dos 15% 3 KL?46 46 dos 15% 3 KLÇ47 47 cuisse 20% 3

40 Isolation des cellules mononucléées périphériques du sang (PBMC) Les PBMC ont été isolées du sang de donneurs sains par une méthode ayant recours au Ficoll-Hypaque. Cette méthode s'exécute par centrifugation du sang sur un gradient de polysaccharides de différentes densités. Elle permet la formation d'une phase en forme d'anneau bien distincte, tout en laissant les erythrocytes et les granulocytes dans le culot (Figure 2.1). La méthode est bien décrite dans Chakravarti et al., et nous y avons apporté quelques légères modifications [95]. Le sang n'a pas été dilué dans le HBSS avant d'être déposé sur le Ficoll-Hypaque et le a-mem a été utilisé comme milieu de culture et non le RPMI. Le a-mem est favorable car il contient uniquement les éléments minimaux permettant la survie des lymphocytes jusqu'à leur transfert en plaques. Sang Ficoll Centrifugation - Sérum Monocytes et - lymphocytes Ficoll - Erythrocytes et granulocytes Figure 2.1 : Schématisation de la méthode de séparation des PBMC du sang sur Ficoll- Hypaque. Des adhérences d'une, de deux et de vingt-quatre heures ont été faites en flacons de 75 cm afin de séparer les monocytes des lymphocytes. Les monocytes adhèrent au plastique du flacon ne laissant que les lymphocytes dans le surnageant. Les lymphocytes sont récupérés avec le surnageant pour la suite des expériences. Cette technique nous permet d'obtenir une population cellulaire exprimant à % le CD3 avec moins de 1 % de monocytes (résultats non présentés).

41 Milieu de culture utilisé Les cellules ont été cultivées tout au long de l'expérience dans un milieu 3:1 Dubelcco- Vogt modified Eagle's medium (DMEM) : Ham's F12 (H) medium (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) additionné de 5% de sérum de veau reconstitué Fetal Clone II (Hyclone, Scarborough, ON, Canada), de 5 pg/ml d'insuline (Sigma Chemicals, St-Louis, MO), de 0,4 pg/ml d'hydrocortisone (Cedarlane, Hornby, ON, Canada), de 10" 10 M de toxine du choléra (ICN Biochemical, Montréal, Qc, Canada), de 10 ng/ml de facteur de croissance épidermique (EGF) (Austral Biological, San Ramon, CA), 100 Ul/ml de pénicilline (Sigma) et de 25 pg/ml de gentamicine (Schering, Pointe-Claire, Canada). 2.2 Réalisation des co-cultures kératinocytes-lymphocytes en monocouche Les cultures en monocouche ont été réalisées dans des plaques 6 puits pour la culture cellulaire. L'ensemencement des kératinocytes en P3 s'est fait à une densité de l,3xl0 4 cellules/cm 2 sur une couche nourricière de fibroblastes de souris 3T3 irradiés, à une densité de 2,0x10 4 cellules/cm 2. Les lymphocytes ont été ajoutés à raison de 2,0x10 6 par puits. Des puits ensemencés uniquement de kératinocytes ou de lymphocytes ont servi de contrôles. LTL-2 est une cytokine des plus étudiées et, parmi ses fonctions, elle favorise entre autres la survie et la prolifération des lymphocytes T [96]. Il a semblé alors judicieux de l'inclure à notre projet en testant l'ajout de 30 U/ml d'il-2 humaine (R&D Systems Burlington, ON, Canada) au milieu de culture. Les 6 conditions suivantes ont été faites en duplicata pour chaque expérience. Kératinocytes + 3T3 dans du milieu sans IL-2 (-IL-2) Kératinocytes + 3T3 dans du milieu avec IL-2 (+IL-2) Kératinocytes + 3T3 + lymphocytes T dans du milieu sans IL-2 (-IL-2) Kératinocytes + 3T3 + lymphocytes T dans du milieu avec IL-2 (+IL-2) Lymphocytes T dans du milieu sans IL-2 (-IL-2) Lymphocytes T dans du milieu avec IL-2 (+IL-2)

42 33 L'incubation des cultures s'est faite dans un environnement à 37 C avec 8% CO2. Les milieux de culture ont été changés à unefréquencede 3 fois par semaine en retirant 1 ml et en ajoutant 1 ml de milieu frais sur 2 ml total de milieu. Pour les changements de milieu des jours 3, 8 et 13, les surnageants ont été récoltés sur glace, centrifugés à rpm pendant 5 min à 4 C et rangés à -80 C. 2.3 Cytometric en flux (FACS) Au jour 14 de chaque expérience, les surnageants de chacun des puits furent transférés dans des tubes. Les cellules furent trypsinées et ajoutées aux surnageants pour ensuite être lavées au PBS IX. Les cellules ont ensuite été marquées à l'annexine V-FITC et l'iodure de propidium. Le tout a été fait selon les indications du fournisseur R&D Systems Inc, Minneapolis, MN. Suite à ce double marquage, les analyses ont été réalisées avec un appareil FACS Calibur (Becton Dickinson). Les kératinocytes et les lymphocytes étaient facilement identifiables les uns des autres. Les résultats sont représentés par un pourcentage d'apoptose total en additionnant l'apoptose précoce et l'apoptose tardive. 2.4 Luminex et plaque multiplex La technique de dosage par ensemble de micro billes multiplex combine la technologie du dosage ELISA à celle de la cytometric en flux. Il s'agit en fait de billes de 5,6 microns remplies defluorophoresselon différentes concentrations de rouge et d'infrarouge pouvant ainsi créer jusqu'à 100 teintes différentes. Chaque bille d'une teinte particulière peut être couplée à un anticorps, un récepteur ou un peptide qui va fixer spécifiquement une substance à doser dans un échantillon. Il est alors possible de mélanger des billes de différentes teintes pour se construire un profil de molécules à doser dans un même échantillon. La technique s'exécute comme un ELISA sauf pour les lavages et la lecture. Les échantillons sont déposés dans une plaque 96 puits spéciale dont le fond des puits est en fait un filtre poreux ne laissant pas passer les billes. Les lavages se font alors par aspiration en-dessous de la plaque. La lecture s'effectue à l'aide d'un appareil luminex 100

43 34 (Luminex corporation, Austin, Tx, USA) et les analyses à l'aide du logiciel liquichip (Qiagen, Mississauga, ON, Canada). Cet appareil fonctionne sensiblement comme un appareil de cytometric en flux. En aspirant l'échantillon, un laser va identifier chaque bille par sa teinte et un autre laser va donner une mesure de la fluorescence émise. La sensibilité de la technique varie selon la substance mais se situe généralement entre 3 et 30 pg/ml pour une courbe standard de 3,2 à pg/ml. Le profil de 19 cytokines a été analysé dans les surnageants au jour 13 des cultures. Seulement les surnageants du jour 13 ont été dosés pour le moment car cette technique est très rapide mais dispendieuse. Pour cette analyse, nous avons choisi 2 populations de kératinocytes normaux (K$18, KÇ26) ainsi que 2 populations de kératinocytes psoriasiques (KLÇ35, KLÇ65) pour 8 populations de lymphocytes différentes. Un ensemble de 19 cytokines de profil Thl (TNF-a, IL-6, IL-8, IL-la, p, IL-12, IL-15, IL-17, IFN-y, IP-10, MCP-1, GMC-CSF, sil-2ra et fractalkine), Th2 (IL-4, IL-10, IL-3, IL-IRa et eotaxine) et certains facteurs de croissance (VEGF et FGF2), tous en lien avec la pathologie, ont été retenus pour ces analyses. Les résultats les plus intéressants seront présentés à la section résultats. 2.5 Dosage par ELISA Les cytokines qui n'ont pas été incluses dans les dosages (IL-IRa) et celles qui dépassaient les limites de la technique du luminex (IL-8, MCP-1) ont été complétées par la méthode ELISA. Les dosages qui seront présentés à la section 2.6, ont aussi été faits par cette technique. Les mesures dtl-ira ont été obtenues d'un kit ELISA commercial (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). La concentration minimale détectable avec ce kit était de 39,06 pg/ml. Il n'y avait aucune réaction croisée connue avec d'autres cytokines comme l'il-la, l'il-lp et 1TL-1 srii. Le kit ELISA pour IL-8 (Biosource International, Camarillo, CA, USA) avait une détection minimale de 12,5 pg/ml. Les kits ELISA pour MCP-1, IFN-y et IL-6 (ebioscience, San Diego, CA, USA) avaient les détections minimales de 7,0 pg/ml, 4,0 pg/ml et 2,0 pg/ml respectivement. En ce qui concerne le kit ELISA de la fractalkine (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), la détection minimale était de 39,06 pg/ml. Tous les ELISA ont été faits selon les instructions des fabricants et en duplicata pour chaque surnageant.

44 Co-cultures avec inserts Pour cette expérience de co-culture avec inserts, une population de kératinocytes psoriasiques (KL$65) a été placée en culture sur une couche nourricière de fibroblastes de souris 3T3 irradiés. Le tout s'est fait en plaque 6 puits en duplicata selon les 4 conditions suivantes. Kératinocytes psoriasiques + 3T3 + Lymphocytes sur l'insert dans du milieu sans IL-2 Kératinocytes psoriasiques + 3T3 + Lymphocytes sur l'insert dans du milieu avec IL-2 Kératinocytes psoriasiques + 3T3 + Lymphocytes sans insert dans du milieu sans IL-2 Kératinocytes psoriasiques + 3T3 + Lymphocytes sans insert dans du milieu avec IL-2 Les cellules ont été ensemencées aux mêmes densités que les cultures présentées à la section 2.2. Cependant, 4,2 ml de milieu ont été ajoutés par puits pour convenir à l'utilisation des inserts. La même concentration d'il-2 a été conservée. Cette expérience a été réalisée 3 fois avec une population de lymphocytes différente à chaque fois. L'utilisation d'inserts dans les cultures a permis d'éviter un contact direct entre les lymphocytes ajoutés sur l'insert et les kératinocytes au fond du puits. Un insert est en fait une membrane de polyethylene téréphthalate avec des pores de 0,4 micron. À cette taille, les pores ne laissent pas passer les lymphocytes et permettent un partage de milieu et de molécules solubles entre les deux compartiments (Figure 2.2). Les inserts utilisés ici provenaient de BD Falcon. Les surnageants du jour 13 (i.e après 13 jours d'ensemencement) ont été récoltés afin d'être dosés par ELISA pour les cytokines IFN-y, IL-6 et fractalkine. Flange fp /f- Insert Plate Well Membrane Membrane Figure 2.2 : Représentation du type d'insert utilisé dans cette co-culture

45 Tests d'adhésion avec neutrophiles L'isolation des neutrophiles s'est faite à partir de sang frais de donneurs sains. La purification des neutrophiles a été réalisée par sédimentation dans le dextran, suivie par une centrifugation Ficoll-Hypaque et finalisée par une lyse hypotonique. Même méthode que décrite par Kubes et al et Woodman et al. 1993, cependant toutes les étapes ont été faites à température pièce [97-98]. Réaliser cette méthode à température pièce simplifie les étapes sans compromettre le rendement. Les neutrophiles ont ensuite été marqués à la calcéine-am (Calbiochem, San Diego, CA). La calcéine entre dans les cellules et est rapidement hydrolysée pour former un composé fortement fluorescent, émettant autour de 517 nm. Des co-cultures kératinocytes-lymphocytes, avec kératinocytes normaux (KÇ18, KÇ42, KÇ26, K 29) et psoriasiques (KLÇ35, KLÇ46, KLÇ47, KLÇ65), ont préalablement été préparées dans un milieu enrichi d'il-2 tel que décrit à la section 2.2. Après 7 jours de culture, les kératinocytes étaient alors à confluence. Les surnageants furent récoltés et les plaques rincées avec une solution de HBSS avec Ca 2+. Ont ensuite été ajoutés 20x10 6 neutrophiles par puits, ainsi que les surnageants acellulaires respectifs à chaque condition. Après 2 heures d'incubation à 37 C avec 5% de CO2, les plaques furent rincées de nouveau avec du HBSS Ca afin d'enlever les cellules non adhérées. Les neutrophiles adhères ont été comptés à l'aide d'un microscope Olympus BX51 (Olympus), d'une camera Coolsnap HQ (Roper scientific, Sarasota, FL) et analysés avec le logiciel Image-pro plus (Media cybernetics, Bathesda, MD) selon une moyenne de 5 champs aléatoires par puits à loox. 2.8 Analyses statistiques Les analyses statistiques on été faites à l'aide du logiciel GraphPad Prism4. Le test ANOVA suivi d'un post-test Tukey-Kramer ont été appliqués pour tous les dosages de cytokines sauf pour l'expérience avec les inserts. Un test de Student non apparié fut alors utilisé pour les mesures d'apoptose cellulaire ainsi que pour les expériences avec inserts. Les données sont présentées en moyenne ± SD ou moyenne ± SEM. Les résultats étaient

46 37 considérés significatifs pour une valeur p < 0,05. Dans la section résultats, l'expression du SD dans les tableaux permet de bien visualiser la dispersion des valeurs obtenues, tandis que l'expression du SEM dans les graphiques permet de rapporter l'incertitude à la moyenne des valeurs et visuellement faire ressortir la significativité entre les colonnes.

47 Chapitre 3 : Résultats 38

48 Apoptose cellulaire La production en monocouche de co-cultures de kératinocytes, sains ou psoriasiques, avec des lymphocytes T s'est avérée possible. En effet, les cultures devenaient confluentes au début de la deuxième semaine d'incubation. Les kératinocytes formaient un tapis cellulaire régulier et il était possible d'observer une grande quantité de lymphocytes toujours présents après deux semaines de culture. Afin de bien caractériser ce modèle de co-culture, il était impératif de vérifier la viabilité des types cellulaires présents. Pour ce faire, l'influence que le lymphocyte pouvait exercer sur le keratinocyte, ou vice versa, a été observée ainsi que l'impact que pouvait avoir l'ajout d'il-2 au milieu de culture sur la survie du keratinocyte, sur celle du lymphocyte et plus particulièrement sur sa prolifération. Une évaluation de l'apoptose cellulaire des cultures a été réalisée au jour 14. La figure 3.1 présente les résultats de l'évaluation de cette apoptose. Les résultats de cette figure représentent les moyennes de 3 populations de kératinocytes sains (HK), 3 populations de kératinocytes psoriasiques (PK) et 10 populations de lymphocytes T (T cells). Lorsque les kératinocytes sains ou psoriasiques sont cultivés seuls (Figure 3.1 A; colonnes claires), aucune différence significative d'apoptose n'est observée entre ces deux types de kératinocytes. L'ajout d'il-2 dans le milieu de culture ne fait pas non plus varier l'apoptose des kératinocytes (moyenne autour de 20 %) (Figures 3.1 A; colonnes foncées). Quant à la présence de lymphocytes dans les cultures, ceci ne semble pas influencer la viabilité des kératinocytes (Figure 3.1 B; colonnes claires). Or, lorsqu'il y a présence d'il-2 dans les co-cultures avec kératinocytes psoriasiques, l'apoptose de ces kératinocytes augmente jusqu'à 33,5 ± 10,5 % comparativement à 19,8 ± 4,3 % sans IL-2 et à 19,1 ± 4,3 % pour la condition kératinocytes sains avec IL-2. En ce qui concerne les lymphocytes cultivés seuls (Figure 3.1 C), un faible taux de survie a été observé et se traduit par un taux d'apoptose rejoignant les 43,4 ±21,9 %. LTL-2 semble avoir très peu d'influence sur cette survie des lymphocytes; ces résultats ne sont pas présentés dans la figure. Lorsque ces lymphocytes ont été cultivés en présence de kératinocytes, la survie de ces lymphocytes a fortement été augmentée affichant des taux d'apoptose faibles de 9,0 ± 4,2 % et 7,9 ± 2,6 % en présence, respectivement, de kératinocytes sains et psoriasiques. En somme, il est intéressant de

49 40 noter que la seule présence des kératinocytes semble tout à fait bénéfique à la survie des lymphocytes en culture. 50. C.D-IL-2 +IL-2 *" 30-» o & S 20- < 3 20H nm Q. S < 10- «H 40- '_ 30- < 20- X B 40-1 HK PK T cells T cells-hk T cells-pk HK-T cells PK-T cells Figure 3.1: Évaluation de l'apoptose dans les cultures (A) Kératinocytes sains (HK) et psoriasiques (PK) cultivés seuls, avec ou sans IL-2. (B) Kératinocytes sains et psoriasiques cultivés avec des lymphocytes T (T-cells), avec ou sans IL-2. (C) Lymphocytes cultivés seuls ainsi qu'avec les kératinocytes sains et psoriasiques. Les résultats sont exprimés par moyenne ± SD (n=10 populations de lymphocytes). Statistiques: t-test non apparié, *p<0,05.

50 Expression de cytokines Nous avons vu précédemment que la communication entre les cellules immunitaires et les kératinocytes est importante dans le développement et l'évolution du psoriasis. Il serait intéressant de retrouver cette même communication dans notre modèle de culture in vitro. Plusieurs cytokines sont reconnues pour leur rôle aggravant ou bénéfique de la maladie. Grâce à la technologie du luminex, il fut possible de doser une grande quantité de ces cytokines dans les surnageants pris au jour 13 de chacune des différentes conditions de culture étudiées. Les cytokines pour lesquelles l'expression a retenu notre attention ont été regroupées au tableau 3.1 ci-dessous : Tableau 3.1: Sécrétion de cytokines et chimiokines par les kératinocytes sains et psoriasiques en monoculture Cytokines/ Kératinocytes sains (HK) Kératinocytes psoriasiques (PK) Chimiokines Moyenne* ± SD Moyenne* ± SD MCP-1 62,23 ± 34,52 161,10± 118,30 IL-8 962,20 ± 565, ,00 ± 4426,00 TNF-a 8,55 ±6,17 24,97 ±13,81 IL-6 7,66 ±7,78 46,31 ±48,78 IL-lRa/IL-1 ratio 490,00 ±118,90 200,10 ±152,50 GM-CSF 32,28 ± 15,85 313,60 ±291,00 IFN-y ND ND s IL-2 Ra ND ND fractalkine 30,78 ± 44,08 40,06 ± 62,65 IL-15 6,29 ± 4,07 17,61 ± 7,23 IL-1 299,10 ±129,30 241,80 ±215,60 IL-IRA ± ±46101 * Les cytokines et chimiokines sont exprimées en pg/ml par million de kératinocytes (n=8 populations de lymphocytes). ND: non détectable. Le tableau 3.1 présente la concentration moyenne de chaque cytokine retrouvée dans les surnageants des kératinocytes sains et psoriasiques en monoculture. L'expression de ces mêmes cytokines, mais cette fois pour la condition : kératinocytes seuls +IL-2, a également été évaluée sans pour autant y constater des différences (résultats non présentés dans ce tableau). À la lumière des résultats colligés au tableau 3.1, il est possible d'apprécier que la production en cytokines est différente entre les deux types de kératinocytes : la production d'il-8, entre les kératinocytes sains et psoriasiques, passe de 962,20 ± 565,10 pg/ml en

51 42 moyenne à 4329,00 ± 4426,00 pg/ml. En ce qui concerne la condition impliquant la présence de lymphocytes, c'est-à-dire la co-culture, les profils de sécrétion changent et sont pour la plupart augmentés considérablement (Tableau 3.2). L'ajout d'il-2 dans ces conditions vient de façon générale amplifier cette réponse avec lymphocytes T, par exemple : la quantité de fractalkine retrouvée dans les co-cultures avec les kératinocytes psoriasiques est en moyenne de 63,12 ± 74,29 pg/ml et s'élève à 1427,00 ± 379,30 pg/ml lorsque 1TL-2 est présente. La suite de cette section sera consacrée à la présentation des résultats sous forme de graphiques afin de bien visualiser ces différences d'expression en cytokines retrouvées entre les conditions de culture. Tableau 3.2: Sécrétion de cytokines et chimiokines par les kératinocytes sains et psoriasiques en co-culture avec lymphocytes T Cytokine/ Co-culture HK-T Co-culture PK-T -IL-2 +IL-2 -IL-2 +IL-2 Moyenne* ± SD Moyenne* ± SD Moyenne* ± SD Moyenne* ± SD MCP ,00 ± 3357, ,00 ± 3397, ,00 ±6115, ,00 ±12082,00 IL ,00 ±715, ,00 ±1327, ,00 ±9732, ,00 ±11582,00 TNF-a 11,66 ±8,06 39,91 ±11,47 36,13 ±18,96 154,90 ±97,56 IL-6 10,62 ±11,32 75,77 ± 73,56 97,59 ±81,27 500,00 ±461,50 f^ }_ i m i n t_"i n p v_i-ih-i.jmii-_ IL-lRa/IL-1 ratio 484,80 ±117,90 353,10 ±151,80 138,40 ±153,90 201,20 ±95,54 GM-CSF 44,01 ±16,01 673,00 ± 324,60 696,00 ±661, ,00 ± 993,70 IFN-Y ND 324,50 ± 296,80 ND 627,10 ±185,40 s IL-2 Ra 5,81 ±7,75 331,80 ±328,80 7,92 ± 9, ,00 ± 604,00 fractalkine 27,38 ± 35,73 79,23 ± 85,79 63,12 ± 74, ,00 ± 379,30 IL-15 7,20 ± 4,62 16,01 ±5,39 16,03 ± 12,63 56,24 ± 12,06 IL-1 330,50 ± 124,30 468,30 ± 248,60 301,40 ±245,00 758,80 ± 480,00 IL-IRA ± ± ± ±41150 pg/ml par million de kératinocytes en * Les cytokines et chimiokines sont exprimées en co-culture avec lymphocytes T, et avec (+IL-2) ou lymphocytes). ND: non détectable. sans IL-2 (-IL-2) (n= 8 populations de Discutons d'abord de la production des chimiokines MCP-1 et IL-8 par les kératinocytes cultivés seuls (Tableaux 3.1 et 3.2; Figure 3.2 A et B). On retrouve dans les surnageants des kératinocytes psoriasiques (PK), après 13 jours de culture, en moyenne 161,10 ±41,83 pg/ml de MCP-1 et 4329,00 ± 1564,83 pg/ml d'il-8. Ces résultats sont raisonnablement plus élevés que les moyennes retrouvées avec les kératinocytes sains (HK), soit 62,23 ± 12,20 pg/ml de MCP-1 et 962,20 ± 199,79 pg/ml d'il-8. Comme ces différences sont significatives, on peut donc affirmer que les kératinocytes psoriasiques produisent à la base plus de chimiokines MCP-1 et IL-8 que les kératinocytes sains en culture. L'ajout d'il-2

52 43 dans les conditions kératinocytes cultivés seuls n'a pas apporté de résultats différents (résultats non présentés). E D) a CL O s B * 200- * «inj v I 3 E Ol a 00 Jj i HK PK HK PK i Figure 3.2: Production des chimiokines MCP-1 et IL-8 en monoculture (A) MCP-1 et (B) IL-8 produits par les kératinocytes sains (HK) ainsi que psoriasiques (PK). Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM par IO 6 kératinocytes (n=8 populations de lymphocytes). Statistiques: t-test non apparié, *p<0,05. Par ailleurs, la production de ces chimiokines, lorsque l'on passe en co-culture, change d'échelle complètement (Figure 3.3). L'expression de MCP-1 dans les surnageants des cocultures avec kératinocytes psoriasiques (Figure 3.3 A; colonnes foncées -IL-2) présente un résultat de 7964 ± 2162 pg/ml. Lors de l'ajout d'il-2 dans le milieu de culture, l'expression de MCP-1 s'est significativement accentuée atteignant des valeurs de l'ordre de ± 4272 pg/ml. Quant à la comparaison de cette valeur à celle obtenue en présence de kératinocytes sains (Figures 3.3 A; colonnes claires +IL-2), il s'est avéré que cette dernière était également significativement beaucoup plus importante : ± 4272 pg/ml comparativement à 6205 ± 1201 pg/ml. En ce qui a trait à 1TL-8, il semble que la présence de lymphocytes ait créé une plus forte réponse sur l'expression de cette chimiokine en présence de kératinocytes psoriasiques (Figure 3.3 B; colonnes foncées) qu'en présence de cellules saines (Figure 3.3 B; colonnes claires). Avec ajout d'il-2, l'expression d'il-8 dans les co-cultures avec kératinocytes sains n'a été que de 2550 ± 469 pg/ml comparativement à une valeur significativement beaucoup plus importante en présence de

53 44 cellules psoriasiques soit de : ± 4095 pg/ml. LTL-2 semble jouer sur l'expression d'il-8 en présence de kératinocytes psoriasiques (Figure 3.3 B; colonnes foncées) mais pas suffisamment ici pour avoir une significativité ÎHK-Tcels IPK-Tcels 17a C ]HK-Tce_s IPK-Tcels 17(00- e 1S00O E ^ = 12 " U Z dê -IL-2 HL-2 Figure 3.3: Production des chimiokines MCP-1 et IL-8 en co-culture (A) MCP-1, (B) IL-8 produits par les co-cultures de kératinocytes sains (HK) et psoriasiques (PK) avec lymphocytes T, en présence ou non d'il-2. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM par 10 kératinocytes (n=8 populations de lymphocytes). Statistiques: t-test non apparié, *p<0.05. Les figures 3.4 et 3.5 présentent les résultats de cytokines reconnues dans la réponse inflammatoire. Encore une fois, un des objectifs de ce présent travail a été de vérifier si l'expression de ces autres cytokines allait pouvoir être observée au sein de ce modèle de culture in vitro mis au point par notre équipe. Tout d'abord, en monoculture, l'expression par les kératinocytes psoriasiques des cytokines : TNF-a (24,97 ± 4,88), IL-6 (46,31 ± 17,25) et GM-CSF (313,60 ± 102,88) en pg/ml, colonnes foncées de la figure 3.4 A-B et D respectivement, s'est avérée pour chacune significativement plus élevée que celles obtenues en présence de kératinocytes sains (Figure 3.4 A-B-C; colonnes claires) affichant respectivement les résultats suivants : 8,56 ±2,18 pg/ml, 7,66 ± 2,75 pg/ml et 32,28 ± 5,60 pg/ml. Le graphique à la figure 3.4 (C) montre un rapport entre 3 composantes de 1TL-1; IL-1 Ra (récepteur antagoniste) par IL-la et p (2 composantes inflammatoires). En théorie, un rapport élevé signifie une plus grande activité de l'antagoniste, donc une réponse

54 45 inflammatoire plus faible. Dans ce graphique, un rapport significativement plus élevé a été observé avec les kératinocytes sains 490,00 ± 42,04 pg/ml contrairement à 200,10 ± 53,92 pg/ml pour les kératinocytes psoriasiques. Cela se traduit par la possibilité d'une plus forte activité des composantes inflammatoires a et P de l'il-1 lorsqu'il y a présence de kératinocytes psoriasiques. son B 1 Ë «O W Ë m E MC. u HK PK Figure 3.4: Production des cytokines TNF-a, IL-6, IL-lRa/IL-1 et GM-CSF en monoculture (A) TNF-a, (B) IL-6, (C) IL-lRa/IL-1 et (D) GM-CSF produits par les kératinocytes sains (HK) et psoriasiques (PK). Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM par 10 kératinocytes (n=8 populations de lymphocytes). Statistiques: t-test non apparié, *p<0,05.

55 46 L'expression de ces cytokines en co-culture sans IL-2 (Figure 3.5 A-B-C-D; -IL-2) n'est pas très différente de ce qui est retrouvé en monoculture. On constate une tendance à la hausse par rapport à la monoculture mais sans plus. Toutefois, lorsque les co-cultures sont additionnées d'il-2, la production de TNF-a, d'il-6 et de GM-CSF par les cultures avec kératinocytes psoriasiques se voit augmentée de plusieurs fois comparativement à ce que l'on peut trouver avec les kératinocytes sains ou même avec les autres conditions testées (Figure 3.5 A-B-D; colonnes foncées +IL-2) (154,90 ± 34,49, 500,00 ± 163,16 et 3079,00 ± 351,33 pg/ml respectivement). En ce qui concerne 1TL-1 (Figure 3.5 C), les résultats en co-culture démontrent une légère augmentation des trois composantes dosées, alors que les ratios d'antagoniste IL-1 RA par IL-1 a et P restent semblables à ceux retrouvés précédemment en monoculture (Figure 3.4 C). 20CH I )HK-Tcels IPK-Tcels ]HK-Tcets IPK-Tcels I I * -r r - S MOs CDHK-Tcefe 700- PK-Tceis m H A. T i ]HK-Tcels IPK-Tcels -IL-2 HL-2 Figure 3.5: Production des cytokines TNF-a, IL-6, IL-lRa/IL-1 et GM-CSF en co-culture (A) TNF-a, (B) IL-6, (C) IL-lRa/IL-1, (D) GM-CSF produits par les co-cultures de kératinocytes, sains (HK) et psoriasiques (PK), avec lymphocytes T, en présence ou non d'il-2. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM par IO 6 kératinocytes (n=8 populations de lymphocytes). Statistiques: t-test non apparié, *p<0,05.

56 47 Les cytokines IFN-y, sil-2ra et fractalkine ne sont que très peu ou pas exprimées en monoculture. En co-culture, on remarque seulement une expression d'ifn-y et de sil-2ra (Figure 3.6 A-B) dans les cultures ayant reçu un supplément d'il-2. Dans les cultures avec kératinocytes sains, l'expression d'ifn-y est de 324,50 ± 104,93 pg/ml et sil-2ra de 331,80 ± 116,25 pg/ml. Cette expression augmente significativement à 627,10 ± 65,55 pg/ml et à 1023,00 ± 213,55 pg/ml respectivement avec les kératinocytes psoriasiques. La fractalkine est produite en faible quantité dans les co-cultures sauf, exception, en présence de kératinocytes psoriasiques et IL-2 où elle est fortement augmentée avec 1427,00 ± 134,10 pg/ml par rapport aux sains et IL-2 avec 79,23 ± 85,79 pg/ml.

57 IHK-Tcels IPK-Tcels E S 40CH.L-2 +IL-2 B125CH I 75<H dn «50CH C HK-T cells PK-T cells -IL-2 +IL C160C IHK-Tcels IPK-Tcels -; E g t 800- j IL-2 Figure 3.6: Production des cytokines IFN-y, sil-2ra etfractalkineen co-culture (A) IFN-y, (B) sil-2ra et (C) fractalkine produits dans les co-cultures de kératinocytes, sains (HK) et psoriasiques (PK), avec lymphocytes T, en présence ou non d'il-2. Les résultats sont présentés en moyenne ± SEM par IO 6 kératinocytes (n=8 populations de lymphocytes). Statistiques: t-test non apparié, *p<0,05. +IL-2

58 Co-cultures avec inserts Du fait que plusieurs des cytokines dosées soient fortement exprimées dans les co-cultures de kératinocytes psoriasiques et lymphocytes, cette condition a été retenue afin de sonder la nature de l'interaction entre ces deux types cellulaires. La figure 3.7 présente les résultats de trois cytokines dosées par la technique ELISA : 1TL-6, l'ifn- y et la fractalkine. Dans les colonnes de gauche des graphiques A, B et C, nous avons les conditions où les cellules en culture étaient séparées par un insert, avec ou sans IL-2. Dans celles de droite nous avons les conditions sans insert, où les cellules pouvaient faire contact. On constate que pour ces trois cytokines, effectivement produites en présence d'il-2, leur production est fortement réduite lorsqu'un insert sépare physiquement les kératinocytes des lymphocytes et que seul le milieu de culture est partagé.

59 50 Inserts B C -ll IL Ë 600- S Inserts Inserts Figure 3.7: L'impact de l'utilisation d'inserts sur la production des cytokines (A) IL-6, (B) IFN-y et (C)fractalkinedans des co-cultures kératinocytes psoriasiques et lymphocytes T. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM (n=3 populations de lymphocytes). Statistiques: t-test non apparié, *p<0,05.

60 Adhésion des neutrophiles Il a été démontré précédemment qu'une forte expression de cytokines pro inflammatoires pouvait être obtenue via l'utilisation de notre modèle de co-culture impliquant des kératinocytes psoriasiques, des lymphocytes T et de 1TL-2. Comme second objectif, nous nous sommes intéressés à savoir si ce phénomène pouvait produire des effets fonctionnels tels que favoriser une réponse du neutrophile. À la Figure 3.8, il est possible d'observer un des impacts qu'a cette condition de culture précise sur le neutrophile. En moyenne, il est retrouvé 82,09 ± 16,63 neutrophiles adhères par champ observé avec kératinocytes psoriasiques comparativement à 16,63 ± 4,50 neutrophiles avec kératinocytes sains. Cette différence est significative avec une valeur p < 0,001. Il est alors possible d'affirmer que cette condition de co-culture avec des kératinocytes psoriasiques permet à un plus grand nombre de neutrophiles d'adhérer au kératinocytes. Différentes conditions d'incubation des neutrophiles avec des combinaisons d'il-8, TNF-a et GM-CSF ont été testées, mais sans résultats convaincants car peu de neutrophiles ont adhères, et ce, indépendamment du type de keratinocyte utilisé (résultats non présentés). Il semblerait que la présence des kératinocytes psoriasiques ainsi que l'incubation avec le surnageant des co-cultures psoriasiques soient les conditions qui favorisent le mieux cette adhésion.

61 E n O T» i CL. O HK PK Figure 3.8: Quantité de neutrophiles adhères aux kératinocytes sains (HK) ou psoriasiques (PK) suite à une co-culture avec lymphocytes T. Les résultats sont exprimés en moyenne ± IC95%(n=32), *p<0,001.

62 Chapitre 4 : Discussion 53

63 Apoptose cellulaire La prolifération et la différenciation des kératinocytes sont médiées par un réseau complexe de cytokines, facteurs de croissance ou encore de molécules d'adhésion. On sait que la perte d'adhésion du keratinocyte à la membrane basale mène à la différenciation terminale ou l'apoptose. Toutefois, les mécanismes qui contrôlent l'apoptose du keratinocyte demeurent peu connus. Dans une lésion psoriasique, on observe un ratio anormalement faible d'apoptose des kératinocytes. Pour appuyer cette observation, des études ont démontré que les kératinocytes psoriasiques sont plus résistants à l'apoptose que les kératinocytes normaux [99]. Que ce soit par la voie mettant en jeux le récepteur Fas ou bien la voie mitochondriale de l'apoptose, certaines études tentent d'expliquer ce phénomène. LTL-15 est fortement exprimée dans les lésions psoriasiques. Il a été démontré que 1TL-15 inhibe l'apoptose, médiée par Fas, des kératinocytes en culture en liant la sous-unité IL-15Ra de son récepteur. Le récepteur à 1TL-15 partage 2 sous-unités avec le récepteur de 1TL-2 soit IL-2RP et y. Un fait intéressant est que contrairement à l'il-15,1tl-2 n'inhibe pas l'apoptose du keratinocyte [100]. Cette même observation a été faite dans nos cultures. L'ajout d'il-2 n'a eu aucun effet sur l'apoptose des kératinocytes sains ou psoriasiques. Il reste que l'il-15ra, 1TL-2RP et y sont exprimées de façon constitutive sur le keratinocyte, alors une fonction de ces récepteurs in vivo, toujours inconnue à ce jour, reste possible. Il a aussi été démontré que les lésions psoriasiques présentent une surexpression de la protéine Bcl-x. Bcl-x est une protéine anti-apoptotique impliquée dans la voie mitochondriale de l'apoptose. Une forte expression de Bcl-x donnerait cette résistance des kératinocytes psoriasiques à l'apoptose. Cependant, le taux d'apoptose des kératinocytes sains et psoriasiques reste semblable dans nos cultures. In vitro, les kératinocytes normaux expriment un niveau de base de Bcl-x qui peut être augmenté suite à une exposition à l'ifn-y et le TPA. Toutefois, cette étude ne présente pas l'expression de Bcl-x par les kératinocytes psoriasiques cultivés in vitro [101]. Rien ne prouve que la surexpression observée in vivo ne soit pas due à l'exposition des kératinocytes à l'environnement inflammatoire.

64 55 Un résultat intrigant présenté par notre modèle de co-culture kératinocytes-lymphocytes T est cette hausse du taux d'apoptose chez les kératinocytes psoriasiques en présence d'il-2. On ne peut pas attribuer cette hausse à une simple action des lymphocytes, car ceci n'est pas observé dans les autres conditions avec lymphocytes. On sait depuis déjà quelques années que les kératinocytes normaux expriment un certain niveau de Fas en culture. Cependant, ce Fas ne semble pas être fonctionnel car des traitements avec le FasL soluble n'induisent pas d'apoptose [102]. On sait aussi que Fas est plus exprimé sur des kératinocytes provenant de lésions de certaines pathologies [103]. Cette observation a intéressé le groupe d'arnold et al. qui a placé en culture des kératinocytes en présence de cytokines pro-inflammatoires comme le TNF-a, ltfn-y, l'il-ip et 1TL-15. Le résultat de cette expérience fut une augmentation de l'expression de Fas et FasL sur les kératinocytes de façon temps et dose dépendants. Ils ont aussi fait l'observation d'une hausse de l'apoptose dans ces cultures [102]. Une étude parmi d'autres a aussi démontré que les kératinocytes en culture, traités avec de l'ifn-y, expriment Fas plus fortement et deviennent aussi susceptibles à l'apoptose [104]. Alors, en revenant à notre condition de co-culture avec IL-2, nos résultats d'analyse des cytokines démontrent que la production de ces cytokines pro-inflammatoires est beaucoup plus importante dans cette condition que dans les autres. Donc, la hausse du taux d'apoptose dans cette condition de co-culture pourrait être due à une interaction Fas/FasL. Cette explication nécessite une plus profonde exploration mais elle ne doit pas être écartée. Il serait intéressant de vérifier l'expression de Fas et FasL dans cette culture et aussi de voir si en bloquant cette voie, cette différence d'apoptose serait toujours observée. Concernant l'apoptose des lymphocytes, un haut taux de mortalité survient dans les cultures de lymphocytes seuls. La présence d'il-2 dans le milieu de culture suggère une influence à la baisse de ce taux de mortalité sans toutefois présenter une différence significative avec la condition précédente (résultats avec IL-2 non présentés). Par contre, lorsque l'on cultive les lymphocytes en présence de kératinocytes, le taux d'apoptose diminue considérablement. Ce phénomène a aussi été démontré avec des cultures de fibroblastes où le contact entre les deux types cellulaires semblait nécessaire [105]. Une autre étude suggère que l'interaction ICAM-1 et LFA-1 contribue en partie à cette survie des

65 56 lymphocytes [106]. D'autres intégrines pouvant être impliquées seraient aipi et a2pl, toutes deux connues pour inhiber l'apoptose des lymphocytes T [ ]. 4.2 Interactions cellulaires L'expérience sur l'apoptose a démontré l'existence d'une interaction fonctionnelle entre les kératinocytes et les lymphocytes et c'est en présence de kératinocytes psoriasiques que cette dernière s'est avérée encore plus forte. Ainsi, il devenait intéressant de regarder de plus près la communication cellulaire au niveau des facteurs solubles comme les cytokines et facteurs de croissance. Il est connu dans la littérature, qu'un profil particulier d'expression de cytokines est présent dans les lésions psoriasiques et que ce dernier est orienté vers une réponse inflammatoire de type Thl du système immunitaire [109]. Dans notre modèle de co-culture avec kératinocytes psoriasiques, un profil semblable à la pathologie a été obtenu. D'emblée, il est pertinent de préciser que l'ajout d'il-2 dans les cultures de kératinocytes seuls n'influence pas leur expression de cytokines (résultats non présentés). Nos résultats démontrent clairement que les kératinocytes psoriasiques en culture produisent plus de chimiokines MCP-1 et IL-8, ainsi que plus de cytokines favorisant l'inflammation comme le TNF-a, 1TL-6 et le GM-CSF que les kératinocytes sains. Puisque ces cytokines sont toutes retrouvées dans l'épiderme psoriasique, il est juste d'avancer que les kératinocytes psoriasiques en cultures et ce, même après quelques passages, arrivent à conserver en partie le profil inflammatoire du psoriasis. Notre modèle de co-culture montre une interaction entre les lymphocytes et les kératinocytes psoriasiques par une hausse importante de l'expression de ces mêmes cytokines en plus de l'ifn-y, d'il-2ra et de la fractalkine. Une expression qui est potentialisée par 1TL-2. Ces kératinocytes psoriasiques semblent diriger les lymphocytes vers une sous-population Thl, car des quantités négligeables d'il-4 et d'il-10 ont été trouvées. Il a été démontré que les produits de cette sous-population Thl, essentiellement IFN-y et TNF-a, pouvaient induire l'expression d'il-8 et de MCP-1 [110]. Il est alors possible que la forte expression de plusieurs cytokines dans le modèle découle d'une hausse de ces mêmes produits Thl.

66 57 Il est connu que le TNF-a, a une place importante dans le psoriasis étant donné l'action efficace démontrée des traitements anti-tnf. En effet, il peut être produit par les lymphocytes T, les cellules présentatrices d'antigènes et les kératinocytes. Ses effets sont connus, entre autres sur l'activation des lymphocytes, la production de cytokines inflammatoires ou encore l'expression de molécules d'adhésion favorisant le recrutement des leukocytes. Toutefois, l'ampleur de son implication dans le psoriasis reste à définir [111]. LTFN-y est produit par les lymphocytes T et est retrouvé en plus grande quantité dans le sérum de patients atteints de psoriasis [ ]. Ces affirmations concordent bien avec ce qui est retrouvé dans notre modèle où, cependant, un supplément d'il-2 est nécessaire. De part son action, il favorise, entre autres, la sous-population Thl du lymphocyte T, la présentation d'antigènes par le CMH ou encore une augmentation de l'expression d'icam-1. Étant donné que son récepteur est distribué différemment dans l'épiderme psoriasique, une action différente demeure possible [114]. Le sil-2ra est une version soluble de la sous-unité a du récepteur à 1TL-2. En captant 1TL-2 dans le milieu, il aurait un rôle dans la régulation de la réponse immune. Sa présence serait aussi signe d'une activation des lymphocytes T. Un résultat étonnant obtenu dans nos travaux fut la présence de fractalkine ligand (CX3CL1) avec une expression marquée dans les co-cultures psoriasiques en présence d'il-2. La fractalkine est retrouvée dans plusieurs tissus du corps humain comme les vaisseaux sanguins, les reins et la peau. On la retrouve habituellement à la membrane plasmique, mais elle peut être clivée par la TACE (tumor necrosis factor-a-converting enzyme) et se retrouver sous forme soluble. La fractalkine permet, par l'action sur son récepteur CX3CR1, la migration de leucocytes comme les monocytes, les lymphocytes et les cellules NK, tout en augmentant l'adhésion de ceux-ci [115]. La fractalkine est retrouvée dans le psoriasis et semble aussi être impliquée dans d'autres maladies autoimmunes comme l'arthrite rhumatoïde et la maladie de Crohn [ ].

67 58 Quant à 1TL-8, cette dernière est une chimiokine qui peut être produite par plusieurs types cellulaires. Par exemple, dans le psoriasis, 1TL-8 peut, entre autres, être produite par les cellules endothéliales, les macrophages, les fibroblastes et les kératinocytes [119]. La production d'il-8 permet le recrutement de neutrophiles dans les lésions, où une fois activés, ces neutrophiles se mettent à leur tour à produire de 1TL-8 [ ]. Il a été démontré que les kératinocytes peuvent être d'importants producteurs d'il-8 lorsque stimulés [15, ]. Dans notre modèle de co-culture, il semble que la présence des lymphocytes crée une stimulation assez importante sur les kératinocytes psoriasiques pour observer cette forte production d'il-8. Le GM-CSF est reconnu pour être retrouvé en grande quantité dans l'épiderme psoriasique. Il est surtout connu dans cette pathologie comme étant un facteur pouvant aider au recrutement et à prolongation de la survie des neutrophiles [ ]. Il semble que les lymphocytes T activés ou isolés de pustules psoriasiques en produisent également beaucoup [ ]. Nos résultats montrent encore un fois une plus forte expression de GM-CSF dans les co-cultures kératinocytes psoriasiques-lymphocytes T que lorsque des kératinocytes sains sont utilisés. Contrairement aux cytokines mentionnées précédemment, 1TL-4 et l'il-10 viennent, quant à elles, freiner la réponse inflammatoire en favorisant la sous-population Th2 des lymphocytes. Les IL-4 et IL-10 ne sont retrouvées dans aucune de nos conditions de culture. Cela vient renforcer le fait que l'activation est caractéristique d'une souspopulation Thl des lymphocytes, au détriment d'une sous-population Th2. Suite à cette expérience sur l'expression de cytokines, la condition kératinocytes psoriasiques avec lymphocytes et IL-2 présente sans équivoque un profil d'expression de cytokines inflammatoires comparable à ce qui est retrouvé dans le psoriasis, et ce, même avec des populations de kératinocytes provenant de patients ayant des âges (35 et 65 ans) et des niveaux d'atteinte (20 et 40 %) différents. Il est difficile de savoir exactement ce qui active les lymphocytes dans ce modèle. L'activation par la voie classique du CMH est peu vraisemblable de par les nombreux polymorphismes et la sélection thymique. D'autres

68 59 théories peuvent être tenues pour compte; l'une d'elles est que les kératinocytes expriment une vaste gamme de TLR afin de contrer les infections. Certains de ces TLR sont plus exprimés dans le psoriasis et l'activation de ces derniers se traduit par une libération de TNF-a et d'il-8, une autre théorie serait en lien avec le récepteur Fas [15]. Considérant que les kératinocytes psoriasiques sont résistants à l'apoptose médiée par Fas, en grande partie par l'expression de molécules anti-apoptotiques comme Bcl-xL, l'activation du récepteur Fas pourrait enclencher une signalisation alternative menant à la production des cytokines inflammatoires TNF-a et IL-8 [128]. Cependant, cette théorie pourrait aller à l'encontre de celle sur l'apoptose cellulaire, décrite au point 4.1, dans la même condition de co-culture avec kératinocytes psoriasiques en présence d'il-2. Dans le but d'examiner la nature de cette expression de cytokines, nous avons adapté la coculture kératinocytes psoriasiques avec lymphocytes en présence d'il-2 à l'ajout d'un insert séparant physiquement les deux types cellulaires. Comme les cellules partageaient le même milieu, cette expérience a pu nous informer de la nécessité d'un contact cellulecellule dans cette expression. Selon les résultats obtenus avec l'ifn-y, 1TL-6 et la fractalkine, une coupure nette dans la production de cytokines est observée dans les cultures avec un insert. Il est donc nécessaire d'avoir un contact cellule-cellule, car l'échange de facteurs solubles n'est pas suffisant. Ici, la variabilité dans l'expression des cytokines semble être due en grande partie aux différentes populations de lymphocytes utilisées. En plus des théories discutées précédemment, il est possible que les intégrines soient aussi impliquées dans cette activation par contact cellulaire. Il a été montré que les kératinocytes psoriasiques expriment des intégrines du groupe pi de façon aberrante [17]. Certaines de ces intégrines, comme pla2 et pia3, peuvent agir en synergie avec ICAM-1 et renforcer l'adhésion avec les lymphocytes de façon homophile ou hétérophile [129]. Toutefois, lors de cette expérience, la viabilité des lymphocytes n'a pas été vérifiée. Il est alors possible que la faible expression en cytokines des conditions avec insert soit due à un faible taux de survie des lymphocytes après 14 jours de culture sans contact direct avec les kératinocytes.

69 Le neutrophile et le modèle psoriasique Il est certain que le neutrophile a une place dans le psoriasis. De par ses nombreuses fonctions et capacités d'adaptation, il est difficile de cerner l'ampleur de son implication dans la pathologie. Nous avons vu précédemment que notre modèle de co-culture pouvait produire une bonne quantité de cytokines inflammatoires susceptibles d'activer le neutrophile. En ajoutant des neutrophiles au modèle, nous avons constaté qu'un plus grand nombre de neutrophiles adhérait aux kératinocytes psoriasiques comparativement aux kératinocytes sains. Les deux types cellulaires provenaient de co-cultures en présence d'il-2, et les neutrophiles incubés avec le surnageant de ces mêmes cultures. Sans les surnageants, la réponse était moins forte et la différence non significative (résultats non présentés). La présence des lymphocytes doit conditionner les kératinocytes psoriasiques à une plus grande adhésion et le surnageant doit possiblement conditionner les neutrophiles à cette adhésion. L'échec d'une stimulation des neutrophiles avec TNF-a et IL-8 nous montre qu'une synergie avec une autre cytokine inflammatoire comme IL-1 ou IFN-y est nécessaire. Les neutrophiles, comme les lymphocytes, peuvent adhérer à ICAM-1 [130]. Ce résultat pourrait alors être dû à une plus forte expression d'icam-1 sur les kératinocytes psoriasiques et amplifiée par ltfn-y [129]. L'expression aberrante d'autres intégrines du groupe pi pourrait aussi contribuer à ce phénomène d'adhésion [17]. Les kératinocytes psoriasiques expriment également un autre récepteur appelé CEACAM1. Ce récepteur n'est pas présent sur les kératinocytes normaux, mais il peut être induit par IFN-y. Il a été démontré que ce récepteur peut augmenter la survie des neutrophiles, possiblement par un lien homophile du récepteur [131]. Selon sa localisation dans les lésions psoriasiques, ce récepteur favoriserait plus la présence des neutrophiles que l'initiation de la lésion. On parle beaucoup de 1TL-8 comme chimiokine de choix pour la migration des neutrophiles. Cependant, la faible réponse au traitement anti-il-8 dans le psoriasis nous montre que ce n'est pas la seule molécule impliquée.

70 Chapitre 5 : Conclusion 61

71 Ce modèle de co-culture kératinocytes psoriasiques et lymphocytes en monocouche présente plusieurs interactions fonctionnelles allant dans le même sens que bas nombre de découvertes sur le psoriasis. Nous avons démontré que le modèle est viable pendant au moins deux semaines et que les lymphocytes survivent très bien en présence de kératinocytes. Aussi, nous avons vu que ce modèle permet de reproduire un profil d'expression de cytokines et de facteurs de croissance retrouvés dans la pathologie, et que l'ajout d'il-2 potentialise cette expression. Le fait que cette forte expression de cytokines soit perdue lorsque l'on empêche un contact direct cellule-cellule entre les deux types cellulaires, nous donne une piste afin de poursuivre les recherches sur la nature de l'interaction. Suite aux expériences avec le neutrophile, nous constatons que cette expression de cytokines inflammatoires exerce une activité fonctionnelle sur l'adhésion des neutrophiles aux kératinocytes psoriasiques. 62 La somme de ces expériences nous montre que les kératinocytes psoriasiques peuvent reproduire in vitro plusieurs caractéristiques retrouvées in vivo dans le psoriasis. Ces résultats viennent renforcer les conclusions du modèle tridimensionnel de peau reconstruite à partir de cellules psoriasiques, développé par notre équipe [92]. En plus de poursuivre les recherches sur la nature de l'interaction kératinocytes psoriasiques et lymphocytes, il serait intéressant d'ajouter les neutrophiles étudiés ici dans le modèle tridimensionnel afin de regarder entre autres la migration, l'activation et les facteurs libérés dans le milieu de culture. L'ajout d'autres types cellulaires impliqués dans le psoriasis est aussi envisageable. Comme il n'y a pas encore à ce jour un modèle animal représentatif du psoriasis et que les biopsies ont leurs limitations, ce modèle psoriasique fabriqué par génie tissulaire pourrait devenir un outil de recherche important dans un futur proche. C'est-à-dire un modèle disponible et fonctionnel, permettant une dynamique entre le système immunitaire et la peau psoriasique. Ce modèle pourra certainement fournir de nouvelles réponses sur le psoriasis.

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