Mucoviscidose Delphine Feldmann Laboratoire de Biochimie,Biologie Moléculaire Hôpital A Trousseau Historique : Maladie héréditaire h Modifications ioniques : Elévation du Cl et du Na sudoral (di Sant Agnese Agnese, Am J Med,, 1953) Maladie héréditaire h fréquente Transmission mode AR Grave Fréquente Grande variabilité d expression Due à une atteinte du gène g CF codant la protéine Diagnostic et dépistage d de la maladie Manifestations cliniques De la fibrose kystique du pancréas à une atteinte des épithèliums sécrétoires due à un épaississement des sécrétions Atteinte respiratoire Bronchopathie chronique obstructive Bronchectasies (EFR, RP, TDM) Infections chroniques Atteinte digestive et nutritionnelle Insuffisance pancréatique externe (85%) Obstruction intestinale iléus méconial (15%) Polypose naso-sicnusienne, Sinusite chronique (TDM) Atteinte hépatobiliaire cirrhose (5%) Retard de croissance Atteinte génitale homme : infertilité par absence bilatérale des canaux déférents (95%) femme : hypofertilité par épaississement de la glaire cervicale Glandes sudoripares Sensibilité à la déshydratation syndrome de perte de sel Modification ionique de la sueur Test de la sueur
Variabilité phénotypique pathologie du gène fonction pancréatique conservée insuffisance pancréatique iléus méconial atteinte respiratoire variable formes monosymptomatiques de l adulte - Absence bilatérale des canaux déférents - Bronchectasies diffuses - Pancréatite chronique - Atteinte rhino-sinusienne chronique atypique test de la sueur : + intermédiaire négatif Fréquences en fonction des populations fréquence à la naissance fréquence hétérozygotes Caucasiens 1/2 500 (1/1 800 à 1/3 500) 1/25 1/4 300 1/33 Moyen-Orient 1/4 400 1/33 Hispaniques 1/8 500 1/46 Noirs Américains / Africains 1/20 000 1/70 Asiatiques 1/32 400 1/90
Identification du gène -Clonage positionnel -1989, Science, Tsui et Collins contig gène mutation Etude de marqueurs ADN dans les familles : étude de liaison génétique localisation chromosomique cartographie génétique localisation chromosomique fine recherche de gènes (clonage) exon 10 cartographie physique A A A T A T C A T T G G T G T T T C C T C T F508del identification de mutation implication du gène Du gène à la protéine Gène : 7q31 200 kb ARNm : 6,5 kb Régulation de l expression mal connue Protéine : 1480 aa mb apicale des cellules des épithéliums sécrétoires
Mutations du gène 1717-1G>A G542X S549R G551D Q552X R553X R668C 2143delT G673X 2183AA>G 2184insA K710X R792X R1158X R1162X 3659delC R117H Y122X 621+1G>T E60X G85E 394delTT G178R 711+1G>T L206W L227R 1342-6(5T/6T/7T) D443Y A445E Q493X 1078delT R334W R347H R347P 1609delCA I507del F508del 1677delTA G576X G576A E585X 1898+1G>A 1898+1G>T 1898+5G>T 1811-1,6kbA>G W846X 2789+5G>A 3272-26A>G Y1092X L1065P R1066C 3120+1G>A D1152H G1144E S1251N 3905insT W1282X 4005+1G>A 3849+10kbC>T Exons 1 2 3 4 5 6a 6b 7 8 9 10 11 12 13 14a 14b 15 16 17a 17b 18 19 20 21 22 23 24 Intron 11 Intron 19 E. Girodon, Hôpital H Mondor, Créteil 1500 mutations tout le long du gène 4016insT N1303K Q1313X Répartition des mutations en EUROPE UK DF508 DF508 : 80% BELGIQUE DF 508 G551D G542X ALLEMAGNE G542X N1303K DF508 ESPAGNE 621+1G>T 1717-1 1 G>A R553X DF 508 1717-1 1 G>A 2184 del A G542X G542X (R117H) W1282X G551D N1303K (R553X) R347P R1162X (1898+1 G>A) N1303K 711+1 G>T (N1303K) R334W ITALIE DF 508 G85E N1303K FRANCE DF 508 G542X G542X 1717-1 1 G> A N 1303 K W 1282 X 1717-1 G> A G551 D 45% R 1162X W1282X R553X (621+1 G> T) 1 G> A R553X 45% (621+1 G> T)
Types de mutations du gène sévères grands réarrangements non-sens 2% autres (en phase ins/del, 13% promoteur) 2% épissage 16% E. Girodon, Hôpital H Mondor, Créteil frameshift 20% faux-sens 47,5% sévères/modérées/neutres? Expression Pôle apical des cellules épithèliales Canaux pancréatiques atiques et biliaires Cyptes intestinales Arbre trachéo-bronchique Tubules rénaux, r appareil génital, g glandes sudoripares Pas de corrélation entre le taux d expression d et la pathologie
Fonctions Canal Cl limitant Régulateur d autres d canaux ioniques Favorise l exocytosel Régulation du ph intracellulaire Rôle dans l inflammationl protéine «réseau» Métabolisme de la protéine D après JR Riordan, Am J Hum Genet 1999
fonctions Cellules bronchiques Cl - ENaC sécrétion exocytose Golgi ATP RE Na+ H 2 0 PKa, PKc AMPc noyau biosynthèse fonctions Cellules bronchiques Cl- ORCC Cl- ORCC Cl - ENaC Inflammation récepteur de bactéries sécrétion exocytose Golgi ATP RE Na+ H 2 0 PKa, PKc AMPc noyau biosynthèse
fonctions Cellules pancréas SLC26 transporters Cl - HCO 3- Cl - Glutathion sécrétion ATP Na+ H 2 0 exocytose Golgi RE PKa, PKc AMPc noyau biosynthèse NBC cotransporters Na+ HCO 3- Corrélations génotype-phénotype phénotype Génotype Mutations de classes modérée / modérée sévère / très modérée Phénotype clinique Formes mono-symptomatiques de l adulte sévère / modérée Mucoviscidose- Fonction pancréatique conservée sévère / sévère Mucoviscidose- Insuffisance pancréatique
Q1411X R117H G551D F508del, N1303K W1282X Corrélations génotypeg notype-phénotype (+)) avec la fonction pancréatique atique (-)) avec l atteinte l respiratoire Facteurs intervenant dans la variabilité clinique?
Facteurs génétiques modificateurs de la mucoviscidose Expression phénotypique de la mucoviscidose variable (âge de début, gravité de l atteinte pulmonaire, positivité du test de la sueur ) nature des mutations Variabilité phénotypique pour un même génotype autres mutations du gène facteurs environnementaux Variabilité aussi au sein de fratries gènes modificateurs tractus génital glandes sudoripares pancréas exocrine pancréas endocrine intestin complications hépato-biliaires voies respiratoires mutations / gènes modificateurs Allèles les complexes du gène g F508del + R553Q R334W + R1158X Sévérité identique mais test de la sueur normal -102T>A + S549R R74W + D1270N G576A + R668C + D443Y R347H + D979A R117H + IVS8-5T La description d allèles complexes est de plus en plus fréquente (www.genet.sickkids.on.ca/cftr/), avec même l association de plusieurs polymorphismes qui aurait un effet synergique ou cumulatif délétère, et qui pourrait rendre compte de formes monosymptomatiques de l adulte.
Modulation du phénotype par le variant d épissage de l intron 8 F508del 5 8 9 10 3 TTTTTGA(TG)mTn (TG)mT5 TnAAACAG GGATTTGGG 7T ou 9T 8 9 10 ARNm normal 5T 8 10 ARNm délété de l exon 9 1 génotype : F508del / R117H 2 phénotypes (Kiesewetter et al., Nature Genet 93) F508del / R117H + IVS8-5T mucoviscidose Test de la sueur Nl F508del / R117H + IVS8-7T infertilité masculine par absence bilatérale des canaux déférents ou asymptomatique ou mucoviscidose très modérée? Modèles animaux 1992 3 modèles -/- Mort rapide par obstruction intestinale 1994 Dorin et al, insertion ex 10 Modèle survivant mais sans atteinte respiratoire majeure Phénotype variable suivant les lignées Etude des gènes g modificateurs par génome g scan Identification d un d locus Ch 7 (ch( 19q13) Rozmahel et al 1996 Très s nombreux modèles F508del, G542X.. Etude de la fonction de la protéine Nouvelles thérapeutiques
Diagnostic de la mucoviscidose Critères res pour établir le diagnostic de la mucoviscidose (Rosenstein and Cuttings Un ou plusieurs signes cliniques Ou un frère re ou une sœur s atteint Ou un dépistage néonatal n positif Cuttings JPediatr.1998) Et un test de la sueur positif à au moins 2 reprises Ou 2 mutations du gène g Ou une différence de potentiel nasale anormale Test de la sueur Cl spécifique Normal < 40 mmol/l nv né < 30 mmol/l Intermédiaire 30, 40 60 mmol/l Pathologique > 60 mmol/l Interprétation tation Age de l enfantl Débit de sueur Méthode de dosage Absence de contaminations Conductimétrie trie Normal < 50-60 mmol/l Intermédiaire 50 90 mmol/l Pathologique > 80-90 mmol/l très rares Faux négatifs Faux positifs Dénutrition,desydratation,fiévre,eczema Tr corticostéroides
Différence de Potentiel Transépithèliale Nasale D après I.Sermet-Gaudelus, BMC, 2006 Outils d éd étude du gène g Méthodes de détection ciblée trousses (20-30 mutations) Gène 190 kb 27 exons > 1000 mutations ponctuelles distribution et fréquence variables selon l origine géographique Méthodes de balayage d exons Recherche de remaniements (délétions, duplications, insertions) Analyse de microsatellites - étude indirecte pour cas urgents - exclusion du gène - détection de délétions, disomies uniparentales - diagnostic prénatal
CF (12) m PCR kit - La technologie ARMS La PCR n'a lieu que lorsque la séquence s cible est présente dans l'échantillon Primer ARMS spécifique de la séquence s cible P Extension par la Taq Polymérase Pas d'extension Primer commun Séquence ADN cible Séquence S d'adn non - cible P 3' 5' 3' 5' 5' 3' 5' 3' PRODUITS de PCR PAS de PRODUITS de PCR CF (12) m PCR kit - La technologie ARMS TUBE A DNA TUBE B Réaction ARMS 1 - Primer normal Réaction R ARMS 2 - Primer mutant commun commun n Si séquence s normale dans le DNA m Si séquence s mutée e dans le DNA Produit de PCR analysa nalysé sur gel Normal Homozygote Hétérozygote H Homozygote mutant Tube 1 Tube 2 Tube 1 Tube 2 Tube 1 Tube 2 n m n m n m
Mutations du gène 1717-1G>A G542X S549R G551D Q552X R553X R668C 2143delT G673X 2183AA>G 2184insA K710X R792X R1158X R1162X 3659delC R117H Y122X 621+1G>T E60X G85E 394delTT G178R 711+1G>T L206W L227R 1342-6(5T/6T/7T) D443Y A445E Q493X 1078delT R334W R347H R347P 1609delCA I507del F508del 1677delTA G576X G576A E585X 1898+1G>A 1898+1G>T 1898+5G>T 1811-1,6kbA>G W846X 2789+5G>A 3272-26A>G Y1092X L1065P R1066C 3120+1G>A D1152H G1144E S1251N 3905insT W1282X 4005+1G>A 3849+10kbC>T Exons 1 2 3 4 5 6a 6b 7 8 9 10 11 12 13 14a 14b 15 16 17a 17b 18 19 20 21 22 23 24 Intron 11 Intron 19 KIT Elucigene CF 30 mutations France Détection de 81 à 85 % des allèles mutés De la population française caucasienne 4016insT N1303K Q1313X Remaniements du gène 0 50 100 150 200 250 (kb) 5 '- 3 ' 1 2 3 4 5 6a 6b 7 89 10 11 12 13 14a1617a17b 1819 14b 15 20 21 22 2324 dup4-8 dup11-13 dele17b dele1* dele2* dele4 dele14a dele17b dele19 dele21 dele2,3 (21kb) dele4-6a dele2-10 (95,7kb) dele2-6b dele3-10,14b-16 dele4-10 (40kb) dele11-16 dele16-17b dele14b-18 (20kb) dele14b-17b (10kb) dele17a-17b (2.5kb) dele17a-18 (8.6kb) dele17b-18 dele22-23* dele4-7 (10kb) + 11-18 (40kb) dele (>3Mb) 2% des anomalies mais 20% des mutations non identifiées E. Girodon, Hôpital H Mondor, Créteil
Détection de réarrangements du gène par PCR quantitative multiplex fluorescente ex 17a ex 17b délétion des exons 17a et 17b ex 6a ex 5 ex 4 duplication des exons 4 à 8 Problèmes posés s par l identification d une d mutation Réponse à la question posée : Explication du phénotype observé? Prédiction du phénotype? Implications pour le conseil génétique? mutations tronquant la protéine mutations faux-sens Pas de test fonctionnel simple et disponible en routine - génétiques: fréquence allélique (1%); chromosomes non CF? - localisation dans le gène / protéine - interférence avec l épissage - biochimie: Hydrophobe/phile? Polaire/apolaire? Acide/basiquec? - phylogénétique - autres mutations similaires - autres mutations ABCC similaires Pas de critère absolu Babouin Macaque Homme Lapin Mouton Vache Souris Grenouille Requin Takifugu Killifish Saumon Prim.cons. V754M? 750 760 770 ILPRISVISTGPTLQAR-RRQSVLNLMTHS- ILPRISVISTGPTLQAR-RRQSVLNLMTHS- ILPRISVISTGPTLQAR-RRQSVLNLMTHS- ILPRSNMINTGPMLQGC-RRQSVLNLMTHS- ILPRSNAVNSGPTFLGG-RRQSVLNLMTCSS ILPRSNAVNSGPTFLGG-RRQSVLNLMTGSS ALPRSNMIATGPTFPGR-RRQSVLDLMTFT- SLPRSNFLNTGPTFQGR-RRQSVLNLMTRTS TKPRSNIFKSELPFQAH-RRQSVLALMTHS-- VLPRSNAYHHGLHHLSGQRRQSVLAFITTS--- ALPRSNLYHHVLQHLNG-RRQSVLAFITNA--- SLPRGNLYHDGLQHLSGQRRQSVLQFITNA--- **. ****** ::* : ILPRSN2INTGPTFQG2QRRQSVLNLMTHSS
Génotype : Etudes familiales F508del G542X F508del G542X F508del R553Q? F508del R533Q? Dépistage néonatal n de la mucoviscidose Programmes existants USA : Wisconsin et Colorado Australie et Nouvelle-Zélande lande France : Bretagne, Normandie et pays de la Loire Protocoles associant TIR à J3 et recherche de mutations dans le gène g Elaboration d un programme adapté à la France par l AFDPHE
Trypsine Immuno Réactive Elévation de la TIR dans le sang persistant pendant le premier mois de vie Méthode radio-immunologique immunologique (Cis( bio) Méthode immuno-fluorim fluorimétrique (Delfia) Seuils (0.5%) Faux positifs Stratégie en 2 temps : TIR puis BM Faux négatifsn DEPSTAGE NEONATAL DE LA MUCOVISCIDOSE Laboratoire de dépistage IRT > 65 µg/l Laboratoire de génétique moléculaire 1 Recherche 30 mutations M/M M/X X/X IRT > seuil 3 Laboratoire de biochimie Test de la sueur Positif limite négatif CRCM Prise en charge + conseil génétique Laboratoire de génétique moléculaire 2 Balayage du gène
Avantages Dépistage Organisation en CRCM Suivi des patients standardisés Limites Faux négatifsn Dépistage des hétérozygotesh Dépistage des formes frustres STRATEGIE D ETUDE PATIENT Né AVT 2003 Symptomes cliniques Test de la sueur Positf X2 Intermédiaire X2 Négatif X2 CRCM BM 30 mutations Symptômes Cliniques +++ arrêt arret -/- -/- Consanguins Population particulière +/- +/+ CRCM Screening du gène -/- D.Feldmann, Trousseau, Paris +/- +/+?
STRATEGIE D ETUDE PATIENT Né en 2003 et après Symptomes cliniques Test de la sueur Positf X2 Intermédiaire X2 Négatif X2 CRCM BM 30 mutations +/+ +/- -/- arrêt Screening du gène +/+ +/- -/-? D.Feldmann, Trousseau, Paris Indications d étude du gène 1 - Conseil génétique cas index + parents Recherche du statut de porteur sain chez les apparentés Recherche du statut de porteur sain chez les conjoints 2 - Aide au diagnostic Approche directe uniquement Mucoviscidose - formes atypiques - iléus méconial - suspicion chez le fœtus sur signe d appel échographique Diagnostic prénatal risque de mucoviscidose = 1/4 Couples à risque E. Girodon, Hôpital H Mondor, Créteil Formes mono-symptom. de l adulte - stérilité masculine par ABCD - dilatation des bronches - pancréatites chroniques 3 - Dépistage néonatal Encadrement particulier
Étroite collaboration Clinicien CRCM clinicien Biologiste moléculaire, généticien - documentation clinique - suivi des patients - réseau : projets de recherche Unités de recherche