TP : Le complexe immun Les anticorps neutralisent une molécule étrangère (antigène) en reconnaissant une partie de celle-ci ( = déterminant antigénique) et en se liant avec elle pour former ce que l on appelle un complexe immun. On cherche à déterminer les caractéristiques d un complexe immun et à mettre en évidence le déterminant antigénique d un antigène. Matériel : de réalisation du test d Ouchterlony et de sérodiagnostic de la syphilis, logiciels Rastop, fiches compte-rendu Activités et déroulement des activités Capacités et critères d évaluation Barème - Mise en ordre phases protocole - Réaliser un protocole 1 ) Pendant le temps d attente, Ouvrir le document sur la méthode d Ouchterlony à l adresse indiquée au tableau. Placer dans l ordre les 4 images du protocole et imprimer. Compléter et légender à la main en précisant l intérêt d avoir mis de l eau distillée dans 1 des puits, interpréter les résultats et conclure sur les caractéristiques des anticorps présents ici. - Expliquer un protocole - Proposer une conclusion répondant au problème posé. 3 3) Lire les informations sur la syphilis et observer les résultats du test effectué selon le protocole et les consignes fournies. Rédiger les résultats de ce test dans le II- du compte-rendu (poly distribué) puis Justifier l intérêt de l électronographie du complexe immun. - Rendre compte d une observation - Utiliser un logiciel pour traiter 1 image - Rendre compte d une observation en complétant un schéma 1 - Utiliser un logiciel pour répondre à un problème I Provoquer l apparition d un complexe immun et comprendre les conditions de sa formation : Test d immunodiffusion = test d Ouchterlony et sérodiagnostic de la syphilis 1)- Lire la fiche technique du protocole expérimental et réaliser les parties II et III. Appeler le professeur pour montrer les boîtes. II- Mise en évidence de la relation antigène - anticorps 4) Ouvrir, dans le logiciel Rastop, l image d un anticorps entier IGGTOTAL.pdb (adresse au tableau). A l aide des fonctionnalités du logiciel, mettre en évidence qu un anticorps est constitué de chaînes lourdes et de chaînes légères que vous comparerez à. Appeler pour vérification Compléter le schéma d anticorps du compte-rendu en précisant les résultats de votre comparaison (nombre d acides aminés inclus). 5) Le lysozyme est une enzyme bactéricide que l'on trouve dans la salive. Injectée dans un autre organisme, elle provoque la production d'anticorps. Sur le poly distribué, on vous fournit 3 portions de la séquence d acides aminés du lysozyme dont on suppose qu'elles déterminent une réponse immunitaire (déterminant antigénique). Pour le vérifier : Ouvrir, dans le logiciel Rastop, l image d un fragment d anticorps fixé au lysozyme IGG-LYZ.pdb (adresse au tableau). A l aide des fonctionnalités du protocole Rastop, mettre en évidence quelle partie de l anticorps se lie à l antigène (le lysozyme sera rouge). Faire apparaître en sphères les 3 séquences du lysozyme supposées être des déterminants antigéniques. Les colorer différemment et déterminer la ou les séquences qui font partie du déterminant antigénique. Appeler le professeur pour vérification. 6) Compléter le schéma d anticorps du compte-rendu en représentant correctement le(s) antigène(s) en rouge et en plaçant les légendes : «site de fixation à l antigène, antigène et déterminant antigénique (séquence(s) à préciser).» 7) Schématiser dans le cadre prévu, le complexe immun dans le cas du sérodiagnostic de la syphilis en utilisant les modèles moléculaires proposés. 8) Conclure en identifiant ce qui s est produit dans l arc de précipitation obtenu dans le test d Ouchterlony et dans l'agglutination du test de la syphilis en combinant toutes les observations faites. Ranger le poste de travail - Rendre compte d'une observation sur un schéma - rendre compte d'un résultat par un schéma - Proposer une conclusion répondant au problème posé. 3
TP : Le complexe immun I Le test d Ouchterlony (cliquer sur adresse pour voir l animation : http://www.ac-creteil.fr/biotechnologies/doc_ouchterlonytest.htm) 1) Protocole expérimental ) Résultat et conclusion (voir livre Hatier TSob p130)
II Caractéristiques du complexe immun et de ses constituants : Résultat du sérodiagnostic de la syphilis et justification de l électronographie : Déterminant Antigénique Bille de latex 50 nm Electronographie d un complexe immun Anticorps Modèles moléculaires Schéma du complexe immun Nom et n des acides aminés des séquences de l antigène : - Séquence 1 = Gly- Tyr3- Ser4- Leu5- Gly6 - Séquence = Ser60- Arg61- Trp6- Trp63- Cys64- Asn65 - Séquence 3 = Gly117 Thr118 Asp119- Val10- Gln11- Ala1 Identification de la (es) séquence(s) faisant partie du déterminant antigénique (logiciel Rastop) : antigène syphilitique Conclusion :
Fiche protocole pour la recherche de la spécificité d un anticorps par le test d Ouchterlony Principe de la méthode d Ouchterlony C est l immunodiffusion sur gel : les solutions déposées dans les puits creusés dans le gel diffusent de façon homogène dans toutes les directions autour du puits. Deux auréoles de diffusion peuvent donc entrer en contact lorsqu elles ont suffisamment progressé. Cette zone de contact reste invisible s il n y a pas de réaction entre les deux solutions. Quand il y a réaction entre les solutions, il se forme un arc de précipitation visible à l oeil nu. Celui-ci est dû à l interaction entre de nombreux anticorps et les antigènes spécifiques, entraînant la formation d un complexe immun. NB : le temps de réaction avec les produits véritables est de l ordre de 4h ; vous manipulez ici sur des produits de substitution mimant les réactions réelles mais permettant une lecture des résultats au bout de 40 min. Cependant, après avoir réalisé le protocole, vous interpréterez les résultats présentés dans l animation puis vous comparerez avec ce que vous obtenez dans votre boîte. PROTOCOLE - NB : organiser votre poste de travail pour manipuler proprement I - Préparation d un gel d Agar (=gélose) à couler dans la boite de Pétri N 1 à 7 réalisés par le préparateur pour tout le groupe 1. Peser dans la coupelle 0,g d Agar prélevés à l aide de la spatule.. Verser 14 ml de tampon puis l Agar dans le Bécher et dissoudre soigneusement l Agar avec la spatule. 3. Chauffer le mélange en remuant à la spatule jusqu à ce que le mélange devienne limpide et arrêter au tout début de l ébullition. 4. Retirer à l aide de la pince en bois et attendre une minute pour manipuler le Bécher sans se brûler. 5. Pipeter 10ml de gel d Agar chaud et fluide et le verser dans la boîte de Pétri. 6. Egaliser le niveau et supprimer rapidement les bulles. 7. Ne pas remuer les boîtes avant la prise du gel d Agar par refroidissement : environ 5 min. II- Préparation du test 1. S exercer avec l une des boîtes de pétri contenant de la gélose pour creuser les puits avec le gabarit, l emporte-pièce et le cure-dent.. Utiliser le gabarit fourni pour creuser les puits nécessaires dans le gel d Agar de l autre boite de Pétri. 3. Utiliser le cure-dent pour éliminer les disques de gélose si nécessaire. III- Réalisation du test 1. Numéroter, avec un feutre sur le rebord externe de la boîte de Pétri, les puits comme le protocole internet, le puits périphérique supplémentaire que vous avez sera le n 6 et contiendra de l eau distillée.. S exercer avec la boîte d apprentissage et de l eau distillée à placer une goutte par puits. 3. Remplir les puits : chaque produit, prélevé dans un tube étiqueté avec un compte goutte propre, doit être déposé dans le puits approprié sans débordement ni bulles et sans endommager le gel d agar. 4. Laisser la diffusion se faire pendant 40 minutes. 5.Observer les résultats sur fond noir et en éclairage rasant et comparer avec ceux du site internet.
Mise en évidence d un complexe immun par le sérodiagnostic de la syphilis Bactérie Tréponème x 1300 Présentation La syphilis, maladie hautement contagieuse, est essentiellement transmise au cours des rapports sexuels et par voie transplacentaire. Il s'agit d'une maladie bactérienne causée par le Tréponème. Parmi les antigènes tréponémiques (Ag) qui provoquent la formation d'anticorps spécifiques, se trouvent des phospholipides. Le VDRL - Latex Pasteur utilisé ici est constitué de particules de latex sur lesquelles sont fixés les phospholipides tréponémiques (voir modèles moléculaires dans le compte-rendu). Il permet d'effectuer rapidement sur une lame de verre le diagnostic de la syphilis à partir du sérum d un individu. PROTOCOLE Tous les produits biologiques utilisés sont inoffensifs ; 1- Organiser votre plan de travail pour manipuler proprement. - Repérer les tests avec le marqueur : sur la lame noire, au dessus de l ovale gauche indiquer SC = sérum contaminé et au dessus de l ovale droit indiquer ED = eau distillée. 3- Déposer à l aide d une pipette propre une goutte de sérum SC dans l ovale gauche puis avec une autre pipette propre une goutte d ED dans l autre ovale. 4- Agiter le réactif VDRL et déposer 1 goutte (environ 0µL) de VDRL latex dans chaque goutte précédente. 5- A l aide d un petit agitateur plastique propre pour chaque test, mélanger les gouttes dans chaque ovale pendant à 3 min, 6- Observer les résultats à l œil nu (éventuellement à la loupe) 7- Après les observations, placer le matériel utilisé dans le pot «poubelle».
Partie II : Exemple de résultat après le traitement de l'image IGG-LYZ.pdb par Rastop (question 5):