LES PROTEINES SERIQUES. I - Electrophorèse II Détection et dosage spécifique des différentes protéines sériques

LES PROTEINES SERIQUES INTRODUCTION A - METHODES D ANALYSE I - Electrophorèse II Détection et dosage spécifique des différentes protéines sériques B - ETUDE DE QUELQUES PROTEINES SERIQUES I - L albumine II - Transferrine ou sidérophiline et métabolisme du fer

LES PROTEINES SERIQUES INTRODUCTION - Composition du sang - Plasma et sérum * protéines totales du sérum: 65 à 83 g/l chez l adulte les protéines plasmatiques sont augmentées de 3g/L - Historique: la précipitation fractionnée * albumine et globulines: rapport A/G = 1,2-1,8

LES PROTEINES SERIQUES ET URINAIRES INTRODUCTION A - METHODES D ANALYSE I - Electrophorèse 1 Electrophorèse sérique normale: en gel d acétate de cellulose ou agarose électrophorèse capillaire 2 Exemples de profils pathologiques II Détection et dosage spécifique des différentes protéines sériques

ELECTROPHORESE A ph 8,6

Electrophorèse sur acétate de cellulose ou agarose Dépôts des échantillons Migration à ph alcalin Coloration-décoloration Intégration Interprétation

Dépôt Dépôt

LES PROTEINES SERIQUES INTRODUCTION A - METHODES D ANALYSE I - Electrophorèse 1 Electrophorèse sérique normale: en gel d acétate de cellulose ou agarose électrophorèse capillaire 2 Exemples de profils pathologiques II Détection et dosage spécifique des différentes protéines sériques

Schéma de l électrophorèse capillaire Détecteur Injection Température Contrôlée Migration Tampon Tampon Générateur HT

DETECTION INJECTION Anode + Électro-endosmose Migration des protéines Champ électrique Charges positives de la solution tampon Charges négatives des parois du capillaire Forte différence de potentiel générant un important courant d électro-endosmose. Ce courant, plus important que le champ électrique, entraîne les protéines du coté cathodique.

Identification des fractions a-1 glycoprotéine acide a-1 antitrypsine Haptoglobine a-2 macroglobuline Complément C3 Transferrine Hémopexine

ELECTROPHORESE DES PROTEINES SERIQUES Six groupes : - Albumine (35 à 48 g/l) - a1-globulines (2 à 3,5 g/l) a1-glycoprotéine acide ou orosomucoïde a1-antitrypsine ou a1-antiprotéase - a2-globulines (5 à 8,5 g/l) a2-macroglobuline (MM = 820 000 Da) haptoglobine - b1-globulines (3,2 à 5,2 g/l) transferrine ou sidérophiline hémopexine - b2-globulines (2,1 à 5 g/l) protéines du complément C3 et C4 IgA - g-globulines ou immunoglobulines: anticorps de l organisme (8 à 13,5 g/l) IgG quantitativement les plus importantes (10 g/l) IgM, IgD et IgE

Valeurs normales: Protéines totales: 65 83 g/l Fractions % g/l Albumine 55,1 65,7 35-48 Alpha 1 3,1 5,6 2 3,5 Alpha 2 8,0 12,7 5 8,5 Bêta 1 4,9 7,2 3,2 5,2 Bêta 2 3,1 6,1 2,1-5 Gamma 10,3 18,2 8 13,5

Electrophorèse des protéines : exemple d un profil normal PROTEINES 75 g/l N: 65-83 Commentaire : Protéinogramme normal. FRACTIONS % ALBUMINE : 56 ALPHA 1 : 4,6 ALPHA 2 : 10,4 BETA 1 : 5,9 BETA 2 : 5,9 GAMMA : 17,2 g/l NORMALES g/l : 42 ( 35-48 ) : 3,4 ( 2-3,5) : 7,8 ( 5,0-8,5 ) : 4,4 ( 3,2-5,2 ) : 4,4 ( 2,1-5 ) : 12,9 ( 8-13,5 )

LES PROTEINES SERIQUES INTRODUCTION A - METHODES D ANALYSE I - Electrophorèse sur acétate de cellulose ou agarose 1 Electrophorèse normale 2 Exemples de profils pathologiques II Détection et dosage spécifique des différentes protéines sériques

Inflammation: Ensemble des modifications vasculaires, tissulaires et humorales d un organisme en relation avec une atteinte à son intégrité Une réaction inflammatoire peut être d origine: - traumatique - toxique - mécanique - thermique - infectieuse - (auto)-immune

Variation des protéines de la réaction inflammatoire: synthèse protéique globalement augmentée Remarque: la procalcitonine ou PCT est un marqueur très intéressant pour caractériser une infection aigüe bactérienne

Electrophorèse des Protéines : ex de profil inflammatoire PROTEINES * 84 g/l N: 65-83 ALBUMINE 45,5 % Soit 38,2 g/l N: 35-48 ALPHA 1 9,0 % Soit * 7,6 g/l N: 2-3,5 ALPHA 2 20,6 % Soit * 17,3 g/l N: 5-8,5 BETA 1: 4,6 % Soit 3,9 g/l N: 3,2-5,2 BETA 2: 6,6 % Soit * 5,5 g/l N: 2,1-5 GAMMA 13,7 % Soit 11,5 g/l N: 8,0-13,5 Conclusion : Elévation des alpha-1 et alpha-2 globulines: Profil inflammatoire. Pas d'anomalie monoclonale détectable au niveau des gammaglobulines.

Electrophorèse des protéines : ex de bloc bêta-gamma chez un patient cirrhotique PROTEINES * 59 g/l N: 65-83 g/l FRACTIONS % g/l (NORMALES) ALBUMINE : 42,8 % * 25,3 ( 35-48 ) ALPHA 1: 7,1 % * 4,2 ( 2-3,5 ) ALPHA 2: 6,6 % * 3,9 ( 5,0-8,5 ) BETA 1 : 6,2% : 3,7 ( 3,2-5,2 ) BETA 2 : 8,7% :* 5,1 ( 2,1-5 ) GAMMA : 28,6% :* 16,9 ( 8-13,5 ) Commentaire : Hypoalbuminémie. Présence d'un bloc béta/gammaglobulines. Pas d anomalie monoclonale visible.

Electrophorèse des Protéines : ex d hypogammaglobulinémie chez un patient ayant un traitement immunosuppresseur dans le cadre d une allogreffe PROTEINES * 62 g/l N: 65-83 ALBUMINE 69,3 % Soit 43,0 g/l N: 35-48 ALPHA 1 4,8 % Soit 3,0 g/l N: 2-3,5 ALPHA 2 10,7 % Soit 6,6 g/l N: 5-8,5 BETA 1: 5,7 % Soit 3,5 g/l N: 3,2-5,2 BETA 2: 3,9 % Soit 2,4 g/l N: 2,1-5 GAMMA 5,6 % Soit * 3,5 g/l N: 8,0-13,5 Conclusion : Hypogammaglobulinémie expliquée par le contexte clinique Pas d'anomalie monoclonale détectable au niveau des gammaglobulines.

Electrophorèse des Protéines : ex de pic monoclonal PROTEINES * 86 g/l N: 65-83 ALBUMINE 42,4 % Soit 36,5 g/l N: 35-48 ALPHA 1 4,9 % Soit * 4,2 g/l N: 2-3,5 ALPHA 2 12,0 % Soit * 10,3 g/l N: 5-8,5 BETA 1: 5,2 % Soit 4,5 g/l N: 3,2-5,2 BETA 2: 6,4 % Soit * 5,5 g/l N: 2,1-5 GAMMA 29,1 % Soit * 25,0 g/l N: 8,0-13,5 Conclusion : Présence d un pic monoclonal à cheval sur bêta 2 et gamma. Elévation des alpha-1 et alpha-2-globulines. Baisse des immunoglubulines polyclonales dans un contexte clinique connu. L immunofixation permet de caractériser cette dysglobulinémie monoclonale

Gammapathie IgG kappa Immunofixation G A M K L Pic g monoclonal

Gammapathie IgG kappa G A M K L Pic g monoclonal

Gammapathie IgA lambda G A M K L Zone b2

LES PROTEINES SERIQUES INTRODUCTION A - METHODES D ANALYSE I - Electrophorèse sur acétate de cellulose ou agarose II Détection et dosage spécifique des différentes protéines sériques

Détection d'une protéine spécifique par la méthode de Western blot (Immunoblot) Echantillon Marqueurs colorés Marqueurs de taille (kda) Transfert sur membrane AC spécifique marqué radioactivement Autoradiographie 160 80 40 20 10 Electrophorèse

Méthode ELISA pour le dosage quantitatif d une protéine Support Protéine Antigène ENZ Substrat incolore 1er Ac 2e Ac couplé Produit coloré

Néphélométrie et turbidimétrie Détecteur néphélométrique (signal de lumière diffusée) Lampe source Filtre Faisceau incident Détecteur turbidimétrique (Extinction du signal lumineux) Cuvette réactionnelle

LES PROTEINES SERIQUES B - ETUDE DE DEUX PROTEINES SERIQUES I - L albumine 1 - Métabolisme 2 - Trois rôles majeurs 3 - Variations pathologiques II - Transferrine ou sidérophiline et métabolisme du fer

L ALBUMINE Introduction: La plus abondante des protéines sériques: Concentration: 35 à 48 g/l Masse moléculaire: 67 000 daltons phi bas: 4,7

L ALBUMINE (Suite) 1 ) Métabolisme: - Synthèse hépatique: 10 à 15g/j: la moitié de l ensemble des protéines hépatiques; réserve fonctionnelle de synthèse (x 2 à 3 fois) - Répartition: 40% dans le plasma, 60% dans le secteur EV - Demi-vie de 3 semaines - Dégradation essentiellement dans l intestin Albuminurie physiologique très faible < 30mg/24h Microalbuminurie : 30 à 299mg/24h Macroalbuminurie : > 300mg/24h

2 ) Trois rôles majeurs: L ALBUMINE - Pression osmotique ou oncotique plasmatique - Fonction de transporteur - Réserve faible mais mobilisable d AA

+ 12 mmhg artérioles : pression hydrostatique 37 oncotique 25 + 12 Pression résultante +1 mmhg Espace interstitiel - 8 mmhg veinules : pression hydrostatique 17 oncotique 25-8 Pathologie : si Alb P. onc. Pression résultante entre EI et veinules devient proche de zéro : oedèmes

L ALBUMINE 2 ) Trois rôles majeurs: - Pression osmotique - Fonction de transporteur: médicaments, hormones, bilirubine, acides aminés, acides gras libres, calcium - Réserve faible mais mobilisable d AA

L ALBUMINE (Suite) 3 ) Variations pathologiques: Pas d hyperalbuminémie vraie : hémoconcentration par deshydratation a) Hypoalbuminémie: * Augmentation des pertes: - urinaires: syndrome néphrotique - digestives: exsudation dans certaines entéropathies * Diminution de la synthèse - malnutrition importante (sujet âgé, kwashiorkor) - déficit hépatique (cirrhose à un stade avancé) Cas particulier d une bis-albuminémie - anomalie héréditaire (rare) - liaison à certains antibiotiques

Electrophorèse des Protéines : ex de syndrome néphrotique Conclusion : Hypoalbuminémie. Rapport A/G abaissé: 0,93 (Nal: 1,2-1,8) Elévation des alpha-2 globulines (alpha-2 macroglobuline) Hypo béta-1 globulinémie (position transferrine). Aucune autre anomalie qualitative et/ou quantitative détectable. A noter : gamma limite basse PROTEINES * 53 g/l N: 65-83 ALBUMINE: 48,1 % Soit * 25,5 g/l N: 35-48 ALPHA 1: 4,5 % Soit 2,4 g/l N: 2-3,5 ALPHA 2: 19,4 % Soit * 10,3 g/l N: 5-8,5 BETA 1: 5,3 % Soit * 2,8 g/l N: 3,2-5,2 BETA 2: 6,8 % Soit 3,6 g/l N: 2,1-5 GAMMA 15,9 % Soit 8,4 g/l N: 8,0-13,5

Dénutrition chez la personne âgée (1) Mesure des marqueurs nutritionnels - Poids et taille Indice de masse corporelle: IMC = Poids (kg)/taille au carré (m 2 ) (Nal = 18,5-25 kg/m 2 ) - Albumine (mais pas spécifique: inflammation) - Transthyrétine ou préalbumine (transporteur de la thyroxine (ou T4) et de la vit A) Synthèse hépatique, SNC et pancréas Demi-vie: 2 à 3 jours marqueur sensible et précoce Valeur normale = 0,25 à 0,35 g/l

Dénutrition chez la personne âgée (2) Critères de dénutrition selon l HAS: - Perte de poids > 10% en 6 mois - Indice de masse corporelle < 21 kg/m 2 - Albumine < 35g/l (vérifier l absence d inflammation par la CRP) - Transthyrétine ou préalbumine < 0,25g/l

LES PROTEINES SERIQUES B - ETUDE DE QUELQUES PROTEINES SERIQUES II - Transferrine ou sidérophiline et métabolisme du fer 1 - Structure et rôle biologique 2 - Exploration du métabolisme du fer 3 - Pathologie: Hémochromatose primitive

Transferrine ou Sidérophiline et métabolisme du fer Structure Sialoglycoprotéine migrant au niveau de la fraction b1-globuline Dosage spécifique néphélométrique: 2-3 g/l (25-40mmol/L) Nombreux variants: - Forme CC: normale (95%) -Variants B1, B2, D, (5%) Rôle biologique Transport du fer dans l organisme Fixation de 2 atomes de fer Fe +++ Délivrance aux cellules périphériques par l intermédiaire d un récepteur spécifique

ELECTROPHORESE DES PROTEINES SERIQUES Six groupes : - Albumine (35 à 48 g/l) - a1-globulines (2 à 3,5 g/l) a1-glycoprotéine acide ou orosomucoïde a1-antitrypsine ou a1-antiprotéase - a2-globulines (5 à 8,5 g/l) a2-macroglobuline (MM = 820 000 Da) haptoglobine - b1-globulines (3,2 à 5,2 g/l) transferrine ou sidérophiline hémopexine - b2-globulines (2,1 à 5 g/l) protéines du complément C3 et C4 IgA - g-globulines ou immunoglobulines: anticorps de l organisme (8 à 13,5 g/l) IgG quantitativement les plus importantes (10 g/l) IgM, IgD et IgE

La Structure transferrine de la transferrine Isoformes de la transferrine

CC variant Profil électrophorétique des différents variants de la transferrine

Transferrine ou Sidérophiline et métabolisme du fer Structure Sialoglycoprotéine migrant au niveau de la fraction b1 globuline Dosage spécifique néphélométrique: 2-3 g/l (25-40mmol/L) Nombreux variants: - Forme CC: normale (95%) -Variants B1, B2, D, (5%) Rôle biologique Transport du fer dans l organisme Fixation de 2 atomes de fer Fe +++ Délivrance aux cellules périphériques par l intermédiaire d un récepteur spécifique

Le pool du fer dans l organisme: 3800 mg 600mg 1000mg 25-30 mg/j 10-20mg/j 1-2mg/j 2000mg 200mg Pertes: 1-2mg/j

Absorption intestinale du fer au niveau du duodénum Pôle apical Pôle basolatéral Fe(II) Fe(III) Dcyt b Hème Nramp2/DMT1 HCP1 Fe(II) Hème Stockage (ferritine) Dcyt b = ferriréductase Nramp2 = transporteur au pôle apical Ferroportine = transporteur au pôle basolatéral Héphaestine = ferroxydase HCP1 = transporteur de l hème Ferroportine Fe(II) héphaestine Fe(II) Fe(III) Transferrine

récepteur de la transferrine RTf apotransferrine Fe(III) transferrine diferrique Membrane cellulaire Endosome (ph 5,5) vésicule d endocytose Fe(II) stockage (ferritine) Fe(II) utilisation (hémoglobine, cytochromes) Cycle d endocytose de la transferrine

Le pool du fer dans l organisme: 3800 mg 600mg 1000mg 25-30 mg/j 10-20mg/j 1-2mg/j 2000mg 200mg Pertes: 1-2mg/j

Recyclage du fer héminique par les macrophage (rate, moelle, foie): Erythrophagocytose Globule rouge sénescent Fe(II) Céruloplasmine Fe(II) Ferroportine Fe(III) Bilirubine apotransferrine Fe(III) transferrine diferrique

REGULATION DE L ABSORPTION PAR L HEPCIDINE Petit peptide de 25 AA: hormone hyposidérémiante synthétisé et sécrété par le foie ++ agent anti-infectieux expression augmentée par un régime riche en fer et par l inflammation régulateur de l homéostasie du fer Inhibition de l absorption intestinale Inhibition du relargage du fer par les macrophages

Mécanisme de régulation de l absorption du fer par l hepcidine Fe(II) DMT1 Fe(II) Ferroportine Fe(II) Foie Hepcidine Ferroportine Fe(II) DMT1 Fe(II) Lysosome Ferritine Internalisation et dégradation de la ferroportine dans le lysosome Inhibition de l export et élimination du fer par exfoliation de l entérocyte

L HEPCIDINE: Hormone de régulation du fer 1 ) L excès de fer ou l inflammation entraîne une augmentation de l expression de l hepcidine aboutissant à : - diminution de l absorption intestinale - diminution de la libération de fer par les macrophages 2 ) Le déficit en fer, l érythropoïèse inefficace et l hypoxie entraînent une diminution de l expression de l hepcidine aboutissant à: - l augmentation de l absorption intestinale - libération du fer des macrophages

2 - Exploration du métabolisme du fer Paramètres hématologiques: Numération, hématocrite, Hb Fer sérique: 13 à 27 µmol/l (F) ou 15 à 30 mmol/l (H) Transferrinémie (Tf): 25 à 40 mmol/l Capacité totale de fixation (CTF) = Tf x 2: 50 à 80 mmol/l Fer sérique Coefficient de saturation (CST) = = 0,30 CTF Ferritinémie = 30 à 200 mg/l (F) ou 50 à 300 mg/l (H) Récepteur soluble de la Tf : srtf

LES PROTEINES SERIQUES B - ETUDE DE QUELQUES PROTEINES SERIQUES III - Transferrine ou sidérophiline et métabolisme du fer 1 - Structure et rôle biologique 2 - Exploration du métabolisme du fer 3 - Pathologie

mmol/litre Capacité totale de fixation Capacité latente de fixation Fer sérique 80 60 40 20 10 NORMAL Sidéropénie 6-9 mois de la grossesse Infection inflammation Syndrome néphrotique Hémochromatose

PROT: 61g/l ALB/GLOB: 1,38

Détermination de la transferrine désialylée ou carboxy-déficiente (CDT) Marqueur biochimique d une consommation excessive d alcool Tf sous de multiples formes: asialo, mono-, di-, tri-, tétra-, penta-, hexa-sialotransferrine Forme majoritaire nale: tétrasialotransferrine CDT = (a- + mono- + di-sialotf)/total Tf x 100 Valeur normale < 1,9% Augmentation en cas d alcoolisme chronique

Fractions intervenant dans le calcul de la CDT Différentes formes sialylées de la Tf chez un consommateur modéré et un abuseur d alcool

Hémochromatose primitive Maladie génétique la plus fréquente en Europe du Nord Caractérisée par une hyperabsorption intestinale du fer - surcharge multiviscérale progressive (à partir de 40 ans chez l homme, 50 ans chez la femme) Anomalies biologiques du bilan martial - coefficient de saturation de la Tf compris entre 0,60 et 1 - élévation du fer sérique (peu spécifique) - ferritinémie élevée: d autant plus que la maladie est évoluée

Génétique - Forme la plus fréquente: hémochromatose de type 1 Gène en cause: HFE localisé au voisinage du locus HLA (chr 6) : 1 mutation prédominante: C282Y 1 mutation fréquente mineure: H63D Ces deux mutations sont responsables de 70 à 95% des cas d hémochromatose génétique. - D autres gènes récemment découverts sont responsables de formes particulières de la maladie: *Hémochromatoses juvéniles (type 2A et 2B) *Hémochromatose de type 3 etc

Classification des surcharges primitives en fer Génes Localisation Protéine Surcharges généralisées Hémochromatose de type 1 Hémochromatose juvénile de type 2A HFE HJV 6p22 1q21 HFE 1 Hémojuvéline Hémochromatose juvénile de type 2B HAMP 19q13 Hepcidine Hémochromatose de type 3 RTF2 7q22 RTf 2 Hémochromatose de type 4 SLC40A1/IREG1 2q Ferroportine a-transferrinémie TRANSFERRINE 3q21 Transferrine a-céruloplasminémie CERULOPLASMINE 3q21-24 Céruloplasmine Surcharges localisées Anémie sidéroblastique liée à l'x Anémie sidéroblastique liée à l'x avec ataxie ALAS -2 ABC7 Xq11-21 Xq13 ALAS-e ABC7 Ataxie de Friedreich FRATAXINE 9q13 Frataxine Neuroferritinopathie FERRITINE L 19q13 Ferritine L Syndrome de Hallervorden-Spatz PANK2 20p13 PANK2 Diagnostic différentiel Syndrome hyperferritinémie/cataracte FERRITINE L 19q13 Ferritine L

Dénominateur commun de toutes les formes : Taux anormalement bas d hepcidine en regard de la surcharge systémique en fer Traitement: - Saignées répétées jusqu à normalisation du paramètre biologique de surcharge en fer: ferritinémie < ou = 200mg/L (F) < ou = 300mg/L (H) - Enquêtes familiales : prévention de la maladie.