2h sans document L3 BIO32 IMMUNOLOGIE FONDAMENTALE Session 1, décembre 27 SUJET: On génère au laboratoire des souris homozygotes pour une déficience au niveau des gènes codant pour les récepteurs de type TOLL, soit TLR2 (souris TLR2-/-) soit TLR4 (souris TLR4-/-). 1 Dans une 1ere expérience on analyse la survie de ces animaux en situation de choc septique crée par injection intrapéritonéale de lipopolysaccharide (LPS). Expliquez le fondement de cette manipulation et le résultat obtenu présenté sur la figure 1. Survie (%) 1 8 6 4 2 1 2 3 4 5 6 Jours contrôle TLR2-/- TLR4-/- FIGURE 1 Analyse comparative de la survie des souris contrôles ou déficientes pour le gène TLR2 (TLR2-/-) ou TLR4 (TLR4-/-) après choc septique induit par injection intrapéritonéale de LPS. Les récepteurs de type TOLL (TLRs = Toll-like receptors) sont des récepteurs de l immunité innée (PRRs = pattern recognition receptors). Ils reconnaissent des motifs conservés sur des classes de pathogènes (PAMPs =.pathogen-associated molecular patterns). Le LPS est un des composés de la paroi de bactéries gram(-) qui représente un PAMP. L injection intra-péritonéale de LPS crée des conditions expérimentales d infection par des bactéries gram(-) et va entrainer l activation de récepteur TLR. Dans l expérience proposée on analyse la réponse au LPS d animaux contrôles et déficients soit pour le TLR2 soit pour le TLR4. Les résultats montrent que les souris contrôles meurent rapidement post-injection et que les souris déficientes pour le TLR2 ont un comportement similaire. Par contre, les souris qui n expriment plus le TLR4 sont totalement résistantes au traitement par du LPS. La détection de la présence de LPS stimule de façon aigue le système immunitaire entrainant la mort des animaux par choc septique. les souris TLR2-/- comme les contrôles sont donc capables de détecter le LPS. Elles possèdent un récepteur TLR pour le LPS. A l inverse, les souris TLR4-/- résistent parce qu elle ne sont plus capables de détecter la présence de LPS. Donc on démontre par génétique que TLR4 est le récepteur TOLL spécifique du LPS. Par ailleurs, on voit ici la discrimination possible du type d infection par des pathogènes différents en fonction du type de TLR engagé.
2 On isole des cellules dendritiques des deux types de souris mutantes et on étudie in vitro leur réponse après stimulation par du LPS ou du peptidoglycan (PGN). Expliquez le but de cette étude et les résultats obtenus présentés dans la figure 2. IL-6 (ng/ml) 1 8 6 4 2 1 8 6 4 2 FIGURE 2 Étude comparative de la production de cytokines IL-6 et TNFalpha après stimulation des cellules dendritiques contrôles ou TLR2-/- et TLR4-/- par du LPS ou du PGN (1µg/ml) 1 LPS (µg/ml) 1 PGN (µg/ml) TNFalpha (ng/ml) 5 4 3 2 1 5 4 3 2 1 contrôle TLR2-/- TLR4-/- 1 LPS (µg/ml) 1 PGN (µg/ml) Les cellules dendritiques (DC = dendritic cells)) sont des cellules de l immunité innée qui jouent un rôle essentiel dans le déclenchement le la réponse immunitaire adaptative. Ces cellules expriment des TLRs. Dans l expérience présentée, des DC ont été isolées à partir des souris contrôles, TLR2-/- et TLR4-/-. On compare la réponse des 3 différents types de DC après stimulation in vitro avec du LPS ou du PGN (peptidoglycan), un PAMP spécifique des bactéries gram (+). La stimulation des TLRs par leur ligand induit la production de signaux de danger par les cellules de l immunité innée. On suit donc l activation des DC via leur production de cytokines inflammatoires (IL-6 et TNFalpha) après incubation avec du LPS ou du PGN. Les résultats montrent que les DC contrôles répondent aussi bien au LPS qu au PGN. Comme attendu, les DC TLR4-/- ne produisent ni IL-6 ni TNF lorsqu elles sont stimulées par du LPS, bien qu elles aient une réponse normale au PGN. Par contre, les DC TLR2-/- qui répondent au LPS comme les DC contrôles, ne s activent pas en présence de PGN. L expérience confirme au niveau cellulaire la spécificité de reconnaissance du LPS par le TLR4. De plus, ici on démontre que le PGN entraine l activation des DC via TLR2. Conclusion: TLR2 est un récepteur pour le PGN et TLR4 un récepteur pour le LPS. Il y a donc une distinction possible entre une infection par des bactéries différentes gram(+) ou gram(-) dans l usage des TLRs 2 ou 4.
3 Dans l expérience suivante, on analyse l expression des molécules B7 et du CMH sur des cellules dendritiques provenant de souris TLR2-/- ou TLR4-/-. Toujours après stimulation in vitro par du LPS ou du PGN. Expliquez les résultats décrits dans la table 1 B7 Contrôle TLR2-/- TLR4-/- CMH II B7 CMH II B7 CMH II sans stimulus - + - + - + LPS 1µg/ml +++ +++ +++ +++ - + PGN 1µg/ml +++ +++ - + +++ +++ TABLE 1 Étude de comparative de l expression des molécules B7 et CMH de classe II sur les cellules dendritiques issues de souris contrôles ou déficientes TLR2-/- et TLR4-/- après stimulation in vitro par 1µg/ml de LPS ou de PGN. Les DC sont des cellules présentatrices d antigène (CPA) professionnelles pour les lymphocytes T. On s intéresse alors à l impact de la stimulation des TLRs sur la fonction CPA des DC. Dans une 1ere expérience, on analyse l expression des molécules du CMH II et des molécules de costimulation B7 sur des DC contrôles, TLR2-/- et TLR4-/-, après incubation in vitro avec du LPS ou du PGN. L expérience montre que le LPS et le PGN induisent et de façon similaire l expression à la fois du CMH et de B7 sur les DC contrôles. Par contre, ces molécules ne sont induites qu en présence de LPS pour les DC TLR2-/- ou de PGN pour les DC TLR4-/-. Les résultats démontrent que la stimulation des DC via des TLRs, qui active la production de cytokines inflammatoires, entraine aussi la maturation des DC en régulant l expression des molécules nécessaires à la fonction de présentation antigénique. Par ailleurs, on retrouve l effet associé ligand et TLR adéquate.
4 Des cellules dendritiques TLR2-/- et TLR4-/- stimulées par du LPS ou du PGN sont co-cultivées avec des lymphocytes T issus de souris contrôles immunisées par le LPS et le PGN. Quelle propriété des cellules dendritiques est testée dans ce cas? Analyser les résultats montrés dans les figures 3 et 4 contrôle TLR2-/- TLR4-/- FIGURE 3 IL-2 (pg/ml) 1 8 6 4 2 non LPS PGN stimuléés 1 8 6 4 2 non LPS PGN stimuléés 1 8 6 4 2 non LPS PGN stimuléés Dosage par ELISA de la production d IL2 dans les surnageants de cultures. Les cellules dendritiques (contrôles ou déficientes TLR2-/- ou TLR4-/-) sont stimulées ou non (1µg/ ml de LPS ou PGN) et mises en présence de lymphocytes T issus de souris immunisées par du LPS et du PGN. Nbre de LT (x1 5 ) 1 8 6 4 2 1 2 3 4 5 6 Jours 1 8 6 4 2 1 2 3 4 5 6 Jours contrôle TLR2-/- TLR4-/- FIGURE 4 Quantification des lymphocytes T dans les co-cultures. Les cellules dendritiques (contrôles ou déficientes TLR2-/- ou TLR4-/-) sont stimulées ou non (1µg/ml de LPS ou PGN) et mises en présence de lymphocytes T issus de souris immunisées par du LPS et du PGN. Stimulation LPS Stimulation PGN Dans l expérience précédente, Il est montré que l activation des DC par des TLRs induit l expression des molécules de présentation à leur surface. Dans cette 2 e expérience on teste directement la capacité des DC à activer les lymphocytes T après stimulation via les TLRs. Pour cela on réalise des co-cultures dans lesquelles on met des DC préalablement incubées avec du LPS ou du PGN en présence de lymphocytes T issus de souris contrôles immunisées soit avec du LPS soit avec du PGN. L activation des lymphocytes T après reconnaissance de l antigène présentée par une CPA et en présence de costimulation se traduit par la prolifération clonale des cellules. Cette prolifération peut-être suivie directement par le comptage des cellules ou indirectement par dosage de la production d IL2 (ELISA). Ici, on constate que les DC contrôles stimulées par du LPS ou du PGN déclenchent l activation respective des lymphocytes T spécifiques du LPS ou du PGN: i.e., on retrouve une production importante d IL2 et le nombre de cellules augmente rapidement. Là encore, les lymphocytes T ne sont induits que si la stimulation est faite par du LPS pour les DC TLR2-/- ou du PGN pour les DC TLR4-/-. L efficacité des DC à présenter l antigène à des lymphocytes T et à les activer est directement régulée par des voies TLRs.
5 Dans une dernière étude on regarde l expression de CCR7 par les cellules dendritiques après activation. Expliquez et commentez les résultats de la figure 5. CCR7 contrôle TLR2-/- TLR4-/- FIGURE 4 Expression relative 1 8 6 4 2 ns LPS PGN ns LPS PGN ns LPS PGN Analyse par RT-PCR quantitative de l expression de CCR7 par les cellules dendritiques (contrôles ou déficientes TLR2-/- ou TLR4-/-) stimulées (1µg/ ml de LPS ou PGN) ou non stimulées (ns). Les DC sont un lien majeur entre immunité innée et adaptative. Ces cellules ont la capacité de capturer l antigène sur le lieu d infection et d aller le présenter aux lymphocytes T naïfs au niveau des ganglions lymphatiques drainants les tissus. Il est montré que la migration des DC activées vers les ganglions est dépendante d un effet chimiotactique. En effet, ces cellules acquièrent l expression de CCR7, le récepteur de la chimiokine ganglionnaire CCL21 (SLC). On teste donc l expression de CCR7 sur les DC après stimulation par les TLRs. Par PCR quantitative on mesure l expression des ARN messagers CCR7 dans les DC avant et après stimulation par du LPS ou du PGN. On s aperçoit clairement que la stimulation des DC par les ligands de TLRs conduit à une surexpression du récepteur à chimiokine CCR7. La stimulation des voies TLRs conduit à la surexpression de CCR7. L expression en surface de ce récepteur va participer à la migration de la DC vers les ganglions.
6 Quelles conclusions tirez-vous de toute cette étude? Les TLRs sont les récepteurs de l immunité innée exprimés à la surface des cellules immunitaires résidentes dans les tissus. L entrée d un microorganisme sera rapidement et localement détectée par le système immunitaire grâce à la stimulation de ces TLRs par des ligands spécifiques portés à la surface des microorganismes. Il existe plusieurs types de TLRs capables de reconnaitre des classes différentes de micororganismes. Ainsi, toutes les expériences décrites ici démontrent que le TLR4 est un récepteur pour le LPS des bactéries gram(-) alors que le TLR2 est spécifique du PGN porté par les bactéries gram(+). Une fonction majeure des cellules résidentes dans les tissus est un rôle de sentinelle capable de déclencher des signaux pour alerter le système immunitaire innée d une situation de danger pour l hôte. Ceci est notamment réalisé par la production de cytokines inflammatoires du type IL6 et TNFalpha. Cependant, la réponse innée va avoir aussi pour effet de conditionner la réponse adaptative plus tardive. L ensemble des expériences reportées ici montre que la stimulation des TLRs à la surface des DC par leur ligand spécifique entraine la maturation de la DC en CPA. Ceci se traduit par une augmentation de l expression des molécules du CMH ainsi que des molécules de costimulation. En absence de signal TLR la présentation antigénique se fera mal et ne conduira pas à l activation des clones T spécifiques de l antigène. Un autre impact sur la réponse adaptative est que la stimulation des voies TLR favorise la migration des DC des tissus vers les ganglions où se trouvent les lymphocytes T naïfs. En conclusion, l efficacité de déclenchement d une réponse immune adaptative est régulée par la qualité de maturation des DC elle-même sous contrôle d une détection de situation de danger pour l organisme hôte via des récepteurs de type TLR.
Expérience 1 : BIO32 Immunologie Fondamentale Session 1, Janvier 211 - correction On infecte une souris d haplotype H2 d avec le virus de la grippe A. Après une semaine, on récupère les splénocytes de cette souris. On explore par la suite l activation de ces cellules dans un test de cytotoxicité en les mettant en présence de différentes cellules présentatrices d antigènes irradiées (fonctionnelles mais non prolifératives) incubées avec différents types de peptides : splénocytes + CPA- H2- K b + peptide ovalbumine splénocytes + CPA- H2- K b + peptide virus grippe A splénocytes + CPA- H2- K d + peptide ovalbumine splénocytes + CPA- H2- K d + peptide virus grippe A 1) Quelles cellules sont activées dans ce test? L utilisation d un test de cytotoxité in vitro avec des splénocytes issus d une souris infectée permet de mesurer l activation des lymphocytes T CD8+ effecteurs cytolytiques (CTL) produits en réponse à l infection chez l animal. 2) Expliquer comment on réalise un test de cytotoxicité (lecture du test)? Des cellules présentatrices d antigène (CPA) sont préalablement chargées avec des peptides antigéniques puis incubées avec un traceur radioactif, le Cr51 qu elles incorporent. Par la suite ces CPA sont mises en présence de splénocytes prélevés sur une souris infectée. On mesure la libération de radioactivité due au Cr51 dans le surnageant de culture comme révélateur d une lyse des cellules cibles. Cette cytolyse se produit si la population de splénocytes contient des CTL CD8+ activées au cours de la réponse à l infection et que ces CTL ont reconnu les peptides antigéniques présentés par les CPA. 3) Dans quel cas obtient- on une lyse cellulaire? splénocytes + CPA- H2- K b + peptide ovalbumine - > pas de lyse splénocytes + CPA- H2- K b + peptide virus grippe A - > pas de lyse splénocytes + CPA- H2- K d + peptide ovalbumine - > pas de lyse splénocytes + CPA- H2- K d + peptide virus grippe A - > cytolyse!!! 4) Expliquer pourquoi? La lyse cellulaire est conditionnée par la reconnaissance spécifique par les CTL du peptide antigénique présenté en association avec des molécules du CMH de classe 1 dans un contexte de soi particulier. Autrement dit, les CTL activés au cours de la réponse contre le virus de la grippe reconnaissent des peptides du virus de la grippe présentés par des molécules du CMH de classe 1 de type H2 d, l haplotype de la souris infectée. Dans le test in vitro, les CTL entraineront la lyse des cellules cibles qui présentent des peptides du virus de la grippe (spécificité antigènique) que s ils sont présentés par le même CMH que la souris infectée (restriction allogénique). Ces conditions ne sont pas réunies dans les cas 1, 2 et 3 et il n y pas de lyse possible : - cas n 1, ni le peptide ovalbumine ni le CMH H2- K b ne peuvent être reconnus par des CTL spécifiques du virus de la grippe et restreints H2- K d. - cas n 2, les CPA présentent des peptides viraux adéquats mais dans un contexte CMH non compatible H2- K b, - cas n 3, les CPA expriment du CMH classe 1 H2- K d compatible mais ne présentent pas le bon peptide (ovalbumine), par contre, - cas n 4, les CPA présentent des peptides du virus de la grippe en association avec des molécules du CMH de classe 1 H2- K d donc les CTL activés chez la souris infectée vont lyser les cellules cibles. On observera une libération de Cr51 dans le surnageant de culture. Une thymectomie est réalisée sur une très jeune souris d haplotype H2 d/b. Sur cette même souris, on greffe le thymus provenant d une souris d haplotype H2 b qui est parfaitement toléré à ce stade. 5) Définir les haplotypes H2 d, H2 b et H2 d/b. Le système H2 représente le Complexe Majeur d Histocompatibilité chez la souris. Le système est polygénique et composé d au moins 2 familles de gènes de classe 1 (K, D, L) et de classe 2 (I- A, I- E) qui codent respectivement pour des molécules du CMH de classe 1 et 2. Le système est polymorphique et chaque gène peut exister sous de multiples formes alléliques. L haplotype est l'ensemble des différents allèles de gènes présents et génétiquement liés sur un même chromosome. «petit d» et «petit b» représentent une nomenclature pour définir les formes alléliques des gènes du CMH. Ils définissent des haplotypes différents, c'est- à- dire que la combinatoire des allèles des gènes du CMH est différente entre des individus qui portent H2 d et H2 b. De plus, l expression des allèles du CMH est codominante. Une descendance F1 issue d un croisement entre parents H2 d et H2 b exprimera les 2 combinatoires alléliques portées par les 2 chromosomes parentaux et aura donc un haplotype mixte H2 d/b. A l âge adulte, cette souris greffée est infectée par le virus de la grippe A. Quelques jours plus tard, on réalise la même expérience que précédemment : splénocytes + CPA- H2- K b + peptide ovalbumine splénocytes + CPA- H2- K b + peptide virus grippe A splénocytes + CPA- H2- K d + peptide ovalbumine splénocytes + CPA- H2- K d + peptide virus grippe A
6) Dans quel cas obtient- on une lyse cellulaire? splénocytes + CPA- H2- K b + peptide ovalbumine - > pas de lyse splénocytes + CPA- H2- K b + peptide virus grippe A - > cytolyse!!! splénocytes + CPA- H2- K d + peptide ovalbumine - > pas de lyse splénocytes + CPA- H2- K d + peptide virus grippe A - > pas de lyse 7) Expliquer pourquoi? La différenciation des cellules T se fait dans le thymus. Les lymphocytes T immatures sont éduqués dans leur reconnaissance antigénique, et le thymus joue un rôle dans l acquisition de la restriction allogénique. Ainsi, le récepteur à l antigène (TCR) généré de façon clonale et aléatoire est testé pour sa fonctionnalité (Sélection positive) et pour son auto- réactivité (Sélection négative) afin de ne conserver que les clones T capables d interagir avec le CMH du soi exprimé par les cellules présentatrices du thymus mais sans forte affinité pour un antigène du soi (tolérance). Dans une souris d haplotype H2 d les lymphocytes sont restreints à reconnaitre les peptides antigéniques dans un contexte CMH H2 d. Dans une souris d haplotype H2 d/b les lymphocytes sont éduqués pour un CMH H2 d et H2 b. Si on thymectomise une très jeune souris H2 d/b et que l on remplace son thymus par un thymus issu d une souris d haplotype H2 b, les lymphocytes qui vont se différencier chez cet animal seront donc éduqués à reconnaitre les peptides antigéniques dans un contexte CMH H2 b uniquement et non plus H2 d. Par conséquent, lorsque l on infecte la souris avec le virus de la grippe, les peptides viraux vont être présentés par des CPA H2 d/b à des lymphocytes T compétents pour reconnaître un soi H2 b, il y aura donc activation de clones CTL spécifiques de la grippe A et restreints H2 b. Ici, dans le test in vitro c est le cas n 2 qui réunit les conditions nécessaires à la cytolyse pour les même raisons que celles expliquées précédemment (question 4). Expérience 2 : Deux souris immunodéficientes «nude» et «SCID» sont utilisées. Les cellules souches de la moelle osseuse de la souris nude sont isolées et transplantées dans une souris SCID. Quelques semaines plus tard, on analyse par cytométrie de flux les splénocytes de la souris SCID marqués avec un anticorps anti- CD3. On obtient le graphe suivant : 1) Expliquer les immunodéficiences «nude» et «SCID» Les souris «nude» sont des mutants naturels, elles sont immunodéficientes parce qu elles ne possèdent pas de thymus et sont dépourvues de lymphocytes T. Un défaut de différenciation épithéliale conduit à une absence de formation de l organe thymique. Les souris «SCID» présentent une immunodéficience combinée sévère (Severe Combined immunodeficiency), elles sont aussi dépourvues de lymphocytes T mais la cause est un blocage de différenciation lymphocytaire du à un déficit dans les processus de réarrangement des gènes du TCR. 2) Que démontre cette expérience? L analyse des splénocytes en cytométrie de flux avec un anticorps anti- CD3 permet de mettre en évidence la présence de lymphocytes T. Comme attendu, on observe qu il n y a pas de lymphocytes T chez la souris SCID (courbe en pointillés). Par contre, après transplantation de cellules de la moelle osseuse provenant d une souris «nude», on voit apparaitre une population de lymphocytes T CD3+ (courbe en trait plein). Ceci signifie que les cellules souches de la moelle osseuse de la souris «nude» sont fonctionnelles, qu elles ont donné naissance à des précurseurs lymphocytaires qui ont pu coloniser le thymus de la souris receveuse SCID, le repeupler et se différencier en lymphocytes T que l on retrouve en périphérie dans la rate. Ceci signifie aussi que le défaut SCID est bien intrinsèque au développement lymphocytaire mais que le thymus des souris SCID est apte à conduire une différenciation T normale. Dans un 2 e temps, les cellules souches de la moelle osseuse de la souris SCID sont isolées et injectées dans une souris nude. Quelques semaines plus tard, on analyse par cytométrie de flux les splénocytes de la souris nude marqués avec un anticorps anti- CD3. 3) Quel est le résultat attendu? Pas de détection d une population de lymphocytes T CD3+ dans la rate des souris «nude» après transplantation de cellules de moelle osseuse d une souris «SCID». 4) Pourquoi? Deux raisons à cela : - l expérience précédente montre que chez la souris SCID l absence de lymphocytes T est due à un défaut intrinsèque à la cellule T. Donc, même si les cellules souches de la moelle osseuse des souris SCID sont normales et fonctionnelles, à un moment la mutation génétique portée par ces souris va entrainer un arrêt de la maturation des lymphocytes T empêchant d obtenir des cellules T matures. - Les souris «nude» sont caractérisées par l absence de thymus donc même si on leur transplante des cellules souches compétentes elles ne pourront pas participer à une lymphopoïèse normale et donner des cellules T matures en périphérie.