2015-09-29 SERVICES DE SÉQUENÇAGE DE NOUVELLE GÉNÉRATION Centre d innovation Génome Québec et Université McGill Guide de l utilisateur: Technologies de séquençage Illumina Version 5.6 Copyright 2015 Centre d'innovation Génome Québec et Université McGill Tous droits réservés.
Table des matières TABLE DES MATIÈRES... 2 DIRECTIVES GÉNÉRALES POUR LA PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS D ADN... 3 CONSIDÉRATIONS GÉNÉRALES... 3 QUANTITÉ D'ÉCHANTILLONS D'ADN À FOURNIR... 4 FORMATS REQUIS POUR L ENVOI DES ÉCHANTILLONS D ADN... 5 LIBRAIRIES PRÊTES-À-SÉQUENCER/AMPLICONS ET DIVERSITÉ DES LIBRAIRIES... 5 DIRECTIVES GÉNÉRALES POUR LA PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS D ARN... 6 CONSIDÉRATIONS GÉNÉRALES... 6 QUANTITÉ D'ÉCHANTILLONS D'ARN À FOURNIR... 7 DEMANDE DE SERVICE ET SOUMISSION DES ÉCHANTILLONS... 8 FORMULAIRE DE DEMANDE DE SERVICE ET SOUMISSION DES ECHANTILLONS (CREATION D UNE NOUVELLE REQUETE) 8 FORMULAIRE DE DEMANDE DE SERVICE ET SOUMISSION DES ECHANTILLONS (REQUETE EXISTANTE)... 8 PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS POUR ENVOI... 9 ADRESSES POUR LES ENVOIS DES ÉCHANTILLONS... 9 2
Directives générales pour la préparation des échantillons d ADN Considérations générales Les recommandations indiquées dans ce document ont pour but de faciliter l obtention de résultats de séquençage de la plus haute qualité possible dans les meilleurs délais. Tous les échantillons qui ne se conforment pas à ces recommandations pourraient être refusés sans compensation. Lorsque vous soumettez des échantillons, il est recommandé de: fournir des échantillons de la plus grande qualité et pureté possible o les ratios densité optique 260/280 entre 1,8 et 2,0 o les ratios densité optique 260/230 > 2,0 o ne doivent pas contenir de matériel insoluble, d ARN, d agents chélatants (ex. EDTA), des cations divalents, des détergents ou des contaminants provenant du matériel de départ (organisme ou tissu) extraire l ADN avec des trousses commerciales plutôt que des solutions maison nettoyer l ADN avant de soumettre les échantillons à la plateforme resuspendre l'adn dans du 10 mm Tris-HCl ph 8.0; 0,1 mm EDTA (une concentration plus élevée d EDTA peut inhiber certaines réactions enzymatiques). mesurer la concentration d ADN en utilisant une méthode fluorométrique plutôt que spectrophotométrique (ex. Nanodrop) qui ont tendance à surestimer la concentration des échantillons, rendant la quantité de matériel de départ inadéquate. s'assurer que la quantité correspond aux valeurs spécifiées dans la section Quantité d'échantillons d'adn à fournir mesurer précisément le volume de chaque échantillon et consigner ces valeurs dans le Formulaire de demande de service. L'identification de chaque échantillon doit correspondre exactement à ce qui est indiqué dans le formulaire de demande de service. Toute correspondance écrite concernant les services en cours ou complétés doit référer au numéro de soumission (commençant par "SCI...") ou au nom du projet Nanuq. 3
Quantité d'échantillons d'adn à fournir Si le volume d'échantillon est inférieur au minimum indiqué, le Centre d'innovation se réserve le droit de diluer l'échantillon au volume requis ou de refuser l'échantillon. La concentration des échantillons ne doit pas être supérieure à 150 ng/µl. Un volume de 6 μl est d abord utilisé pour le contrôle de qualité (QC) d'adn. Tableau 1. Sommaire de la quantité d'échantillons d'adn requise Source d'acide nucléique Type de librairie Quantité requise (µg) Volume Requis (µl) TruSeq régulier (fragments courts) Nextera régulier (fragments courts) Extrémités pairées 3, 5 ou 10 kb 1.0 40-75 0.25 40-75 10 40-75 ADNg WGBS 2.0 40-75 Capture (SureSelect) 3.0 40-75 Capture (Nextera) 0.25 40-75 Capture (Roche Nimblegen) Methyl-Capture (Roche Nimblegen) 1.0 40-75 2.0 40-75 ADN ChIP ChIP-Seq φ 0.025 25-50 Librairie Prête-à-séquencer 0.075 25 à 75 φ L intervalle de tailles acceptables des fragments pour des échantillons ChIP ou amplicons se situe entre 100 et 500 pb. Les résultats de séquençage seront fournis tels quels. Le CI ne peut être tenu responsable de problèmes liés au design, à la qualité ou à la complexité de séquence des librairies. Pour évaluer la taille de la librairie, on doit prendre en considération: 1) Les adaptateurs ajoutent environ 120pb; 2) le nombre the cycles de séquençage devant être effectués Les échantillons de remplacement doivent avoir la quantité totale requise. Les remplacements partiels («top-ups») seront refusés. Des frais supplémentaires de QC s'appliqueront à chaque échantillon de remplacement. Un volume de 10-15 μl est requis pour des projets de contrôle de qualité (QC) d'adn seulement. 4
Formats requis pour l envoi des échantillons d ADN Les échantillons/librairies doivent être envoyées en plaques 96 puits, peu importe le nombre. Il doit y avoir un échantillon par puits, par type de librairie. Deux types de plaques sont acceptés: Eppendorf twin.tec, Full Skirt, Cat# 951020401 PREMIER CHOIX Corning Thermowell GOLD, Full Skirt, Cat# 3752 SECOND CHOIX Nous recommandons les films adhésifs suivants: Life Technologies MicroAmp Clear Adhesive Film, Cat# 4306311 VWR Aluminum Foils for PCR and Cold Storage, Cat# 60941-074 Les procédures ont été optimisées afin de traiter un haut débit d'échantillons. Tout autre format de plaques pourrait endommager les robots utilisés pendant ces procédures. Par conséquent, les échantillons soumis dans des contenants ne se conformant pas aux exigences seront rejetés et retournés aux frais du client ou seront transférés dans une plaque acceptable. Des frais seront facturés à l usager. Chaque plaque ne doit contenir que des échantillons appartenant à un seul projet. Toutes les plaques doivent être identifiées clairement (# soumission, le nom du chercheur, date). Les directives décrites ci-haut s appliquent aussi pour des projets de contrôle qualité d ADN. Librairies prêtes-à-séquencer/amplicons et diversité des librairies Le logiciel d'illumina qui identifie les regroupements de fragments d'adn et effectue l'assignement des bases est dépendant de la complexité des séquences, principalement des premières douze bases qui sont séquencées de chaque côté du fragment. Pour cette raison, tout type de librairie qui ne contient pas une distribution de bases aléatoire (ou quasi-aléatoire) doit être amenée à notre attention sans quoi les données de séquences pourraient être sous-optimales. Ce type de librairie inclut les amplicons (PCR), les librairies RAD (restriction siteassociated DNA) et les librairies avec complexité réduite telles que les librairies converties par le bisulfite. Pour compenser la faible complexité, une librairie contrôle, tel que le phix174 fournie par Illumina, pourrait être ajoutée jusqu'à un niveau de 50%. Cette note s'applique également à la diversité des index lorsque des librairies sont multiplexés. Afin d'obtenir les meilleurs résultats, il est recommandé de combiner au moins trois (3) librairies indexées par ligne de séquençage. 5
Directives générales pour la préparation des échantillons d ARN Considérations générales Les échantillons biologiques qui sont destinés à être soumis à la définition du profil de mrna (c est-àdire : transcriptomique ou ARN-Seq), il est recommandé de: porter des gants neufs et garder les échantillons sur la glace. resuspendre les échantillons dans de l eau commerciale sans RNase. éviter l eau traitée au DEPC. si le Trizol est utilisé pour extraire les échantillons d ARN, il est recommandé de procéder à un nettoyage final (ex. avec le kit de nettoyage Qiagen mrna) avant la soumission. Les échantillons doivent être acheminés dans des tubes Eppendorf 1,5 ml. L identification des échantillons sur les tubes doit correspondre exactement avec ce qui est écrit dans le formulaire de demande de service. Toute correspondance écrite concernant les services en cours ou complétés doit référer au numéro de soumission (commençant par "SCI...") ou au nom du projet Nanuq. 6
Quantité d'échantillons d'arn à fournir L ARN total est utilisé comme matériel de départ pour les protocoles. Un volume de 2-4 μl est d abord utilisé pour le contrôle de qualité (QC) d'arn. Il est préférable de diluer des échantillons concentrés (ex. 1 ug/µl à 100 ng/µl) et de fournir le volume minimal requis plutôt que de soumettre des échantillons concentrés mais en trop petit volume. Tableau 2. Sommaire des conditions à remplir pour la soumission d échantillons d ARN Application Quantité minimale (ng) Concentration minimale (ng/µl) Volume minimal (µl) RIN * Expression génique eucaryotes (transcrits codants) 700 50 ~ 10-15 >6.5 Expression génique procaryotes 2000 100 ~ 20-25 >6.5 Méta-transcriptomique (plusieurs espèces) Profilage transcrits codants et longs transcrits non codants Profilage de petits ARNs (<200 nt) 2000 100 ~ 20-25 >6.5 1200 75 ~ 15-20 >6.5 2200 200 ~ 10-15 >6.5 *RIN = RNA Integrity Number 7
Demande de service et soumission des échantillons Formulaire de demande de service et soumission des échantillons (création d une nouvelle requête) L option «nouvelle requête» est utilisée uniquement pour les nouveaux projets. Ouvrir une session dans le compte Nanuq ici. Cliquer sur «ajouter une nouvelle requête» dans la section «Requête» et suivre les instructions. Ne pas utiliser le bouton «retour» de votre navigateur pour revenir en arrière. Utiliser les choix de pages à gauche. La requête demeure un brouillon jusqu à ce qu elle soit soumise. Les brouillons sont accessibles via l option «liste des requêtes». Le travail dans le laboratoire ne débutera qu une fois toute la documentation fournie. Formulaire de demande de service et soumission des échantillons (requête existante) Ouvrir une session dans le compte Nanuq ici. Cliquer sur «liste des requêtes» dans la section «Requête». Les requêtes existantes sont ré-ouvertes afin de 1) soumettre de nouveaux échantillons ou des échantillons de remplacement à un projet en cours ou 2) continuer à remplir un brouillon. Pour soumettre de nouveaux échantillons, aller à la section «soumission d échantillons» afin de : télécharger le gabarit pour la soumission des échantillons revisiter des fichiers déjà remplis et soumis ajouter des commentaires à des échantillons Ne pas ajouter de nouveaux échantillons à un fichier déjà soumis. Ne pas se servir du bouton «retour» de votre navigateur pour revenir en arrière. Veuillez noter que les échantillons seront entrés dans notre base de données et traités dans le même ordre que celui indiqué dans le formulaire de soumission d échantillons. Ainsi, pour les projets ARN-Seq, Methyl-Seq et ChIP-Seq, il est fortement recommandé de disposer les échantillons de manière à minimiser la variabilité technique engendrée par le séquençage en randomisant les échantillons selon le groupe expérimental auquel ils appartiennent. Par ailleurs, il n est pas garanti que des demandes particulières quant au mélange des librairies pour le séquençage soient honorées et ce, afin de maximiser la capacité sur les instruments. La plateforme se réserve le droit de modifier les schémas de multiplexage sans en aviser l usager. Les demandes particulières doivent être indiquées dans la colonne des commentaires du formulaire de soumission des échantillons. 8
Préparation des échantillons pour envoi Les envois doivent inclure une copie complétée et signée du Formulaire de Demande de service. Les échantillons d'adn et d'arn ainsi que les librairies prêtes-à-séquencer devraient être envoyés sur glace sèche. Les tubes (ARN) ou les plaques (ADN et prêtes-à-séquencer) devraient être scellées dans un sac de type Ziploc. Les tubes (ARN) devraient êtres ordonnés dans une boîte si la soumission comprend > 24 tubes. Les échantillons peuvent être amenés directement au Centre, mais ces envois doivent être coordonnés avec le personnel autorisé avant la livraison. Les échantillons devant traverser la frontière canadienne devraient être envoyés en début de semaine. L'utilisation de phrases claires telles ques: Non-biohazardous biological sample, Purified DNA from [species], For research use only, et Of no commercial value aidera à accélérer le dédouanement. N'envoyez que des aliquots de vos échantillons. Ceux-ci seront conservés pendant environ 1 mois après que le service demandé ait été complété et seront détruits par la suite a moins que le client ait mentionne au Bureau de Gestion des Clients son désir de les ravoir. Les librairies seront conservées au moins un an. Adresses pour les envois des échantillons L'adresse complète de l'envoi selon le type d'acide nucléique est indiquée ci-dessous: Échantillons d'adn Services MPS a/s Sylvie LaBoissière Centre d'innovation Génome Québec et Université McGill, Local 5300 740, Avenue Dr-Penfield Montréal (Québec) Canada, H3A 0G1 Échantillons d'arn Services MPS a/s Sylvie LaBoissière Centre d'innovation Génome Québec et Université McGill, Local 6300 740, Avenue Dr-Penfield Montréal (Québec) Canada, H3A 0G1 Librairies prêtes-à-séquencer: Services MPS a/s Alfredo Staffa Centre d'innovation Génome Québec et Université McGill, Local 5400 740, Avenue Dr-Penfield Montréal (Québec) Canada, H3A 0G1 9