Comparaison du kit Diapro pour la détermination des anticorps anti- HDV totaux avec le kit Murex utilisé en routine

Comparaison du kit Diapro pour la détermination des anticorps anti- HDV totaux avec le kit Murex utilisé en routine Aurélie Comand Ecole Supérieure de la Santé TAB 50 ème Service d immunologie et allergie Mars 2011 Responsables accompagnants : Cyril André et Patricia Pochon 1

Sommaire L hépatite D ou delta est une maladie potentiellement grave présente chez certains individus infectés auparavant ou simultanément par le virus de l hépatite B. Le laboratoire d immunologie et allergie du CHUV recherche la présence des anticorps anti HDV totaux (IgG et IgM) dans le sérum ou le plasma humain afin de diagnostiquer la maladie. Le kit actuellement utilisé n étant plus disponible à partir du 1 er janvier 2011, un autre kit doit être introduit. Ce nouveau kit sera évalué au moyen d échantillons HDV positifs et négatifs afin d effectuer une reproductibilité inter et intra essais. En cas de résultats satisfaisants, le nouveau kit pourra remplacer l ancien. Hepatitis D or delta is a potentially dangerous disease present in some individuals infected before or simultaneously with the hepatitis B virus. The Laboratory of Immunology and Allergy in CHUV detects the presence of total anti HDV antibodies (IgG and IgM) in serum or plasma to diagnose the disease. The kit currently used is no longer available from 1 January 2011, therefore another kit must be introduced. This new kit will be evaluated using positive and negative HDV samples to perform inter and intra assay reproducibility. If the results are satisfactory, the new kit will be used instead of the old one. 2

Table des matières 1. Introduction...5 2. Généralités sur les hépatites...6 3. L hépatite D...6 3.1 Description du virus de l hépatite D (HDV)...6 3.2 Réplication du virus...7 3.3 Physiopathologie...7 3.3.1 Description générale du foie...7 3.3.2 Atteinte portée au foie par le virus de l'hépatite D...8 3.3.3 Evolution clinique...9 3.4 Répartition géographique... 10 3.5 Symptômes et manifestations cliniques... 10 3.6 Transmission... 11 3.7 Populations à risque... 11 3.8 Prophylaxie... 11 3.9 Diagnostic... 11 3.10 Traitement... 11 4. But du travail... 12 5. Description générale de la méthode Murex... 12 6. Evaluation de la nouvelle méthode Diapro... 13 6.1 Matériel... 13 6.1.1 Matériel biologique... 13 6.1.2 Matériel fourni par le Kit Diapro... 15 3

6.1.3 Matériel requis non fourni par le Kit Diapro... 15 6.2 Méthode Diapro... 16 6.2.1 Principe de l analyse... 16 6.2.2 Interférences... 17 6.2.3 L'automate DSX... 17 6.2.4 Hygiène et sécurité... 18 6.3 Comparaison générale entre le kit Diapro et le kit Murex... 19 6.4 Résultats... 19 6.4.1 Evaluation de la reproductibilité inter essais et intra essai anti HDV total... 21 6.5 Problèmes rencontrés... 23 6.6 Discussion des résultats... 25 7. Conclusion... 26 8. Références bibliographiques... 27 9. Lexique... 30 10. Remerciements... 31 11. Annexes... 32 4

1. Introduction Le Service d immunologie et allergie du CHUV (IAL) est composé de diverses disciplines telles que le diagnostic biomédical, la vaccinologie et l immunothérapie, la clinique intrahospitalière et ambulatoire ainsi que la recherche fondamentale et clinique. Le laboratoire de diagnostic possède différents domaines d activités comme le diagnostic et le suivi des hépatites virales et l infection à HIV ainsi que des maladies autoimmunes et des gammapathies monoclonales ou encore l immunologie de transplantation et le diagnostic des affections allergiques. [1] D autre part, le laboratoire d immunologie et allergie (LIA) offre ses services en tant que laboratoire de confirmation (ex. HIV, hépatites ). Mon stage se déroule dans le domaine des hépatites virales et l infection à HIV. Mon travail de diplôme porte sur l hépatite D ou delta. L infection due au virus de l hépatite D (HDV) est la plus rare des hépatites, mais aussi potentiellement une des plus graves. La détection et le suivi de son évolution en sont donc d une grande importance. Cependant, l analyse n étant réalisée que dans peu de laboratoires, les kits commercialisés par des fabricants agréés sont rares. Le kit utilisé pour le diagnostic de l hépatite D n étant plus disponible à partir du 1 er janvier 2011, un nouveau kit doit être introduit en fonction des normes établies par le laboratoire. Afin de tester le kit, une comparaison des résultats obtenus sur une série d échantillons et une reproductibilité inter et intra essais est effectuée. 5

2. Généralités sur les hépatites L hépatite est une inflammation du foie ayant diverses origines : virale, bactérienne, alcoolique, médicamenteuse, vasculaire ou auto immune et son évolution dépend de l agent en cause. Le terme de phase aiguë ou chronique détermine la durée de l infection ainsi que les différentes conséquences qui en découlent. Une forme fulminante peut survenir dans de très rares cas et provoquer une nécrose massive du foie en quelques heures ou quelques jours. Les hépatites virales regroupent différents types : A, B, C, D, E selon l agent pathogène. [2] Hépatites Famille Transmission A Picornaviridae Oro fécale B C D Hepadnaviridae Flaviviridae Deltaviridae 3. L hépatite D Début de maladie Souvent brutal 3.1 Description du virus de l hépatite D (HDV) Incubation Chronicité 15 50 jours Non Percutanée Souvent 60 90 jours > 5 ans (âge) : 2 10% Permuqueuse insidieux 45 180 jours < 5 ans (âge) : 30 90% Percutanée Permuqueuse E Hepeviridae Oro fécale Figure 1 Récapitulatif des hépatites virales Insidieux 14 182 jours 60 85% Percutanée Souvent Co infection : < 5% 21 49 jours Permuqueuse brutal Surinfection : 80% Souvent brutal 15 60 jours (env. 40 jours) Seulement en cas d immunodéficience grave «Le VHD (a)1 a été découvert en 1977 et cloné ainsi que séquencé en 1986.» [3] Le virus appartient à la famille des Deltaviridae et contient de l ARN circulaire simple brin. Son diamètre ne dépasse pas 36 à 43 nm. [4] Le HDV est défectif (b) et sa réplication est indépendante du HBV (C), mais nécessite l expression de l antigène HBs (protéine de l enveloppe du HBV) pour l assemblage de ses propres Figure 2 Virus de l hépatite D 1 Tous les mots définis ou commentés dans le lexique sont dotés d une lettre alphabétique entre parenthèse suivant l ordre de l alphabet et dans l ordre dans lequel ils apparaissent dans le texte. 6

particules virales (d). Son pouvoir pathogène lui est en partie conféré par le HBV. Il n est donc rencontré qu en présence du virus de l hépatite B. [3] La spécificité de l hépatite D provient de l antigène Delta constituant la capside du HDV. [5] 3.2 Réplication du virus Figure 3 Cycle de réplication du HDV 1. L'ARN génomique (e) du HDV sert de modèle pour la synthèse des multimères d ARN antigénomique (f) et de l'arnm (g) (6). 2. Les multimères d ARN antigénomique sont auto clivés à intervalles monomériques et sont circularisés. 3. Les antigénomes résultants servent de modèle pour la synthèse des nouveaux multimères d ARN génomique. 4. Les multimères d'arn génomique sont auto clivés à intervalles monomériques et sont circularisés. 5. Les RNPs HDV (h) sont assemblés et exportés vers le cytoplasme où ils rencontrent les HBs Ags (8 et 9). 10. Les virions HDV matures sont produits, puis sécrétés hors de la cellule. 7. L'ARNm est traduit dans la synthèse des antigènes HDV. Ceux ci sont importés dans le noyau. [6] 3.3 Physiopathologie 3.3.1 Description générale du foie Le foie est un organe très important, aussi bien par sa taille que par le rôle qu'il assure au niveau physiologique. [7] «[ ] Il se situe dans l'abdomen, plus précisément dans la région hypochondriaque droite et épigastrique. [ ]» [8] Sa structure anatomique est partagée en 4 lobes hépatiques (dont 2 principaux), eux mêmes formés de lobules délimités par des espaces portes. [9] 7

Figure 4 Le foie De nombreuses fonctions vitales lui sont conférées dont les principales sont le métabolisme général (ex. métabolisme des glucides, lipides, protéines et du fer), le stockage (ex. glucose sous forme de glycogène, certaines vitamines, une partie du fer) et l épuration (ex. médicaments, substances toxiques, synthèse des sels biliaires et de la bile). [10] L hépatocyte, cellule principale et spécifique du foie pourvu d une grande capacité de régénération, possède une structure et une activité différente selon son emplacement au sein du lobule. Cette propriété lui permet d accomplir les diverses fonctions principales du foie. [9] Figure 5 L hépatocyte 3.3.2 Atteinte portée au foie par le virus de l hépatite D La réplication virale à l intérieur de l hépatocyte est peut être toxique pour la cellule. De plus, la réaction immune cellulaire (lymphocyte T CD8) provoque la lyse de la cellule. L infection est plus grave que l infection d une hépatite B seule. [11] «Le VHD est responsable d'hépatites aiguës en cas de co infection (affections simultanées par le VHB et le VHD) et de surinfection (infection par le VHD chez un porteur chronique du VHB).» [5] De plus, des formes fulminantes sont particulièrement graves et la survenue d une cirrhose ainsi que d un carcinome hépatocellulaire est accélérée lors de surinfection. [11] 8

3.3.3 Evolution clinique Figure 6 Surinfection d une hépatite B chronique par l hépatite D : Evolution sérologique clinique. La surinfection évolue en phase chronique dans 90% des cas. Généralement, la synthèse du HDV provoque une diminution de la synthèse du HBV. «[ ] Une alternance de la prédominance entre le VHD et le VHB au long cours a été démontrée récemment chez certains patients.» [3] Figure 7 Co infection de l hépatite B et l hépatite D : Evolution sérologique typique en cas de guérison spontanée de l hépatite B. Lors de co infection, la majorité des cas guérissent spontanément. Les virus de l hépatite B et D sont éliminés de l organisme. [3] Le taux de risque de chronicité représente environ 5%. [5] 9

3.4 Répartition géographique Figure 8 Répartition géographique de la prévalence de l hépatite D (présence de l anti HDV chez les patients). La carte regroupe les données générales disponibles. Le HDV est plus fréquemment rencontré dans certaines zones d Europe de l Est, d Afrique ainsi que d Amérique du Sud. N étant retrouvé que chez les patients infectés par le HBV, la prévalence du HDV dépend de celle du HBV. Malgré une forte diminution de l hépatite D en Occident grâce aux prophylaxies mises en place contre le HDV, «avec l immigration croissante en provenance de l Europe de l Est et des Etats de l ex Union soviétique, on observe [...] depuis plusieurs années, une recrudescence de l hépatite D chronique, surtout en Europe du Nord et centrale.» [3] 3.5 Symptômes et manifestations cliniques Généralement, les symptômes provoqués par le HDV sont identiques au HBV, mais plus sévères. Le patient peut être atteint d un ictère et souffrir d une asthénie, d une perte d appétit, de douleurs au ventre et aux articulations, de nausées, de vomissements et de diarrhées. [12] Les principales manifestations cliniques se situent au niveau du bilan hépatique avec une augmentation de la concentration plasmatique de certaines enzymes du foie (ex. ALAT (i), ASAT (j), PAL (k) ) et des enzymes libérées lors de la lyse cellulaire (ex. LDH (l) ). En parallèle, la bilirubine est augmentée en cas d ictère et le taux de prothrombine (TP) est légèrement abaissé. [13] 10

3.6 Transmission Le mode de contamination du HDV est semblable à celui du HBV. Les principales voies de transmission sont les voies sexuelles, les muqueuses ainsi que les blessures sur la peau. De plus, tout contact avec un objet contaminé par du sang infecté est un risque d infection. Heureusement, le passage de la mère à l enfant reste rare. [4] Dans les pays développés, la transmission par transfusion sanguine est un phénomène exceptionnel depuis le dépistage de l hépatite B chez les donneurs. [11] 3.7 Populations à risque Les individus infectés par le HBV, de même que les personnes ayant des relations sexuelles non protégées avec de multiples partenaires ou encore les populations vivant dans des zones endémiques sont à risque. D autre part, un risque est possible pour les patients hémophiles et les hémodialysés si le matériel servant à leurs soins est mal stérilisé entre chaque utilisation (plusieurs patients utilisent le même matériel). En Europe occidentale, le groupe le plus à risque est constitué par les toxicomanes lors d échange de seringues usagées. [3;11;14] 3.8 Prophylaxie La meilleure protection contre le HDV est la vaccination contre l hépatite B. Autrement, il n existe aucune prophylaxie spécifique à l hépatite D. D autre part, le dépistage de l HBV lors de la grossesse et également des produits sanguins lors de transfusions permet d éviter la transmission du virus. [3] 3.9 Diagnostic Au laboratoire LIA, le dépistage de l hépatite D est réalisé par la recherche sérologique d anticorps anti HDV totaux par la méthode ELISA. D autre part, l institut de microbiologie du CHUV (IMUL) procède à l évaluation quantitative de la virémie par la méthode RT PCR afin de suivre l évolution spontanée et l effet du traitement. [15] 3.10 Traitement «La réplication du VHD est fortement dépendante d'enzymes cellulaires, le ribozyme représentant la seule activité catalytique virale. Il est donc très difficile de développer des inhibiteurs spécifiques de la réplication du VHD.» [3] 11

Seuls quelques traitements sont possibles avec des médicaments utilisés habituellement contre l hépatite B (et certaines infections virales), car il n existe actuellement aucun traitement spécifique à l hépatite D. L interféron α pégylé constitue le principal médicament. La posologie est la même que pour l hépatite B ou C chronique. La thérapie est suivie durant au moins 1 an, cependant le taux de réponse à long terme n est que de 20 %. [3] L interféron α est une protéine du groupe des cytokines. Celles ci sont produites par différentes cellules de l organisme pour leurs propriétés antivirales et anticancéreuses. De plus, l interféron α est capable de réguler l action et la stimulation du système immunitaire. [16] Quant à l interféron α pégylé, il s agit d un interféron produit par génie génétique conjugué au polyéthylène glycol servant à ralentir la diffusion de l interféron dans l organisme. [17] Il existe encore d autres traitements à base d interféron α pégylé combinés à d autres substances. Cependant, le taux de réponse au traitement n est pas supérieur à l interféronα pégylé seul. «De plus, il a été démontré récemment que le VHD peut interférer avec la voie de signalisation de l'interféron α (IFN α).» [3] «[ ] La transplantation hépatique devrait être considérée pour les patients avec une cirrhose décompensée, un carcinome hépatocellulaire limité [ ]» [3] ou une hépatite fulminante. 4. But du travail Le nouveau kit de diagnostic de l hépatite D fabriqué par Diapro doit être comparé à l ancien kit (Murex) en termes de performance. Une série d échantillons a été testée afin de comparer les résultats et de réaliser une reproductibilité inter et intra essais. 5. Description générale de la méthode Murex Le kit Murex du fabriquant Abbott, employé jusqu à présent, propose un test immunoenzymatique par compétition capable de détecter les anticorps anti HDV IgG et IgM dans le plasma ou le sérum humain. [18] L analyse est effectuée sur l automate DSX de Dynex Technologies. Le principe du test consiste en l utilisation de cupules recouvertes par l antigène delta (protéine de nucléocapside) produit chez la marmotte et fixé à la phase solide par l intermédiaire d anticorps anti HDV humains. Lorsque l échantillon est ajouté, les anticorps anti HDV éventuellement présents se lient spécifiquement aux antigènes HDV. En parallèle, des anticorps anti HDV conjugués à la peroxydase sont ajoutés. En cas d anticorps anti HDV présents dans l échantillon, le conjugué ne peut pas se lier aux antigènes ayant déjà formé un complexe avec les anticorps de l échantillon. Par la suite, des lavages permettent d éliminer les restes de conjugué et de déchets non liés au complexe antigène anticorps. 12

L ajout de la solution substrat produit un signal. La concentration d anticorps anti HDV de l échantillon est inversement proportionnelle à l intensité du signal produit. [18] Les échantillons négatifs développent une couleur bleue verte qui tourne à l orange lorsque la solution d arrêt est ajoutée, alors que les échantillons positifs évoluent d une couleur jaune (couleur du plasma ou sérum) à une couleur rose. Le résultat est rendu après environ 2h30 sous forme semi quantitative et il est calculé d après une valeur seuil. Les échantillons ayant une absorbance inférieure à la valeur seuil sont positifs. [18] D après le kit Murex, la valeur seuil est calculée en fonction du rapport : (Contrôle Positif + moyenne Contrôle Négatif) / 2 Le résultat de l échantillon est calculé d après le rapport : absorbance échantillon / valeur seuil La sensibilité a une limite inférieure de 97% et la spécificité est de 99.6%. [18] Ces valeurs proviennent de la fiche technique du kit et n ont pas été déterminées par le laboratoire LIA. Le test peut être influencé par une forte hémolyse ou la présence de fibrine et d héparine ainsi que par une coagulation incomplète des sérums ou encore par une contamination microbienne. [18] 6. Evaluation de la nouvelle méthode Diapro 6.1 Matériel 6.1.1 Matériel biologique Un total de 42 échantillons analysés en routine entre 2008 et 2010 et répartis en 27 positifs et 15 négatifs ont été utilisés. Les prélèvements sont constitués de plasma anti coagulé par EDTA ou de sérum humain et ont été décongelés ( 80 ⁰C), puis aliquotés et stockés entre 2 et 8 ⁰C. Les échantillons ont été choisis indépendamment du sexe, de l âge ou d autres facteurs propres au patient. 13

Echantillons Volume (ml) Matériel AHDV01 1.2 EDTA AHDV02 0.7 Sérum AHDV03 1.2 EDTA AHDV04 1 EDTA AHDV05 1.2 EDTA AHDV06 1.5 EDTA AHDV07 1.2 EDTA AHDV08 1.2 EDTA AHDV09 1.2 EDTA AHDV10 1.2 EDTA AHDV11 1.2 EDTA AHDV12 1.2 EDTA AHDV13 1.2 Sérum AHDV14 1.2 EDTA AHDV15 1.2 EDTA AHDV16 2.5 EDTA AHDV17 3 EDTA AHDV18 1.2 EDTA AHDV19 1.2 EDTA AHDV20 1.2 EDTA AHDV21 2.8 EDTA AHDV22 1.2 EDTA AHDV23 2.5 EDTA AHDV24 3 EDTA AHDV25 3 EDTA AHDV26 2.9 Sérum AHDV27 1.1 EDTA AHDV28 1.2 EDTA AHDV29 1.2 EDTA AHDV30 0.5 EDTA AHDV31 1.3 EDTA AHDV32 1.2 EDTA AHDV33 1.2 EDTA AHDV34 1.5 EDTA AHDV35 1.2 EDTA AHDV36 1 EDTA AHDV37 1.6 EDTA AHDV38 1.2 EDTA AHDV39 1.2 EDTA AHDV40 1.2 EDTA 14

AHDV41 1.1 EDTA AHDV42 1.2 EDTA 6.1.2 Matériel fourni par le Kit Diapro Microplaque de 8 X 12 puits : puits recouverts de la protéine de nucléocapside du HDV produite par génie génétique. Solution de calibration : contient des protéines de sérum bovin, un bas titre d anticorps anti HDV humains, 0.2 mg/ml de sulfate de gentamicine et 0.1% Kathon GC (agent de conservation). Contrôle positif : contient des protéines de sérum de chèvre, un haut titre d anticorps anti HDV, 100 mm de tampon Tris HCl (ph 7.4), 0.09% d azide de sodium et 0.1% de Kathon GC. Contrôle négatif : contient des protéines de sérum de chèvre, 100 mm de tampon Tris HCl (ph 7.4), 0.09% d azide de sodium et 0.1% de Kathon GC. Solution de lavage (à diluer 20X) : une fois diluée, contient 10 mm de tampon phosphate (ph 7), 0.05% de Tween 20 et 0.1% kathon GC. Conjugué : contient 5% d albumine de sérum bovin, 10 mm de tampon Tris (ph 6.8), de la peroxydase de raifort conjuguée à un anticorps polyclonal anti HDV, 0.2 mg/ml de sulfate de gentamicine et 0.1% de kathon GC. Substrat : contient 50 mm de tampon phosphate citrate (ph 3.5 à 3.8), 4% de DMSO, 0.03% de TMB et 0.02% d eau oxygénée (H 2 O 2 ) Solution d arrêt : contient de l acide sulfurique 0.3 M (H 2 SO 4 ) [19] Le kit doit être stocké au réfrigérateur entre 2 et 8 ⁰C. 6.1.3 Matériel requis non fourni par le Kit Diapro Incubateur thermostatique jusqu à 37 ⁰C pour microplaque ELISA Lecteur de puits ELISA Laveur de microplaque ELISA Le DSX est un automate constitué de tous ces éléments et il est utilisé au laboratoire LIA. 15

6.2 Méthode Diapro 6.2.1 Principe de l analyse 1 2 Incubation 60 min à 37 ⁰C, puis lavage 3 4 Incubation 60 min à 37 ⁰C, puis lavage 5 Ajout du substrat, incubation 20 min à T. ambiante 6 Figure 9 Schéma du principe de la méthode ELISA de type compétitif 1) Les puits de la microplaque sont recouverts d un antigène recombinant (cf. p. 14 : Matériel fourni par le kit Diapro) 2) Lorsque le plasma du patient est ajouté, une réaction spécifique se forme entre l antigène HDV et les anticorps anti HDV présents chez le patient. 3) Après lavage, il ne reste que les complexes antigènes HDV anticorps anti HDV. 4) Un anticorps IgG polyclonal anti HDV et conjugué à la peroxydase est ajouté. 5) Après lavage, les déchets non spécifiques sont évacués. Le conjugué se lie aux antigènes HDV encore libres. 6) Le substrat chromogène TMB est oxydé en produit jaune par H 2 O 2 et la réaction est catalysée par la peroxydase. La couleur jaune est détectée par le lecteur de microplaque. La concentration des anticorps anti HDV est inversement proportionnelle à l intensité de la couleur mesurée. [20] 16

Le résultat de l analyse est rendu sous forme semi quantitative après une durée d environ 2h30. Le résultat est calculé en rapport à une valeur seuil qui est déterminée par la formule : valeur seuil = (NC + PC) / 5 NC/PC : Résultat d absorbance du Contrôle Négatif et du Contrôle Positif analysés sur l automate avant la série d échantillons. L interprétation des résultats des échantillons est rendue d après le rapport : valeur seuil / absorbance échantillon (et non absorbance / valeur seuil) signifiant qu une valeur positive est supérieure à 1 et une valeur négative est inférieure à 1. [21] Généralement, lors d un test compétitif, l inverse est rencontré (positif < 1 ; négatif > 1). Une zone grise est définie par l intervalle 0.9 à 1.1 fois la valeur seuil. Dans ce cas, le résultat est équivoque et ne peut être rendu ni positif, ni négatif, mais douteux. Un deuxième prélèvement devra être analysé ultérieurement. [21] La sensibilité et la spécificité sont de 98% chacun. [20] Ces valeurs proviennent de la fiche technique du kit et n ont pas été déterminées par le laboratoire LIA. 6.2.2 Interférences L analyse ne doit pas être effectuée lors d une contamination bactérienne ou après inactivation de l échantillon par la chaleur car l absorbance est affectée. [20] 6.2.3 L automate DSX Le DSX du fournisseur Dynex Technologies est un automate d immunologie utilisé pour la réalisation de tests ELISA. Diverses analyses peuvent être effectuées dont la recherche d anticorps anti HDV. Figure 10 L automate DSX du fournisseur Dynex Technologies 17

L automate possède différents compartiments effectuant l ensemble des étapes nécessaires à l obtention d un résultat. D autre part, un ordinateur relié permet de le diriger et d insérer le programme à suivre (ex. quantité d échantillon à pipeter, temps d incubation, nombre de lavages ) Description du DSX : a) Bras mécanique b) Lecteur d absorbance (photomètre) à microplaque c) Incubateurs à 37 ⁰C d) Laveur de microplaque e) Racks échantillons f) Incubateur à température ambiante g) Récipients pour solution de lavage h) Poubelle pour pointes de pipettes i) Poubelle pour liquides Figure 11 Description du DSX j) Lecteur code barre Les échantillons à analyser, munis d un code barre identifiant l échantillon, sont placés sur des racks prévus à cet effet. Les tubes sont emmenés par un bras mécanique pour être identifiés par lecture du code barre. 6.2.4 Hygiène et sécurité Le personnel de laboratoire doit porter des vêtements de protection comme une blouse, des gants et éventuellement des lunettes. Le contact avec des objets tranchants devrait être évité au maximum. Toutes personnes étant en contact avec les échantillons HDV doivent être vaccinées contre l hépatite B, car ce vaccin représente la meilleure protection. [20] 18

6.3 Comparaison générale entre le kit Diapro et le kit Murex Durée du test : Les 2 kits permettent d obtenir un résultat d analyse après une durée d environ 2h30. Conservation des kits ouverts (réactifs, microplaques ) : Les 2 kits sont stockés entre 2 et 8 ⁰C et peuvent être utilisés jusqu'à la date de péremption. Préparation des solutions : Kit Diapro Calibrateur lyophilisé à reconstituer Solution de lavage à diluer 20X Kit Murex Solution substrat à préparer à partir de substrat concentré et de diluant substrat lors de chaque série d analyses journalières Solution d arrêt non fournie par le kit : acide sulfurique 0.5 à 2M Solution de lavage à diluer 20X Coûts engendrés par chaque méthode : Disponible sur demande spécifique auprès de Mr. Cyril André (Cyril.Andre@chuv.ch) 6.4 Résultats Afin que le kit Diapro puisse remplacer le kit Murex, les échantillons testés doivent présenter des résultats corrects et concordants avec les 2 méthodes. La reproductibilité inter et intraessais doit également être dans les limites acceptables des normes qualité. Les résultats (non datés) obtenus avec le kit Murex proviennent des analyses effectuées sur les échantillons dès leur arrivée au laboratoire entre les années 2008 et 2010. Lors d une première série d analyses, l ensemble des échantillons est testé avec la nouvelle méthode Diapro. 19

1 ère série d analyses : Kit Murex Kit Diapro (04.01.2011) No. anonyme Résultats Résultats qualitatifs qualitatifs X fois valeur seuil AHDV01 NEGATIF NEGATIF 0.3 AHDV02 POSITIF POSITIF 7.7 AHDV03 NEGATIF NEGATIF 0.3 AHDV04 POSITIF POSITIF 33.4 AHDV05 NEGATIF NEGATIF 0.2 AHDV06 POSITIF POSITIF 25.8 AHDV07 POSITIF POSITIF 15 AHDV08 POSITIF POSITIF 7.2 AHDV09 POSITIF POSITIF 30.4 AHDV10 NEGATIF NEGATIF 0.2 AHDV11 NEGATIF NEGATIF 0.3 AHDV12 POSITIF POSITIF 37.5 AHDV13 NEGATIF NEGATIF 0.3 AHDV14 POSITIF POSITIF 16.8 AHDV15 POSITIF POSITIF 11.3 AHDV16 POSITIF POSITIF 3.1 AHDV17 POSITIF POSITIF 13.9 AHDV18 POSITIF POSITIF 13.2 AHDV19 NEGATIF NEGATIF 0.3 AHDV20 POSITIF POSITIF 11.1 AHDV21 POSITIF NEGATIF 0.3 AHDV22 NEGATIF NEGATIF 0.3 AHDV23 POSITIF POSITIF 10.1 AHDV24 POSITIF POSITIF 31 AHDV25 POSITIF POSITIF 31.7 AHDV26 POSITIF POSITIF 2.1 AHDV27 POSITIF POSITIF 25.4 AHDV28 NEGATIF NEGATIF 0.3 AHDV29 NEGATIF NEGATIF 0.2 AHDV30 POSITIF POSITIF 65.9 AHDV31 POSITIF POSITIF 1.1 AHDV32 POSITIF POSITIF 5.8 AHDV33 NEGATIF NEGATIF 0.2 AHDV34 POSITIF DOUTEUX 0.9 AHDV35 NEGATIF NEGATIF 0.3 AHDV36 POSITIF POSITIF 24.3 AHDV37 POSITIF POSITIF 30.9 AHDV38 NEGATIF NEGATIF 0.3 AHDV39 NEGATIF NEGATIF 0.3 AHDV40 POSITIF POSITIF 20.8 AHDV41 POSITIF POSITIF 25.5 AHDV42 NEGATIF NEGATIF 0.3 20

Les analyses présentent 2 échantillons discordants (AHDV 21 et 34) entre les 2 méthodes Diapro et Murex. Ces résultats seront commentés dans la partie «Problèmes rencontrés». Reproductibilité inter essais (m) : Le test est effectué avec 3 échantillons : négatif (AHDV 01), faiblement positif (AHDV 32) et fortement positif (AHDV 12). Kit Murex Kit Diapro (07.01.2011) Résultats Résultats No. anonyme X fois valeur seuil qualitatifs qualitatifs AHDV01 NEGATIF NEGATIF 0.3 AHDV12 POSITIF POSITIF 11.7 AHDV32 POSITIF POSITIF 5.2 Reproductibilité intra essai (n) : L analyse est également effectuée avec les échantillons AHDV 01, 12 et 32. Le test est réalisé à triple dans la même série. No. anonyme AHDV01 AHDV12 AHDV32 Kit Murex Kit Diapro (14.01.2011) Résultats Résultats qualitatifs qualitatifs X fois valeur seuil 1) NEGATIF 0.3 NEGATIF 2) NEGATIF 0.3 3) NEGATIF 0.3 POSITIF POSITIF 1) POSITIF 2) POSITIF 3) POSITIF 1) POSITIF 2) POSITIF 3) POSITIF 25.1 30.5 26.3 5.3 5.5 4.9 6.4.1 Evaluation de la reproductibilité inter essais et intra essai anti HDV total Reproductibilité inter essais : Echantillons 04.01.2011 07.01.2011 14.01.2011 AHDV01 0.26 0.28 0.29 AHDV12 38.36 11.61 25.97 AHDV32 5.75 5.05 5.29 Commentaire En nombre de X valeur seuil (VS) Echantillons 04.01.2011 07.01.2011 14.01.2011 AHDV01 2.164 1.912 1.967 AHDV12 0.015 0.047 0.022 AHDV32 0.1 0.108 0.108 Commentaire En valeur d absorbance 21

En valeur d absorbance Echantillons Moyenne CV % Min. max. AHDV01 2.01 6.58 1.912 2.164 AHDV12 0.03 60.08 0.015 0.047 AHDV32 0.11 4.38 0.1 0.108 En nombre de X VS Echantillons Moyenne CV % min. max. AHDV01 0.28 5.46 0.26 0.29 AHDV12 25.31 52.89 11.61 38.36 AHDV32 5.36 6.63 5.05 5.75 Le coefficient de variation (CV) mesure la dispersion relative (l erreur de mesure) et il est calculé (%): (écart type / moyenne échantillons) x 100 Le coefficient de variation de la reproductibilité inter essais est acceptable jusqu à 10%. Les échantillons AHDV 01 et AHDV 32 ont respectivement un CV de valeur seuil à 5.46% et 6.63%. Les CVs sont inférieurs à 10% et sont validés. L échantillon AHDV 12 possède un CV de valeur seuil à 52.89% et un CV d absorbance à 60.08%. Ces résultats ne sont en aucun cas alarmants, car les valeurs d absorbance (0.015 ; 0.047 ; 0.022) sont très basses et la différence est non significative. A ce niveau, la moindre différence d absorbance élève fortement le CV. Il est donc plus judicieux de comparer les 3 valeurs d absorbance entre elles. Dans ce cas, le CV est accepté par rapport aux absorbances. Reproductibilité intra essai : En valeur d absorbance Echantillon Echantillon Echantillon 14.01.2011 14.01.2011 AHDV01 AHDV12 AHDV32 14.01.2011 reproduct.1 1.925 reproduct.1 0.023 reproduct.1 0.108 reproduct.2 1.967 reproduct.2 0.019 reproduct.2 0.105 reproduct.3 1.986 reproduct.3 0.022 reproduct.3 0.118 moyenne : 1.96 moyenne : 0.02 moyenne : 0.11 CV % 1.59 CV % 9.76 CV % 6.17 22

En nombre de X VS Echantillon Echantillon Echantillon 14.01.2011 14.01.2011 AHDV01 AHDV12 AHDV32 14.01.2011 reproduct.1 0.29 reproduct.1 24.84 reproduct.1 5.29 reproduct.2 0.28 reproduct.2 30.07 reproduct.2 5.44 reproduct.3 0.29 reproduct.3 25.97 reproduct.3 4.84 moyenne : 0.29 moyenne : 26.96 moyenne : 5.19 CV % 2.01 CV % 10.21 CV % 6.02 Le coefficient de variation de la reproductibilité intra essai est acceptable jusqu à 10%. Les CV de valeur seuil des échantillons AHDV01 et AHDV32 ont respectivement un CV à 2.01% et 6.02% et sont validés, car ils sont inférieurs à 10%. L échantillon AHDV 12 possède un CV de valeur seuil à 10.21%. Le CV est accepté, car le test HDV est semi quantitatif et non quantitatif. Le nombre de fois la valeur seuil n est pas crucial. 6.5 Problèmes rencontrés Les 2 échantillons discordants (AHDV 21 et 34) testés lors de la 1 ère série d analyses sont testés à nouveau en double avec le kit Diapro afin de vérifier le résultat obtenu. No. anonyme AHDV21 AHDV34 Kit Diapro (07.01.2011) Résultats qualitatifs X fois valeur seuil 1) NEGATIF 1) 0.4 2) NEGATIF 2) 0.4 1) POSITIF 1) 1.2 2) POSITIF 2) 1.2 L échantillon AHDV 34, auparavant douteux avec le kit Diapro, a obtenu un résultat doublement positif. Le résultat est donc considéré comme positif. L échantillon AHDV 21 a un résultat doublement négatif avec le kit Diapro alors qu il était positif avec le kit Murex. D autres analyses doivent être effectuées pour cet échantillon. En parallèle, les 2 échantillons sont analysés à double avec le kit Murex afin de vérifier les résultats obtenus par cette méthode. Ceci permet d observer si une modification de l échantillon est survenue suite au stockage à long terme à 80 ⁰C. 23

No. anonyme AHDV21 AHDV34 Kit Murex Kit Murex (13.01.2011) Résultats Résultats qualitatifs qualitatifs X fois valeur seuil POSITIF 1) POSITIF 1) 0.9 2) DOUTEUX 2) 0.94 POSITIF 1) POSITIF 1) 0.16 2) POSITIF 2) 0.15 Les résultats d analyse des échantillons n ont pas été modifiés avec le temps (ex. dégradation des anticorps). Suite aux résultats obtenus avec l échantillon AHDV 21, un autre échantillon nommé AHDV 21.2 du même patient est testé avec les 2 méthodes. Cet échantillon a été prélevé environ 6 mois après l échantillon AHDV 21. No. anonyme AHDV21.2 Kit Diapro (28.01.2011) Résultats qualitatifs X fois valeur seuil 1) NEGATIF 1) 0.4 2) NEGATIF 2) 0.4 3) NEGATIF 3) 0.4 Avec la méthode Diapro, l échantillon est négatif avec une valeur de 0.4 fois la valeur seuil ce qui correspond à l échantillon AHDV 21 (également négatif à 0.4 fois la valeur seuil). Kit Murex (03.02.2011) No. anonyme Résultats qualitatifs X fois valeur seuil AHDV21.2 1) POSITIF 1) 0.85 Avec la méthode Murex, l échantillon AHDV 21.2 possède une valeur positive à 0.85 fois la valeur seuil (AHDV 21 : positif à 0.9 fois la valeur seuil). La différence de valeur entre les 2 échantillons n est pas significative d une diminution du taux d anticorps dans le plasma du patient. 24

6.6 Discussion des résultats Les analyses réalisées avec les échantillons HDV apportent des résultats très satisfaisants et la reproductibilité inter et intra essais est validée. Aucun problème n est survenu lors des dosages sur l automate. Cependant, des discordances de résultats ont été observées entre les deux méthodes pour les échantillons AHDV 21 et 34. L échantillon AHDV 34 étant faiblement positif avec la méthode Murex et «douteux» avec la méthode Diapro, l échantillon a été dosé une 2 ème fois à double (méthode Diapro) afin de confirmer le résultat. Un échantillon équivoque est toujours analysé une seconde fois. Le résultat est sorti doublement positif donc concordant avec les 2 méthodes et il a été accepté. Concernant l échantillon AHDV 21, le résultat est faiblement positif avec la méthode Murex et négatif avec Diapro. La méthode Diapro est donc moins sensible pour cet échantillon. Des résultats antérieurs ont démontré que lors des 2 prélèvements, le patient était en phase d une diminution du taux d anticorps anti HDV (et non d une augmentation). Sans les antécédents, il aurait été difficile d interpréter ce dosage. Cependant, le résultat n est pas particulièrement important, car il s agit d une perte d anticorps. Cette analyse n est pas compromettante pour l introduction du nouveau kit. En revanche, en cas de début d infection avec une faible quantité d anticorps, une RT PCR (méthode plus sensible) aurait pu être effectuée, car le résultat est très important à ce stade de la maladie. 25

7. Conclusion L hépatite D est une infection souvent oubliée et méconnue alors qu elle peut entraîner de graves conséquences. De plus, le foie est un organe très important et suite à une infection par le HDV, sa guérison est possible, mais en général avec un traitement de longue durée. La sensibilisation du grand public doit donc impérativement continuer contre l hépatite B (déjà mieux connue) puisque sans le HBV, le virus de l hépatite D est incapable de provoquer une infection. Le diagnostic de l hépatite D est d une grande importance pour évaluer les risques d évolution de la maladie et ainsi de pouvoir réagir au plus vite dans les soins donnés au patient. Les analyses réalisées au laboratoire sont donc indispensables et un nouveau kit pour la recherche d anticorps anti HDV totaux doit être introduit. Suite aux analyses réalisées pour tester le kit Diapro, celui ci a montré qu il est performant, plus pratique lors de l utilisation et possède une meilleure stabilité que le kit de la méthode Murex. Un autre point positif pour le laboratoire est de réaliser une économie non négligeable due à la différence de prix entre les kits des 2 méthodes. L ensemble des résultats obtenus par le kit Diapro a permis de le valider et de l introduire. Ainsi, la recherche d anticorps anti HDV totaux est toujours réalisée au laboratoire LIA. Cependant, lors de l introduction d un nouveau kit, la vigilance et l esprit critique sont particulièrement importants. Au niveau personnel, ce travail m a apporté beaucoup de connaissances sur l hépatite D ainsi que sur les hépatites en général. De plus, j ai découvert le cheminement théorique et pratique, ainsi que les contraintes liées à l accréditation d un laboratoire de diagnostic lors de l introduction d une nouvelle méthode de ce type. D autre part, ce travail a une grande importance pour moi, car les connaissances que j ai pu acquérir me serviront dans le métier de technicienne en analyses biomédicales lors d autres comparaisons de méthodes. Je suis aussi ravie d avoir pu effectuer ce travail pour le laboratoire et de savoir que l analyse pourra encore être réalisée pour les patients, en sachant que peu de laboratoires effectuent ce test. 26

8. Références bibliographiques Livres [4] Abbott Diagnostics. (2008). Learning Guid : Hepatitis.USA : Abbott Laboratories, p. 42 45 [14] Abbott Diagnostics. (2008). Learning Guid : Hepatitis.USA : Abbott Laboratories, p. 20 [18] Abbott Diagnostics Division. (2003 2007). Fiche technique : Murex anti Delta (total), Germany : Abbott, p. 2 6 [19] Diagnostic Bioprobes (2006). Fiche technique: HDV Ab Competitive Enzyme Immunoassay for the determination of antibodies to Hepatitis Delta virus in human serum and plasma. Milan: Diagnostic Bioprobes, p. 2 [20] Diagnostic Bioprobes (2006). Fiche technique: HDV Ab Competitive Enzyme Immunoassay for the determination of antibodies to Hepatitis Delta virus in human serum and plasma. Milan: Diagnostic Bioprobes, p. 2 [21] Diagnostic Bioprobes (2006). Fiche technique: HDV Ab Competitive Enzyme Immunoassay for the determination of antibodies to Hepatitis Delta virus in human serum and plasma. Milan: Diagnostic Bioprobes, p. 5 Sites Internet [1] Service d immunologie et allergie. (15 novembre 2010). Site Officiel [Page Web]. Accès : http://www.immunologyresearch.ch/ (page consultée le 27 décembre 2010) [2] Médecine et Santé. (s.d.) Les hépatites. [Page Web]. Accès : http://www.medecine et sante.com/maladiesexplications/hepatites.html (page consultée le 27 décembre 2010) [3] Moradpour, D. & Negro, F. (2010). Hépatite D : oubliée mais pas disparue. Revue Médicale Suisse [Page Web], 261. Accès : http://titan.medhyg.ch/mh/formation/article.php3?sid=35059 (page consultée le 04 janvier 2011) [5] Hépatoweb. (05 janvier 2011). Hépatobase : Les hépatites virales A, B, C, D, E. [Page web]. Accès : http://hepatoweb.com/hepatobase/hepatite.html (page consultée le 20 décembre 2010) [6] Internet Scientific Publications. (13 février 2009). Developments In Hepatitis Delta Research. The Internet Journal of Tropical Medicine 2003. [Page web], 1 (2). Accès : http://www.ispub.com/journal/the_internet_journal_of_tropical_medicine/volume_1_num ber_2_62/article_printable/developments_in_hepatitis_delta_research.html (page consultée le 29 décembre 2010 et traduite de l anglais) 27

[7] Action incitative simulation de chirurgie. (10 mars 1998). Anatomie du foie [Page Web]. Accès : http://www sop.inria.fr/epidaure/formercollaborations/aisim/simulateur/annexec.html (page consultée le 11 mars 2011) [8] Vulgaris médical. (s.d.). Foie (maladie, symptômes, consultation médicale, traitement). [Page Web]. Accès : http://www.vulgaris medical.com/encyclopedie/foie 1947/anatomie.html (page consultée le 27 décembre 2010) [9] Medix cours de médecine. (s.d.). Physiologie du lobule hépatique. [Page Web]. Accès : http://www.medix.free.fr/sim/physiologie lobule hepatique.php (page consultée le 28 décembre 2010) [10] Association pour la santé et l environnement, Developpement Humain Durable. (12 juillet 2008). Quelques notions sur le foie. [Page Web]. Accès : http://associationpourlasanteetlenvironnement.skynetblogs.be/archive/2008/07/12/quelqu es notions sur le foie.html (page consultée le 27 décembre 2010) [11] Information Hospitalière, Une filiale de Lavoisier. (20 septembre 2006). Dictionnaire médical : Hépatites virales. [Page Web]. Accès : http://www.informationhospitaliere.com/dico 44 hepatite virale.html (page consultée le 28 décembre 2010) [12] Agence de la santé publique du Canada. (16 février 2004). Feuillet d information sur l hépatite D. [Page Web]. Accès : http://www.phac aspc.gc.ca/hcai iamss/bbp pts/hepatitis/hep_d fra.php (page consultée le 28 décembre 2010) [13] Les cours dentaire, Les Dentistes Communauté. (15 décembre 2010). Hépatites virales. [Page Web]. Accès : http://www.lescoursdentaire.com/1391 (page consultée le 29 décembre 2010) [15] Institut de Microbiologie. (02 février 2010). Hepatitis B Resistance and Quantitative HDV RNA Testing. [Page Web]. Accès : http://www.chuv.ch/imul/imu collaborations hbv_resistance_testing.htm (page consultée le 05 janvier 2011 et traduite de l anglais) [16] Vulgaris médical. (s.d.). Interféron. [Page Web]. Accès : http://www.vulgaris medical.com/encyclopedie/interferon 2555.html (page consultée le 26 février 2011) [17] Hépatite. (s.d.). Pegyle. [Page Web]. Accès : http://hepatique.free.fr/index.php/dossier/pegyle (page consultée le 26 février 2011) 28

Figures Figure 1 Récapitulatif des hépatites virales (tableau traduit de l anglais et modifié) Abbott Diagnostics. (2008). Learning Guid : Hepatitis.USA : Abbott Laboratories (page 51) 2008 Abbott Laboratories HP_08_25638/v1 5 Sep Printed in USA Figure 2 Virus de l hépatite D Abbott Diagnostics. (2008). Learning Guid : Hepatitis.USA : Abbott Laboratories (page 42) 2008 Abbott Laboratories HP_08_25638/v1 5 Sep Printed in USA Figure 3 Représentation schématique du cycle de réplication du HDV http://www.ispub.com/journal/the_internet_journal_of_tropical_medicine/volume_1_num ber_2_62/article_printable/developments_in_hepatitis_delta_research.html (page consultée le 29 décembre 2010) Figure 4 Le foie http://www sop.inria.fr/epidaure/formercollaborations/aisim/simulateur/annexec.html (page consultée le 28 décembre 2010) Figure 5 L hépatocyte http://www.lescoursdentaire.com/1391 (page consultée le 28 décembre 2010) Figure 6 Surinfection d une hépatite B chronique par l hépatite D : Evolution sérologique clinique. Abbott Diagnostics. (2008). Learning Guid : Hepatitis.USA : Abbott Laboratories (page 44) 2008 Abbott Laboratories HP_08_25638/v1 5 Sep Printed in USA Figure 7 Co infection de l hépatite B et l hépatite D : Evolution sérologique typique en cas de guérison spontanée de l hépatite B. Abbott Diagnostics. (2008). Learning Guid : Hepatitis.USA : Abbott Laboratories (page 44) 2008 Abbott Laboratories HP_08_25638/v1 5 Sep Printed in USA Figure 8 Répartition géographique de la prévalence de l hépatite D (présence de l anti HDV chez les patients). La carte regroupe les données générales disponibles. Abbott Diagnostics. (2008). Learning Guid : Hepatitis.USA : Abbott Laboratories (page 43) 2008 Abbott Laboratories HP_08_25638/v1 5 Sep Printed in USA Figure 9 Schéma du principe de la méthode ELISA de type compétitif Schéma personnel Figure 10 L automate DSX du fournisseur Dynex Technologies http://www.dynextechnologies.com/products/type/fullyautomated/4_plate (page consultée le 10 janvier 2011) Figure 11 Description du DSX http://www.dynextechnologies.com/docs/spool/95000010_dsx_brochure_01 12 07.pdf (page consultée le 10 janvier 2011) 29

9. Lexique (a) VHD : Le virus de l hépatite D est abrégé VHD en français et HDV en anglais. (b) Défectif : Un virus défectif (ex. HDV) est un virus qui est dans l impossibilité de se multiplier après avoir pénétré à l intérieur d une cellule hôte, car il est incapable d intégrer sont matériel génétique à celle ci. Pour se multiplier, le virus doit recevoir l aide d un autre virus. Dans le cas présent, c est le virus de l hépatite B qui interviendra afin d assurer le développement du HDV. (c) HBV : Le virus de l hépatite B est abrégé VHB en français et HBV en anglais. (d) Particule virale : Une particule virale est un virus sous sa forme libre. Il est aussi appelé virion. (e) ARN génomique : L acide ribonucléique (ARN) constitue le génome de certains virus, c est à dire qu il contient l ensemble du matériel génétique propre au virus. Cet ARN peut être de polarité positive ou négative. Concernant le HDV, l ARN génomique est de polarité négative. Il ne peut pas être transporté par l ARNm. (f) Multimères d ARN antigénomique : Un multimère d ARN antigénomique est une copie complémentaire au multimère d ARN génomique. Cet ARN sera transporté par l ARNm vers les ribosomes responsables de la traduction. (g) ARNm : Lors de la transcription, l ARN messager est formé par la polymérase du virus. Il est complémentaire à l ARN génomique. (h) RNPs HDV : Les ribonucléoprotéines (RNPs) HDV sont une association de l ARN du virus HDV et d autres protéines le constituant comme par exemple l antigène Delta. (i) ALAT : Abréviation de l enzyme alanine aminotransférase (j) ASAT : Abréviation de l enzyme aspartate aminotransférase (k) PAL : Abréviation de l enzyme phosphatase alcaline (l) LDH : Abréviation de l enzyme lactate déshydrogénase (M) Reproductibilité inter essais : Les échantillons sont analysés lors de différentes séries, sur plusieurs jours ou semaines et par plusieurs personnes. Avec le kit Diapro, la solution de calibration ainsi que les contrôles sont analysés lors de chaque série. (N) Reproductibilité intra essai : Les échantillons sont analysés dans une seule et même série, le même jour et par la même personne. La solution de calibration ainsi que les contrôles sont les mêmes pour tous les échantillons de la série. 30

10. Remerciements Mes remerciements aux médecins FAMH Dr. Philippe Bürgisser et Drsse Cristina Cellerai pour les corrections qu ils ont apportées à mon travail de diplôme ainsi qu à mes responsables accompagnants de travail de diplôme M. Cyril André et Mme Patricia Pochon pour les conseils, les corrections ainsi que le suivi qu ils m ont donnés tout au long de ce travail. Je remercie également toute l équipe d immunologie et allergie pour leur soutient. 31

11. Annexes Résultats d analyses bruts Fiche technique du kit de la méthode Diapro (en anglais) : HDV Ab Fiche technique du kit de la méthode Murex : Murex anti Delta (total) 32