Leroy G. 1,2, Danchin-Burge C. 3, Verrier E. 1,2

Innovations Agronomiques 29 (2013), 75-83 Faire face à de nouveaux enjeux : re-diversifier des ressources génétiques? Impacts de la réintroduction de ressources cryoconservées dans un programme de sélection Leroy G. 1,2, Danchin-Burge C. 3, Verrier E. 1,2 1 AgroParisTech, UMR1313 Génétique Animale et Biologie Intégrative, 16 rue Claude Bernard, F-75231 Paris 05 2 INRA, UMR1313 Génétique Animale et Biologie Intégrative, F-78350 Jouy-en-Josas 3 Institut de l Elevage, 149 rue de Bercy, F-75012 Paris Correspondance : gregoire.leroy@agroparistech.fr Résumé La cryoconservation est un mode de conservation statique des ressources génétiques, qui peuvent alors être valorisées pour réorienter un programme de sélection ou réinjecter de la variabilité génétique au sein d une population. Sur la base de simulations en bovin laitier, il peut être montré que le recours au matériel cryoconservé n apparait utile que dans le cas de changements drastiques des objectifs de sélection, ou bien d une volonté affirmée de réintroduire de la variabilité génétique. Le développement des outils d identification et d indexation génomique offre des perspectives intéressantes, tant pour identifier les individus destinés à être stockés en cryobanque, que pour utiliser ces derniers. Mots-clés : cryobanque, semence, variabilité génétique, ressources génétiques animales Abstract: Facing new challenges: re-diversify genetic resources? Impacts of the reintroduction of resources cryopreserved in a selection scheme. Cryopreservation is a static way for the conservation of genetic resources. These frozen resources can be used to redirect selection or increase the genetic variability within a population. Based on simulations in dairy cattle, it can be shown that the use of cryopreserved material appears to be useful only in case of drastic changes in breeding objectives, or a main objective to reintroduce genetic variability. Development of genomic tools for identification and indexation provides interesting perspectives for identifying individuals to be stored or used for and from cryobank. Keywords: cryobank, semen, genetic variability, animal genetic resources

G. Leroy et al. Introduction La question de la gestion et de la conservation des ressources génétiques fait partie intégrante des éléments à prendre en compte lorsqu on s intéresse aux défis auxquels l agriculture mondiale aura à faire face au cours des prochaines années. Le vaste réservoir de gènes que constituent les populations et lignées domestiquées et en cours de domestication, ainsi que les savoirs et savoir-faire associés, peuvent contribuer à une sélection répondant à la fois à une demande alimentaire croissante (de l ordre de +70% en 2050 selon la FAO), et à d éventuels bouleversements d objectifs de sélection, notamment liés au changement climatique. La cryoconservation, développée grâce aux progrès des biotechnologies de la reproduction, constitue, en tant que méthode de conservation «ex situ in vitro», un outil des plus intéressants pour conserver les ressources génétiques animales. Elle n est cependant pas exempte de faiblesses, liées tant aux spécificités même de la conservation ex-situ, qu aux limites technologiques de la méthode. Nous nous proposons ici de revenir sur les principes et opportunités liés à la cryoconservation des ressources génétiques animales. Nous nous intéresserons plus particulièrement à la question de la valorisation des ressources cryoconservées en traitant, sur la base de données simulées, un exemple d utilisation de semence cryoconservée dans un programme bovin laitier réorientant ses objectifs de sélection. 1. Les enjeux de la cryoconservation des ressources génétiques animales 1.1. Les stratégies de conservation des ressources génétiques animales De manière générale, on considère que la conservation des ressources génétiques doit s attacher, d une part, à garantir une flexibilité des systèmes d élevages face à des bouleversements d ordre économiques, politiques ou environnementaux, et d autre part, à assurer la durabilité du milieu rural et des agro-écosystèmes, tant dans leurs composantes biologiques que socio-économiques (Gandini et Oldenbroek, 2007). En terme stratégique, trois approches peuvent être distinguées : - La conservation in situ concentre ses efforts sur le maintien de populations maintenues dans leurs milieux usuels d élevage. Outre que cette approche est généralement simple sur le plan technique à mettre en œuvre chez les animaux, elle est souvent considérée comme préférable dans le sens où elle permet le maintien de populations dans une gestion dynamique. Cette stratégie peut cependant impliquer un manque-à-gagner pour les éleveurs lorsque les caractéristiques des races conservées ne sont pas les mieux adaptées au contexte agronomique et économique local. - La conservation ex situ in vivo reprend le même principe, mais propose de maintenir de petits noyaux de la population au sein de conservatoires, de parcs ou de fermes expérimentales, c est-à-dire en dehors du milieu traditionnel dans lequel sont élevées les races. Si l approche peut apparaître moins coûteuse en terme de nombre d animaux à entretenir, elle est néanmoins dépendante de financements publics ou liés à des projets patrimoniaux qu il n est pas forcément évident de pérenniser. L approche a aussi l inconvénient de fragiliser les populations vis-à-vis d éventuels aléas (épizooties ) ou de la dérive génétique. - Enfin, la conservation ex situ in vitro, c est-à-dire la cryoconservation, consiste en une conservation statique des ressources génétiques, c est-à-dire sous forme de semences, d ovaires, d embryons ou de tissus congelés. Le Tableau 1 résume les spécificités des trois stratégies de conservation. 76 Innovations Agronomiques 29 (2013), 75-83 6 7 6

Réintroduction de ressources cryoconservées Tableau 1 : Objectifs et spécificités des techniques de conservation (d après FAO 2012) Flexibilité vis-àvis de changements futurs Facteurs génétiques Utilisation raisonnée des milieux ruraux Objectifs Assurance vis-à-vis de changements des conditions de production Sauvegarde vis-à-vis de maladies ou de désastres In situ Ex situ in vivo Cryoconservation ++ + ++ + - ++ Opportunités pour la recherche ++ ++ ++ Permettre l évolution et l adaptation des populations Connaitre les spécificités phénotypiques des populations Limiter l exposition à la dérive génétique Opportunités de développement des milieux ruraux Maintien de la diversité des agroécosystèmes Conservation de la diversité culturelle ++ + - +++ ++ + + - ++ +++ + - ++ - - ++ + - Si la cryoconservation n offre que peu de perspectives directes vis-à-vis de la valorisation des territoires, elle constitue la stratégie la plus sécurisée pour conserver des gènes et allèles spécifiques, notamment pour les races commerciales soumises à une importante dérive génétique. Il convient cependant de ne pas oublier les différentes contraintes techniques auxquelles peut être soumise la cryoconservation. 1.2. Spécificités de la cryoconservation Les questions de la quantité, de l échantillonnage et du type de matériel destiné à être conservé constituent des interrogations majeures lorsque l on cherche à mettre en place un programme de cryoconservation (Gandini et Oldenbroek, 2007). A titre d illustration, si les embryons constituent un matériel de choix pour la reconstruction d une race, puisqu ils permettent d obtenir directement des individus de la population considérée, ils sont plus complexes et coûteux à obtenir en quantité que des doses de semences congelées. Qui plus est, les biotechnologies de la reproduction ne sont pas développées de manière similaire en fonction des espèces, et par exemple, il n est à l heure actuelle pas possible d obtenir des ovocytes congelés utilisables en dehors des bovins. Il est donc important d être conscient de ces contraintes lors de la mise en place de stratégies de cryoconservation, notamment vis-à-vis du choix et du nombre d individus à échantillonner. 1.3. Objectifs de la cryoconservation La FAO (2012) considère que la cryoconservation doit servir à trois différents objectifs. D une part, en tant que banque de gènes, la technique doit pouvoir être employée pour stocker des génotypes et des haplotypes particuliers, d intérêt agronomique, scientifique ou patrimonial. D autre part, les échantillons stockés en cryobanque doivent être en nombre suffisant pour pouvoir permettre la reconstitution de populations disparues, ce qui pose la question d être en mesure de disposer d un échantillonnage Innovations Agronomiques 29 (2013), 75-83 77

G. Leroy et al. suffisant et représentatif pour assurer une telle reconstitution. Enfin, la cryoconservation doit pouvoir être utilisée pour soutenir la conservation ou la sélection de populations in vivo. En effet, une banque de gènes peut constituer un atout pour la gestion des populations, puisqu elle peut permettre de sécuriser, centraliser et mettre à disposition un matériel génétique utilisable. Ce matériel peut appartenir à des individus actuellement élevés, mais peut aussi concerner des reproducteurs décédés depuis de nombreuses années, mais pouvant avoir un intérêt pour la population actuelle. C est à partir du constat de cette diversité d objectifs qu ont été établies les stratégies d échantillonnage utilisées à l heure actuelle en France (Verrier et al., 2003). Les stockages de type I constituent les échantillons effectués dans l objectif de pouvoir reconstituer les populations en cas de menace ou de disparition. Les échantillons de type II correspondent à des individus présentant des phénotypes extrêmes (sur des traits phénotypiques dépendant de l espèce) ou des génotypes originaux, pouvant avoir un intérêt éventuel à l avenir. Enfin, le matériel de type III est stocké dans l objectif de disposer d animaux représentatifs, à un instant donné, de leur population. 2. Impacts de la réintroduction de semence cryoconservée dans un programme de sélection bovin. 2.1. Contexte de l étude Les bovins laitiers constituent, à plusieurs titres, des populations emblématiques des problématiques de gestion et de conservation des ressources génétiques animales. En effet, par les spécificités physiologiques de l espèce, l utilisation de la semence congelée y est généralisée depuis plusieurs dizaines d années, et ce sont chaque année des dizaines de milliers d embryons qui sont transférés dans le cadre des programmes de sélection. A titre d exemple, le taureau Prim Holstein Jocko Besne a eu plus de 300 000 filles au cours de sa carrière. C est notamment par la diffusion importante de la semence d un petit nombre de taureaux améliorateurs (pères à taureaux et à génisses) que s expliquent les améliorations conséquentes des caractères de production des bovins laitiers. Ainsi, entre 1996 et 2011, ce sont près de 100 litres d index génétique laitier qui ont été gagnés chaque année en race Prim Holstein (Dezetter et Le Mézec, 2011). Pour autant, un tel progrès n a pas été sans conséquences négatives sur des traits fonctionnels (longévité, reproduction) négativement corrélés à la production (au moins jusque dans les années 2000 pour la Prim Holstein), ou sans impact sur l accroissement de la consanguinité au sein des populations sélectionnées. A titre d exemple, différentes études (Croquet et al., 2006 ; Miglior et al., 2012 ; Thompson et al., 2000) ont mis en évidence un impact négatif sur la production laitière à 305 jours, impact estimé à 25 litres par point de consanguinité. La consanguinité moyenne de la population française de vaches Prim Holstein étant de l ordre de 4% (Danchin-Burge et al., 2012), on pourrait estimer la perte de production laitière liée à l accroissement de consanguinité à 100 litres, soit un an de progrès génétique. Prise indépendamment de toute autre chose, cette perte pourrait être facilement supportable. Il convient cependant de prendre en compte les autres caractères (production, reproduction, caractères fonctionnels, ) impactés par la consanguinité, ainsi que les risques de diffusion d affections héréditaires (BLAD, syndrome Bulldog, CVM, ) liés à la surutilisation de taureaux porteurs de maladies jusqu alors peu connues. Pour ces différentes raisons, la valorisation de semence issue de vieux taureaux apparaît comme une alternative toute à fait intéressante pour une race bovine pour laquelle il est nécessaire (i) de réorienter ses objectifs de sélection vers des caractères ayant pu connaître une dégradation génétique, ou bien (ii) de réintroduire de la variabilité génétique. A partir d une population bovine simulée (Leroy et al., 2011), nous nous sommes intéressés aux conditions pour lesquelles il peut apparaître intéressant d utiliser des taureaux issus de cryobanque. 78 Innovations Agronomiques 29 (2013), 75-83 8 7 8

Réintroduction de ressources cryoconservées 2.2. Matériel et méthodes Le principe de la simulation était de considérer une population sur 13 générations séparées, constituées chacune de 100 candidats mâles et 10 000 candidats femelles, 10 mâles et 50 femelles étant sélectionnés comme pères et mères à taureaux, et 20 mâles comme pères à génisses, les 10 000 femelles étant utilisées comme mères à génisses. Deux caractères ont été considérés, désignés A (par exemple la production laitière) et B (par exemple un critère fonctionnel), avec une corrélation génétique négative entre les deux (ρ=-0.3). La sélection était effectuée au cours des générations 0 à 8 sur la seule valeur génétique estimée pour le caractère A (EVGA) (voir Leroy et al. (2011) pour de plus amples détails). En parallèle et à chaque génération, un certain nombre de taureaux était échantillonné selon le protocole actuellement défini en France pour la cryobanque nationale. A la génération 9, l utilisation de la semence congelée issus de taureaux stockés dans la cryobanque est envisagée pour produire 40% des taureaux de la génération suivante. A partir de la génération 9, le programme de sélection est modifié en fonction de deux types de scénarios : Scénarios b : réorienter les objectifs de sélection vers un index synthétique (IS) prenant en compte les caractères A et B, avec une pondération wb pour B variant de 0.5 à 0.9 en fonction des scénarios (wa= 1-wB). Scénarios d : introduire de la variabilité génétique au sein de la population. On envisagera comme changement de modalité de gestion, le maintien éventuel des lignées mâles, en considérant que chaque père à taureaux doit avoir un fils lui-même sélectionné comme père à taureaux. Les hypothèses testées au sein des différents sous-scénarios sont résumées au sein du Tableau 2, l évolution de la variabilité génétique étant estimée sur la base de la parenté moyenne ϕ intrapopulation. Tableau 2 : Description des scénarios utilisés Scénarios Utilisation des taureaux stockés en cryobanque Schéma de sélection durant l étape 2 (générations 9-12) Objectif Code Critères de choix des taureaux issus de la cryobanque % des mâles produits Objectif de sélection Modalité de sélection des pères à taureaux Amélioration du trait B Maintien de la variabilité génétique b1 Meilleur valeur d index synthétique (IS) 40 EVG A Aucun changement b2 Pas d utilisation 0 TI Aucun changement b3 d1 Meilleur valeur d index synthétique (IS) Minimisation de la parenté avec la population actuelle d2 Pas d utilisation 0 EVG A d3 Minimisation de la parenté avec la population actuelle 40 TI Aucun changement 40 EVG A Aucun changement 40 EVG A Conservation des lignées mâles Conservation des lignées mâles Innovations Agronomiques 29 (2013), 75-83 79

Valeur génétique ϕ G. Leroy et al. 2.3. Résultats 2.3.1. Scénarios b : réorientation des objectifs de sélection La Figure 1 présente un cas où l on considère une utilisation de la semence issue de taureaux stockés en cryobanque, sans pour autant modifier le programme de sélection lui-même (scénario b1). Du fait de la corrélation négative entre le caractère A sélectionné, et le caractère B non sélectionné, la dégradation du niveau génétique de ce dernier apparait inéluctable en l absence de changement du programme. Dans une telle configuration, la simulation montre que l utilisation de semence de taureaux de la cryobanque aura des impacts quasi-négligeables, tant sur les moyennes génétiques que sur la variabilité génétique du cheptel. En effet, dans le scénario envisagé, 40% des jeunes mâles sont nés des taureaux de la cryobanque. Or, en l absence de changement d objectifs de sélection, le niveau génétique de ces taureaux est au mieux médiocre par rapport aux taureaux des générations plus récentes, et leurs fils n ont donc que très peu de chances d être sélectionnés comme père à taureaux ou à génisses. a b Figure 1 : Evolution de la valeur génétique exprimée en écart-type (a) et de la variabilité génétique (b) selon le scénario b1. (lignes pointillées : mâles candidats ; lignes pleines : population entière. : caractère A, : caractère b, x : parenté ϕ) Ce résultat montre bien qu une réintroduction de ressources cryoconservées ne peut avoir d efficacité qu accompagnée d une modification claire des objectifs de sélection. Il apparait donc intéressant d observer, dans le cas d un changement d objectif de sélection, en quoi l utilisation de semences issues de taureaux mis en cryobanque peut apparaître comme une opportunité intéressante. Comme l illustre la Figure 2, dans le cas où un nouveau caractère (B) est introduit pour peser à hauteur de 50% des objectifs de sélection, le fait d introduire ou non de la semence ne semble affecter les valeurs génétiques ou la variabilité génétique qu à la marge. Ce n est qu au-delà de 80%, que les fils de taureaux cryoconservés commencent à être régulièrement sélectionnés eux-mêmes et à diffuser leurs gènes au sein de la population, avec un impact clair sur la variabilité génétique, comme l illustre la Figure 2. 80 Innovations Agronomiques 29 (2013), 75-83 0 8 0

Valeur génétique Valeur génétique ϕ ϕ Réintroduction de ressources cryoconservées a b Figure 2 : Evolution de la valeur génétique exprimée en écart-type (a) et de la variabilité génétique (b) selon la pondération w B donnée au caractère B (scénario b2 et b3). (lignes noires pleines : scénario b2 (w B=0.5 et pas d utilisation de taureaux issu de la cryobanque) ; lignes noires pointillées : scénario b3 (w B=0.5) ; lignes grises pleines : scénario b3 (w B=0.7) ; lignes grises pointillées : scénario b2 (w B=0.9). : caractère A, : caractère b, x : parenté ϕ) 2.3.2. Scénarios d : maintien de la variabilité génétique La Figure 3 illustre la possibilité d utilisation de la semence cryoconservée pour réintroduire de la variabilité génétique au sein d une population. On notera une fois encore que pour être efficace, celle-ci doit être combinée à des mesures permettant de diffuser au sein de la population les taureaux ainsi nés, par exemple en maintenant les lignées paternelles. Notons enfin qu une telle mesure à un impact sur les valeurs génétiques du cheptel, la valeur génétique au caractère B augmentant légèrement au détriment du caractère A préalablement sélectionné. a b Figure 3 : Evolution de la valeur génétique exprimée en écart-type (a) et de la variabilité génétique (b) selon les scénarios d1, d2, et d3. (lignes noire pleines : scénario d1 ; lignes grises pleines : scenario d2 ; lignes grises pointillées : scenario d3. : caractère A, : caractère b, x : parenté ϕ) 2.4. Discussion Les résultats de ces simulations permettent de préciser dans une certaine mesure les circonstances dans lesquelles les ressources cryoconservées pourraient être valorisées. Dans le cas d une population Innovations Agronomiques 29 (2013), 75-83 81

G. Leroy et al. efficacement sélectionnée depuis plusieurs générations, comme la plupart des races bovines laitières, seules des circonstances exigeant des changements drastiques d objectifs de sélection devraient justifier le recours à du matériel issu de la cryobanque, au moins dans le cas de programmes de sélection sans information génomique. Une telle utilisation peut apparaître cependant intéressante dans le cas de populations où le progrès génétique est plus lent, les reproducteurs de la cryobanque pouvant réintroduire de la variabilité génétique sans pour autant dégrader de manière importante le niveau génétique de la population. A titre d illustration, on citera le cas de la race bovine Abondance, au sein de laquelle, un taureau né en 1977 a été utilisé en 2003 pour donner naissance à un mâle, dénommé Vaccin, peu apparenté avec la génération de femelles nées entre 2004-2007 (4,6% contre 6,5% en moyenne), et maintenant diffusé comme mâle d insémination au sein de la race. La mise en place de la sélection génomique constitue une opportunité intéressante pour la valorisation des ressources cryoconservées, tant en terme d identification de caractères d intérêt, que de précision de l évaluation pour pouvoir utiliser les individus stockés les plus intéressants pour l objectif souhaité. Le génotypage devrait en effet permettre d identifier de manière plus fine les individus porteurs de gènes d intérêt, que ces individus soient en cryobanque ou en passe d être échantillonnés. La valorisation des ressources cryoconservées devrait aussi s en trouver accrue. Les travaux de simulation d Odegard et al. (2009) se sont ainsi intéressés aux possibilités d introgression de QTLs d intérêt (résistance à une maladie) d une lignée de poissons de niveau génétique médiocre pour un caractère de production à une lignée de niveau génétique supérieur. Si, dans le cadre de programmes de sélection sans données génomiques, il n était pas possible d effectuer une telle introgression sans affecter le niveau génétique pour le caractère de production, la sélection génomique permet de récupérer le QTL en obtenant dans le même temps un léger gain de niveau génétique. Un tel résultat suggère que l emploi de la sélection génomique en parallèle de l utilisation de matériel cryoconservé pourrait permettre d introduire des caractères d intérêt ou de la variabilité génétique au sein des populations, sans pour autant renoncer au progrès génétique précédemment acquis. Conclusion En tant que mode de conservation statique des ressources génétiques, il apparaîtrait réducteur de considérer la cryoconservation comme un «fichier de sauvegarde» du vivant auquel on s interdirait de toucher autrement que pour reconstituer une race victime d une catastrophe. La communauté scientifique et technique s entend pour recommander d employer de manière complémentaire les techniques de conservation in situ et ex situ, en utilisant notamment le matériel cryoconservé pour assurer une gestion optimale de la variabilité génétique. Nous avons illustré ici en quoi ces ressources peuvent de plus être valorisées pour réorienter des programmes de sélection, les apports de la génomique arrivant par ailleurs à point nommé pour affiner les choix d échantillonnage et d utilisation des ressources cryoconservées. Références bibliographiques Croquet C., Mayeres P., Gillon A., Vanderick S., Gengler N., 2006. Inbreeding depression for global and partial economic indexes, production, type, and functional traits. Journal of Dairy Science 89, 2257-2267. Danchin-Burge C., Leroy G., Moureaux S., Verrier E., 2012. Evolution of the genetic variability of 8 French dairy cattle breeds assessed by pedigree analysis. Journal of Animal Breeding and Genetics 129, 206-217. 82 Innovations Agronomiques 29 (2013), 75-83 2 8 2

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