au laboratoire de virologie I. LAHLOU AMINE 1, J.J. CHOMEL 2, A.J. BAAJ 1. 1-Laboratoire de bactériologie-virologie, Hôpital Militaire d Instruction Mohamed V, Rabat. 2-Laboratoire de Virologie du CHU de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, France. Résumé : Les gastro-entérites infectieuses représentent l un des premiers motifs de consultation médicale. Les virus associés aux gastro-entérites appartiennent à de nombreux groupes taxonomiques. La majorité de ces virus sont difficilement cultivables et les premières identifications ont reposé sur la microscopie électronique (rotavirus, adénovirus, calicivirus, astrovirus...). Les techniques les plus employées aujourd hui reposent sur la recherche d antigènes dans les selles par méthodes immunoenzymatiques de type ELISA ou agglutination de particules de latex. Les techniques de biologie moléculaire et l amplification génique en particulier, sont actuellement en plein essor: PCR (adénovirus) ou RT-PCR (calicivirus, astrovirus, rotavirus...). Malgré les efforts de standardisation et l optimisation de ces techniques, leur utilisation reste limitée en raison du grand nombre de virus concernés et de l absence de trousses d amplification génique commercialisées. Mots-clés : Virus, gastro-entérites, diagnostic virologique. Les gastro-entérites infectieuses constituent un problème de santé publique dans le monde entier. Dans les pays en voie de développement, elles représentent une des principales causes de mortalité et de malnutrition infantiles avec plus de trois millions de décès annuels. En revanche, même si dans les pays développés la prise en charge thérapeutique précoce et adaptée a permis de réduire la létalité de manière importante, la morbidité reste cependant élevée et son impact économique préoccupant. La part relative revenant aux bactéries, aux parasites et aux virus varie selon plusieurs facteurs (âge des patients, origine géographique, contexte épidémique ou endémique). L étude des agents pathogènes responsables de ces infections montre qu il s agit selon les cas de bactéries, de parasites ou de virus. Selon différentes études les virus sont considérés en terme de fréquence comme les principaux agents responsables de gastro-entérites aiguës (communautaires ou noso-comiales) sévères notamment chez les jeunes enfants et pouvant atteindre des taux de 80%, notamment dans les pays développés[1]. Article reçu le 12 Mars 2002. Adresse de correspondance et de tirés à part : Dr. I. Lahlou Amine Laboratoire de bactériologie-virologie, Hôpital Militaire d Instruction Mohammed V, Rabat. e-mail: idr_lahlou@yahoo.com 218 Biologie & Santé vol. 3, n 1, 2003
Malgré les avancées réalisées durant les deux dernières décennies, l étiologie de ces infections demeure inconnue dans une proportion allant de 25 à 55% selon les études[2]. Le rôle du laboratoire de virologie dans le diagnostic des gastro-entérites virales mais aussi dans le suivi des souches à l aide de marqueurs épidémiologiques est primordial pour une meilleure évaluation de leur incidence. C est au rappel des techniques classiques immunologiques de détection de ces virus mais aussi des techniques modernes de biologie moléculaire basées sur la détection des acides nucléiques viraux spécifiques qu est consacrée cette revue de mise au point. Matériels et méthodes Agents responsables des gastro-entérites virales De nombreux virus peuvent être retrouvés dans les selles, mais la preuve de leur pathogénicité n est pas établie pour tous. Ces virus peuvent être classés en trois groupes : 1-Virus de "passage", non entéropathogènes, retrouvés dans les selles humaines sans lien de causalité à des gastro-entérites: Entérovirus, Réovirus (type 1-3), Adénovirus ( types 1-39). 2-Virus opportunistes impliqués dans les troubles digestifs de l immunodéprimé: coronavirus, cytomégalovirus, virus herpès simplex, VIH VIRUS Famille Année d implication dans la pathologie digestive Taille (nm) Type d acide nucléique Symétrie de la nucléocapside Enveloppe Fréquence (d après la littérature) Rotavirus Reoviridae 1973 70nm ARN bicaténaire Icosaédrique Non Rotavirus groupe A >50% Adenovirus 40/41 Adenoviridae 1981 80 à 110 nm ADN bicaténaire Icosaédrique Non 2 à 6 % Calicivirus Caliciviridae 1972 27 à 30 nm ARN monocaténaire Icosaédrique Icosaédrique Non 8 à 15% Astrovirus Astroviridae 1975 28 à 30 nm ARN monocaténaire Pléïomorphe Non 2 à 8 % Torovirus Coronaviridae 1984 30 à 120 nm ARN monocaténaire Pléïomorphe Oui? Coronavirus Coronaviridae 1980 100 à 200 nm ARN monocaténaire Hélicoïdale Oui? TABLEAU I : Principaux virus impliqués dans des gastro-entérites Biologie & Santé vol. 3, n 1, 2003 219
I. Lahlou Amine et al. Rotavirus Coronavirus Calicivirus Torovirus Astrovirus Adenovirus Figure 1 : Représentation schématique de quelques virus associés à des gastro-entérites 3-Virus associés à des gastro-entérites: rotavirus, calicivirus humains, astrovirus et adénovirus entériques sont les plus importants. ( figure 1 et tableau I ). -Rotavirus L OMS estime que 3 millions de décès sont dûs chaque année à la maladie diarrhéique. Les rotavirus sont la principale cause des diarrhées aiguës de l enfant dont la plupart ont moins de 10 ans. Ces virus sont responsables de 800.000 à 1 million de décès chaque année dans le monde : la majorité a moins de deux ans[3]. Par ailleurs ils constituent la première cause de gastro-entérites acquises en milieu hospitalier. Leur haute contagiosité est liée à leur grande résistance et à leur excrétion massive (10 8 particules virales/g de selles). Les rotavirus sont des virus non enveloppés de 70 nm de diamètre dont le génome est constitué de 11 segments d ARN double brin, chacun codant pour une protéine. Cette segmentation à l origine de réassortiments[4] entre souches virales est mise à profit pour l élaboration de souches vaccinales. Ces virus à symétrie icosaédrique sont constitués de protéines structurales organisées en trois couches concentriques : capside interne VP 2 (VP pour viral protein), capside intermédiaire VP 6 et externe VP 7 et VP 4. Le mode de classification actuel des rotavirus est basé sur les propriétés antigéniques majeures déterminées par les protéines de capside. Il existe ainsi sept sérogroupes(de A à G) qui se distinguent par les antigènes portés 220 Biologie & Santé vol. 3, n 1, 2003
par la protéine de la capside intermédiaire VP6[5]. Les deux protéines VP7 et VP4 déterminent respectivement les spécificités de type G (G pour glycosylated) et type P ( P pour protease cleaved) [6]. La plupart des souches virales à tropisme humain appartiennent au groupe A, bien que des souches des groupes B et C soient associées, de façon sporadique, à des infections humaines, notamment en Chine [3,4]. - Calicivirus humains Les calicivirus humains sont de petits virus à ARN monocaténaire positif de 27 à 35 nm de diamètre à symétrie icosaédrique, non enveloppés et reconnaissables en microscopie électronique [1]. Malgré la grande variabilité génétique de ces virus, la classification actuelle de ce groupe hétérogène repose sur des critères génétiques permettant de distinguer 2 genres (subdivisés chacun en 2 génogroupes): [7, 8] les genres "Norwalk-like virus" et "sapporo-like virus "correspondant selon leurs caractères morphologiques respectivement aux "Small Round Structured Viruses" (SRSV) et aux calicivirus "typiques" humains [9,10,11]. Les calicivirus sont très résistants, notamment aux concentrations habituelles de chlore utilisées pour le traitement de l eau potable (3.75 à 6.25 mg/l). Leur inactivation en cas de contami-nation nécessite une augmentation des doses de chlore à 10 mg /l. -Astrovirus Ces petits virus de 28 nm de diamètre, identifiés en 1975 par Madeley et Cosgrove, possèdent un ARN monocaténaire positif et sont reconnaissables en microscopie électronique grâce à leur morphologie en étoile à 5 ou 6 branches [1]. Leur multiplication sur des cellules en culture, notamment les Caco-2 a facilité leur caractérisation antigénique, contrairement aux calicivirus, permettant ainsi de différencier huit sérotypes, le sérotype 1 étant le plus fréquemment retrouvé ( 60 à 70%) [12]. Les astrovirus sont très résistants, en particulier au chloroforme, à de nombreux détergents et aux solvants des lipides. Leur infectiosité reste intacte pendant 6 à 10 ans lors de leur conservation aux basses températures (-70 c) [13]. -Adénovirus entériques Ces virus possèdent un ADN bicaténaire dans une capside icosaédrique de 252 capsomères, l ensemble ayant un diamètre de 70 à 90 nm. Les pentons portent une fibre terminée par une petite sphère à activité hémagglutinante (HA). L analyse de l homologie des séquences nucléotidiques permet de décrire 6 sous-genres (A à F) regroupant 42 sérotypes. Le rôle de ces virus dans l étiologie des gastroentérites a été l objet de controverses mais a été reconsidéré après l identification en microscopie électronique d adénovirus dits non cultivables ("fastidious") sur les lignées continues humaines comme, par exemple les cellules Hela. Classés dans le sous-groupe F des adénovirus et différenciés en deux sérotypes 40 et 41, ils sont associés à des gastroentérites infantiles et sont retrouvés selon les études dans 2 à 14 % des selles diarrhéiques contre 0.6 à 3.4 % dans les groupes témoins[2]. Depuis, ces adéno-virus ont pu être cultivés sur une lignée cellulaire particulière Graham-293. D autres virus sont considérés comme des agents étiologiques possibles.il s agit des : -Coronavirus Si les coronavirus doivent leur nom à leur morphologie particulière en "couronne", leur caractéristique majeure tient à la taille de leur génome. En effet, cette molécule d ARN a une taille remarquable, variant de 27 à 32 kb. Elle Biologie & Santé vol. 3, n 1, 2003 221
I. Lahlou Amine et al. constitue le plus grand ARN viral connu. Ces virus enveloppés sont grossièrement sphériques, avec un diamètre de 80 à 150 nm. Dans le modèle classique, la nucléocapside est de structure hélicoïdale, fait exceptionnel chez les virus à ARN de polarité positive. Les coronavirus sont classiquement divisés en trois groupes antigéniques distincts et les souches isolées chez l homme sont rattachées aux groupes antigéniques 1 et 2. Les coronavirus entériques humains (HECV) ou Coronavirus Like Particles (CVLP) sont très probablement à l origine de pathologies digestives chez l homme, bien qu aucune étude ne le démontre sans controverse. En effet, des particules apparentées aux coronavirus sont mises en évidence en microscopie électronique dans des selles de patients présentant ou non des troubles digestifs[14]. -Torovirus Les torovirus forment avec les coronavirus la famille des Coronaviridae, appartenant à l ordre des Nidovirales. Ils sont mis en évidence dans des selles diarrhéiques humaines en 1984 [6, 15] et constituent un groupe viral très pléïomorphe, regroupant des virus à ARN, enveloppés, isolés dans un contexte de diarrhées observées chez le mouton (virus Breda) ou chez le cheval (virus Berne), mais aussi dans des cas de gastroentérites de l enfant et de l adulte. - Picobirnavirus Ces virus (famille des Birnaviridae ) impliqués dans les diarrhées en 1988 sont des virus à ARN bicaténaire segmenté d un diamètre de 30 à 40 nm, dont la présence dans les selles de patients atteints de gastro-entérite a été rapportée, principalement chez les patients atteints de SIDA mais dont le rôle pathogène reste à préciser [6,7]. - Parechovirus 1 Ces petits virus (famille des Picornaviridae) nus de 24 à 30 nm de diamètre à ARN monocaténaire positif ont notamment été impliqués dans les gastroentérites infantiles [7]. Aspects cliniques et épidémiologiques: La majorité des virus des gastro-entérites infectent les entérocytes matures des villosités intestinales avec pour conséquence un syndrome de malabsorption. Après une période d incubation variant de quelques heures à plusieurs jours, ils sont à l origine d une diarrhée associée ou non à des vomissements, de la fièvre et des douleurs abdominales. Parfois, les vomissements sont les seuls symptômes notamment lors des infections à Norwalk Like Virus. Les gastro-entérites concernent toutes les tranches d âge mais elles sont plus sévères chez le jeune enfant (< 3 ans). Une hospitalisation est nécessaire dans les cas sévères s accompagnant de déshydratation. La durée des signes cliniques varie de quelques heures à plus d une semaine et la sévérité la plus importante est de façon globale observée avec les rotavirus[16]. Schématiquement sont à distinguer deux modes épidémiologiques:[1,6,7,17] - Les gastro-entérites survenant sur un mode endémique, avec dans les pays tempérés, une nette prédominance hivernale. Les agents étiologiques le plus souvent en cause sont les rotavirus, calicivirus, astrovirus et adénovirus 40 et 41[18]. La contamination est interhumaine par voie oro-fécale principalement, ou par aérosols provenant de vomissements. 222 Biologie & Santé vol. 3, n 1, 2003
- Les gastro-entérites survenant par épidémies localisées notamment dans les collectivités d enfants ou d adultes ont souvent à leur origine une source commune de contamination (eau, aliment, coquillage) avec dans ce cas, une transmission secondaire interhumaine permettant l extension de l infection. Les virus incriminés sont principalement les calicivirus du genre "Norwalk-like". La transmission est favorisée par la grande résistance de ces virus sur les surfaces et dans l environnement. Méthodes diagnostiques: La majorité des virus des gastroentérites sont de culture difficile. Les techniques immunologiques permettant la mise en évidence d antigènes et l amplification génique à la recherche de génome viral ont supplanté les techniques de microscopie et d immunoélectroscopie électronique initialement utilisées[19]. Les méthodes de sérodiagnostic (immunofluorescence, ELISA) n ont aucun intérêt diagnostique. Réservées à quelques laboratoires de recherche pour certains virus (astrovirus, calicivirus entériques), leur valeur rétrospective est utile pour des études épidémiologiques au sein d une population donnée mais aussi pour l étude de la réponse immunitaire. * Prélèvements Seul un prélèvement de selles est nécessaire. Il doit être effectué à la phase aiguë de la maladie et consiste à recueillir 2 à 3 g de selles dans un récipient stérile à fermeture hermétique. Le prélèvement peut être transmis au laboratoire à température ambiante et doit être conservé entre 2 à 6 C avant l examen. Pour un stockage prolongé, une congélation à une température de -20 C est nécessaire. *Diagnostic direct + Microscopie électronique C est la technique de référence. Son utilisation est limitée aux laboratoires spécialisés disposant de cet équipement. Elle nécessite un observateur averti et entraîné. Elle repose sur l observation de la morphologie caractéristique des particules virales par une coloration négative avec du phosphotungstate ( à 3%) à ph neutre. Elle demeure cependant une méthode peu sensible avec en effet, un seuil de détection de 10 6 particules /ml de selles. Il n est cependant pas rare d observer pour certains virus (rotavirus) des concentrations fécales suffisam-ment importantes ( 10 10 particules /ml de selles) autorisant son utilisation. L identification par immunomicroscopie électronique peut faciliter l observation d amas viraux et permet une caractérisation des antigènes viraux. + Isolement en culture Le classique isolement sur culture cellulaire est, pour ces virus, impossible ou trop délicat pour être appliqué à un diagnostic de routine [20]. Cependant, les adénovirus "entériques" (sérotypes 40 et 41) ne sont cultivables que sur des systèmes cellulaires spécifiques ( Graham 293) alors que les astrovirus, difficiles à cultiver peuvent être isolés sur cellules rénales embryonnaires humaines (HEK) ou sur cellules hétéroploïdes d adénocarcinome de côlon (CaCo-2). Les calicivirus et coronavirus ne cultivent pratiquement pas sur système cellulaire. Concernant les rotavirus, l adaptation en culture cellulaire (LLC-MK2, MA 104) de rares souches a été possible. Leur isolement au même titre que les virus Biologie & Santé vol. 3, n 1, 2003 223
I. Lahlou Amine et al. précédents ne saurait constituer une méthode de diagnostic en routine et reste du domaine de la recherche. + Recherche des antigènes viraux Les techniques recherchant les antigènes viraux, utilisent des anticorps monoclonaux ou polyclonaux et permettent une détection directe après leur extraction à partir des selles. -Techniques d agglutination au latex Les particules de latex sont sensibilisées par des anticorps spécifiques, un test témoin permettant de détecter des réactions non spécifiques. Ces tests offrent quelques avantages dont la simplicité, la rapidité d exécution, la réalisation de manière unitaire sans appareillage. Elles se prêtent par ailleurs à un dépistage d urgence. Les limites et inconvénients de ces tests sont:[2] une sensibilité inférieure à celle des tests immunoenzymatiques, les performances des tests variant en fonction des kits utilisés : elles sont satisfaisantes pour les "latex rotavirus" (sensibilité de l ordre de 85 %) et faibles pour les "latex adénovirus" (sensibilité de 35 à 85%). un manque de spécificité en raison de la possibilité d un résultat indéterminé lié à une agglutination non spécifique des billes de latex qui oblige à pratiquer une autre technique pour faire le diagnostic de l infection. l existence d un phénomène de zone, en présence d un excès d antigène générant ainsi des faux négatifs. Des latex "mixtes" adénovirus/rotavirus sont également proposés. - Méthodes immunoenzymatiques Il s agit de techniques immunoenzymatiques (enzyme-linked immunosorbent assay ou ELISA) utilisant différentes phases solides (cupules de polystyrène, billes, membrane) sensibilisées par des anticorps. La lecture est possible à l œil ou par spectrophotométrie. La sensibilité et la spécificité de ces tests sont excellentes. Il faut cependant noter qu il subsiste néanmoins des problèmes de sensibilité pour des concentrations virales en dessous du seuil de détection du kit utilisé ou lorsque les souches n appartiennent pas au type ou au groupe contre lequel est dirigé l anticorps servant à la détection. (cas des rotavirus non A). De nombreuses trousses sont commercialisées et utilisées dans le diagnostic de routine pour la recherche d antigènes de rotavirus du groupe A et adénovirus. La recherche d antigènes d astrovirus est également possible par ELISA avec des performances intéressantes en terme de sensibilité et de spécificité mais n est pas systématique pour le diagnostic de routine[21]. Les méthodes immunoenzymatiques de type ELISA appliquées à la détection des antigènes de calicivirus entériques sont pour l instant réservées à quelques laboratoires de recherche en raison de leur diversité antigénique. - Méthodes immunochromatographiques Des tests immunochromatographiques sur bandelettes permettant la détection des antigènes de rotavirus et adénovirus dans les selles sont commercialisés par quelques laboratoires (Diarlex R MB, Orion Diagnostica). Ils sont faciles d emploi, peu coûteux et permettent une réponse rapide (15 mn). Les performances de ces nouveaux tests 224 Biologie & Santé vol. 3, n 1, 2003
en termes de sensibilité (92 à 100%) et spécificité (99%) et leur excellente concordance avec la microscopie électronique (98%) en font des techniques de choix pour un diagnostic d urgence. + Recherche du génome viral Elle peut faire appel à l électrophorèse en gel de polyacrylamide, à l amplification génique par PCR (adénovirus) ou RT-PCR (rotavirus, astrovirus, calicivirus, coronavirus). - Electrophorèse en gel de polyacrylamide La technique d électrophorèse en gel de polyacrylamide est un bon moyen de mettre en évidence des génomes viraux dans les selles, mais elle est moins sensible que l amplification génique. Aisément réalisable, elle nécessite cependant un équipement rarement disponible dans un laboratoire ordinaire. Cette technique trouve notamment son application dans l analyse comparative de l ARN des différentes souches de rotavirus et ce, à des fins épidémiologiques: en effet, les 11 segments indépendants de l ARN bicaténaire constituant le génome des rotavirus peuvent être séparés en fonction de leur poids moléculaire sur un gel de polyacrylamide[20]. La répartition de ces segments définit "l électrophorétype" et permet grâce à celui-ci la caractérisation des souches. - Polymerase Chain Reaction La recherche du génome viral par RT-PCR pour les virus à ARN ou par PCR pour les virus à ADN est d utilisation récente. Outre le choix de la technique d extraction qui influence considérablement les résultats, des amorces, des conditions d amplification, du nombre de cycles et du système de révélation, un problème majeur tient à la nature du produit pathologique amplifié (selles), fréquemment inhibiteur de l amplification. Cet écueil technique accroît par conséquent le seuil de détection de l acide nucléique viral. En outre, l amplification doit être impérativement confirmée par hybridation ou séquençage du fragment génomique amplifié. Elle n est donc pas utilisée en pratique courante et demeure l apanage de rares laboratoires spécialisés pour la détection : [7,21,22,23] - des rotavirus, - des calicivirus pour lesquels les méthodes de biologie moléculaire sont les seules méthodes de diagnostic. La diversité génétique de ces virus nécessite de sélectionner des amorces permettant l amplification des différentes souches. Les nombreuses amorces décrites sont situées au niveau de la région codant pour l ARN polymérase. - des astrovirus : les amorces sont situées dans la région 3 non codante et les RT- PCR utilisées permettent le typage des astrovirus par séquençage d une partie de l ORF2. Ces techniques, non encore commercialisées, sont très sensibles et spécifiques mais encore relativement coûteuses. Leur intérêt réside dans la caractérisation moléculaire des souches détectées notamment pour rechercher l origine d une épidémie par comparaison avec les souches trouvées dans les aliments, l eau ou l environnement. * Diagnostic indirect Le sérodiagnostic a surtout un intérêt rétrospectif lors d études épidémiologiques afin de préciser la propagation du virus en cause, les populations cibles et les séroprévalences. Il peut servir à établir le lien de causalité d une symptomalogie à un virus déterminé par la mise en évidence sur une paire de sérums Biologie & Santé vol. 3, n 1, 2003 225
I. Lahlou Amine et al. prélevés à 15 jours d intervalle, d une séroconversion ou d une variation significative des titres en anticorps. La détection des anticorps de classe IgM est en faveur d une infection récente évolutive. Différentes techniques sont développées : immunofluorescence, inhibition d hémagglutination, fixation du complément, dosage d anticorps neutralisants et méthodes immunoenzymatiques de type ELISA. Des réactifs ELISA sont commercialisés pour les adénovirus. En revanche cette technique est réservée aux laboratoires de recherche pour la recherche des anticorps anti-astrovirus et anticalicivirus [2]. Conclusion Les virus représentent l étiologie la plus courante des diarrhées infectieuses aussi bien dans les pays riches que ceux en voie de développement. Leur étude a longtemps été limitée du fait de leur culture difficile, voire impossible pour certains. Les progrès les plus importants résultent du développement des techniques immunologiques. Même si les techniques de biologie moléculaire sont encore l apanage de laboratoires de recherche spécialisés, leur apport dans la caractérisation moléculaire, l épidémiologie, le diagnostic et le suivi des souches est considérable. Ces avancées techniques ne doivent, en aucun cas, occulter la nécessité de comprendre la signification physiopathologique de la présence de certains virus dans les selles. Par ailleurs, les étiologies mixtes (virales, bactériennes et parasitaires) ne sont pas rares. La création d un comité de lutte contre les infections virales nosocomiales au sein de nos hôpitaux et le lancement de programmes de recherche s avèrent indispensables car les défis sont multiples: déterminer la part sûrement sous-estimée qui incombe aux virus connus dans les gastro-entérites communautaires ou nosocomiales, tenter de mettre en évidence l étiologie encore inconnue des 25 à 50% des gastro-entérites infectieuses, envisager le développement de stratégies préventives vaccinales (différentes de l approche jennérienne modifiée) et curatives adaptées. Références 1- Kohli E, Bon F et Pothier P. Gastro-entérites virales: la place des calicivirus et astrovirus. In :Les diarrhées infectieuses. Paris. 43ème journée de l hôpital Claude Bernard, 2001 ; 80-85. 2- Denis F, Barrière E, Venot C, Ranger- Rogez S, Durepaire N, Martin C, Ploy M.C. Virus et infections gastrointestinales. Ann Biol Clin, 1997; 55: 275-87. 3- Gendrel D, Lorrot M, Marc E, Moulin F. Diarrhées à rotavirus de l enfant. In:Les diarrhées infectieuses. Paris. 43ème journée de l hôpital Claude Bernard, 2001; 1-9. 4- Pothier P, Kohli E, Fromentin C. Infections à rotavirus. mt pédiatrie, 1998; 1 : 31-36. 5- Petitpas I. Etude structurale de la protéine VP6 des rotavirus et de l inhibition de la transcription virale par des anticorps monoclonaux dirigés contre VP6. Méd Mal Infect, 1999 ; 29 : 573-80. 6- Kohli E, Bon F, Fromentin C et Pothier P. Gastroentérites virales. Spectra Biologie, 1999; 18: 27-30. 7- Kohli E, Bon F et Pothier P.Les principaux virus des gastro-entérites chez l homme. Bull Soc.Fr.Microbiol, 2001; 16, (2): 97-102. 8- Cubitt WD. Historical background and 226 Biologie & Santé vol. 3, n 1, 2003
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