24/11/09 RT : Suzanne Ferrier JC. Nicolas RL : Théo Kavakelis Mécanismes moléculaires de latence des Herpes viridae. Le modèle Epstein Barr Plan I. Historique II. Mécanismes du virus Epstein-Barr 1. Généralités 2. Pouvoir transformant du virus 3. Paradoxes 4. Latence virale, cycle lytique, réactivation III. Etudes ex vivo IV. Etudes in vivo 1. Infection primaire 2. EBV in vivo chez les porteurs sains EBV + 3. La réponse immunitaire 4. Equilibre danger-bénéfices 5. Processus oncogènes
I. Historique Le lymphome de Burkitt Dans les années 1950, un chirurgien du nom de Burkitt a observé en Afrique une certaine forme de cancer se développant dans des régions particulières du continent (sur le contour méditerranéen et une zone centrale appelée par la suite ceinture Burkitt). Il s agissait d un cancer touchant les enfants au niveau de la mâchoire, ainsi que quelques adultes. Burkitt envoie des prélèvements à des virologues. Les enfants ont toujours tout un tas de virus, c est normal. Les virologues ont donc comparé les prélèvements provenant des sujets présentant ces formes de lymphomes avec ceux provenant d enfants normaux. Ils étaient identiques. Burkitt envoie alors des prélèvements à M. Epstein et Mlle Barr (qui travaillaient ensemble) qui ont: - mis en culture ces prélèvements ; les lymphocytes poussaient très abondamment dans un milieu classique. Ce qui était surprenant à cette époque, car on ne savait pas étudier les lymphocytes. - 2e chose exceptionnelle qu a faite Epstein : regarder ces cellules se multiplier en microscopie électronique. Ils y ont vu un herpès. Se disant que c était peut-être un herpès simplex, ils ont mis les cellules en culture dans un milieu favorable à l herpès simplex, mais le virus ne poussait pas. Ils pensaient enfin avoir trouvé un virus causant le cancer chez l homme. Ils ont donc voulu mettre au point un test sérologique pour déterminer les individus qui ont des anticorps de ce virus, mieux les surveiller et les soigner ainsi que mettre en place des traitements préventifs. Burkitt s adresse alors au couple Henley, qui fabrique un test sérologique pour détecter des anticorps contre ce virus. En Afrique, 100% des individus avaient ces anticorps. En Europe, aux Etats-Unis, même chose ; 100% (enfin 98%). Ils se sont alors dit que le virus n avait pas un rôle essentiel dans le lymphome, mais plutôt un rôle de cofacteur. Voilà donc un virus présent chez pratiquement tous les individus, qui va persister chez tous les individus et qui est associé à un très petit nombre de cancers, de lymphomes dit de Burkitt. Mais quelle était la primo infection de ce virus? Lorsqu on étudiait un virus dans un laboratoire, il y avait un témoin négatif dont on prélevait tous les jours le sérum. Cette femme négative est partie 15 jours en vacances et quand elle est revenue, son sérum était positif. Elle avait eu une mononucléose infectieuse. Pour la première fois, on a fait l association du virus Epstein-Barr (EBV) avec la mononucléose infectieuse (MNI). On confirmera par la suite que c est bien l agent de la primo infection. On connaissait la MNI, on savait la diagnostiquer, on savait qu elle était associée à une importante réponse immunitaire de la part de l individu (observation de grands monocytes). Carcinome nasopharyngé Toujours à la même époque, en Asie du Sud-est, sur le pourtour Méditerranéen, en Californie (du fait de la migration des individus) et aussi au Groenland (on ne sait par contre toujours pas pourquoi) on met là aussi en évidence l association avec EBV ; ce qui montre 3 choses : - EBV est capable de faire se multiplier les lymphocytes comme des cellules transformées (à l époque on dit «immortalisées») lorsqu il les infecte - EBV est présent pendant toute la durée de la vie de l individu dans 98% des cas. Malgré la réponse immunitaire qu il provoque, il persiste dans le lymphocyte B. - Il est associé à deux proliférations malignes : dans le lymphome de Burkitt (côté lymphotrophe du virus) et dans le carcinome nasopharyngé (tropisme épithélial) On a cherché à déterminer les causes de cette répartition géographique du carcinome nasopharyngé associé à l EBV. Peut-être sont-ce des facteurs géographiques génétiques ou nutritionnels, mais on n a rien trouvé.
II. Mécanismes du virus Epstein-Barr 1. Généralités Comment supporte-t-on ce virus? On a tous eu une primo infection, tous eu un stade de prolifération. Dans la majorité des cas, nous sommes sortis vainqueurs de ce combat, car il y a eu une coévolution du virus avec l individu. Chacun y voit son intérêt. Le virus est repoussé dans un site latence et va persister pendant toute la vie de l individu. De temps en temps il peut ressortir et va infecter toute la population mondiale. La MNI est la maladie dite du baiser car EBV se retrouve dans la salive et est transmis par elle. Les échanges salivaires se font aussi très tôt dans l enfance, vers 7-8 ans ; la majorité des enfants ont des Ac contre ce virus. On dit qu il vaut mieux faire une primo infection plus tôt, que lorsqu on est adolescent. 2. Pouvoir transformant du virus Pour analyser ce pouvoir transformant, on a fabriqué des lignées de cellules lymphocytaires. Inconvénient : il n y avait pas de culture cellulaire classique pour multiplier EBV ; on pouvait prendre du retard par rapport à un virus qui poussait très bien comme l herpès. Mais sur culture de LB immortalisé on a pu distinguer 2 catégories différentes : cultures qui fabriquaient du virus, donc avec cycle lytique du virus cultures immortalisées qui ne fabriquaient pas de virus Ce qui nous a permis d avoir 2 modèles expérimentaux, un pour étudier la latence du virus, l autre pour étudier sa réactivation. Comme le virus ne se multipliait pas sur culture cellulaire, on a pu rapidement le séquencer. C est un des premiers herpès séquencés, ce qui a permis plus rapidement de comprendre ce qu étaient ce virus et sa latence. On a pris du sang de cordon ombilical (pour avoir des lymphocytes vierges de toute infection par EBV). On met ces lymphocytes en contact avec le virus. Il y a transformation de ces cellules, qui deviennent immortalisées, et qui contiennent le virus. C est la même chose dans notre organisme, quand a lieu le premier contact avec le virus, nos cellules se multiplient et deviennent immortelles et un système de défense nous permet de lutter (chez l immunocompétent). 3. Paradoxes Quand on met un LB vierge de toute infection en contact avec un virus oncogène à ARN chez les animaux (un adénovirus par exemple), on va transformer une cellule sur 100 000. Pour EBV, une cellule sur 2 sera transformée. Le virus Epstein Barr possède un des plus hauts pouvoir transformant parmi les virus des mammifères, alors qu il n est pratiquement jamais associé - chez l immunocompétent- à un processus prolifératif. La réplication de ce virus entraîne une réponse immunitaire cellulaire très puissante et violente (c est ce qui arrive lors de la MNI). Lors de la MNI, 50% des lymphocytes T (LT) cytotoxiques sont orientés contre les cellules infectées par EBV. Chez l individu immunocompétent, 1 à 2% des LT sont dirigés contre EBV. Les réactivations permanentes de ce virus sont bloquées par notre système immunitaire mais le virus ne sera jamais éliminé, car il a un système d adaptation à notre propre système qui est excellent.
4. Latence virale, cycle lytique, réactivation Il y a donc deux sortes de lignées cellulaires : les lignées non productrices : cellules transformées mais ne fabriquant pas le virus. Là, le virus utilise uniquement les gènes qui lui permettent de rester en latence et de faire multiplier la cellule. les lignées productrices : qui fabriquent le virus. Grace à des produits chimiques on peut passer d une lignée à l autre, ce qui nous permet d analyser la réactivation d EBV. Attention : tout ceci se passe in vitro, il n y a donc pas de réponse immunitaire. Le virus va se fixer sur le LB par le CD21 et induit la réplication cellulaire. Se met alors en place un programme de prolifération lymphoblastoïde, qui contient environ 10 gènes qui induisent la persistance virale et la multiplication des cellules transformées. De temps en temps, quelques cellules vont se réactiver, spontanément ou à cause d inducteurs et il y aura production de virus. Un autre programme dit de «réplication virale» va se mettre en place à son tour. Ces deux programmes sont bien distincts et induisent deux mécanismes différents. Seulement 5% des cellules infectées produisent du virus, il n y a jamais 100%. Certaines cellules n exprimeront que le programme de prolifération. Quels sont donc les mécanismes de régulation? Les protéines dans ce programme de prolifération sont : - EBNA : Epstein Barr Nuclear Antigene (on ne retiendra qu EBNA 1 qui est obligatoirement présente quand EBV est dans la cellule immortalisée). Rôle d EBNA1 : Le virus persiste dans le noyau de la cellule transformée sous forme d épisome, non intégré. Quand le virus se réveille, EBNA1 va intervenir pour permettre la réplication du virus. - LMP : Protéines transformantes, il y en a 3. - Eber (au nombre de 2) : petits ARNs non codants, abondamment présents dans toutes les cellules transformées par EBV. Eber sera la cible d un ARN, il va pouvoir être détecté par hybridation in situ avec une sonde EBV radioactive froide. III. Etude ex vivo : les tumeurs Quand Burkitt a fait ces lignées, il a regardé ce qu elles exprimaient comme protéines de latence. EBNA1, Eber 1 et 2 sont toujours là. Dans la lignée de Burkitt (la lignée issue du lymphome), seulement ces deux gènes s expriment, on parle de latence 1. Mais quand on obtient une lignée à partir d un LB normal, tous les gènes s expriment. On parle de latence 3. Si on prend du sang de n importe quel individu EBV positif et qu on lave les LB naïfs, quand on les met en culture on observe une réactivation du virus et une prolifération des cellules, contrôlées in vivo par le système immunitaire, mais pas quand elles sont en culture. Lymphome de l immunodéprimé : latence 3 L expression des protéines de latence chez nous est réprimée, mais dès qu un problème comme l immunodépression surgit, notre système ne contrôle plus ces cellules qui vont s exprimer sous forme de lymphome et vont proliférer avec une latence 3. Certaines maladies comme la maladie de Hodgkin peuvent arriver à la suite d une MNI. On retrouve ces cellules très caractéristiques de la maladie de Hodgkin, les cellules de Sternberg dans la MNI. On a vu que le carcinome nasopharyngé, le lymphome T et la maladie de Hodgkin ont une autre forme de latence qui exprime EBNA1, LMP et Eber. C est la latence 2.
Que se passe-t-il chez nous, immunocompétents, quand dans la majorité des cas alors que nous sommes porteurs du virus, il ne se passe rien? Il a été difficile d y répondre car nous avons très peu de virus et il est en permanence réprimé. Il fallait des techniques de PCR extrêmement sensibles pour aller rechercher les virus chez les individus, ainsi que de PCR reverse pour savoir quel type de protéine sera secrété chez les individus EBV+ dans les LB circulants latents. On voulait aussi savoir quel type de cellule hébergeait le virus ; toutes ces techniques ne sont mises en place qu à partir des années 95. IV. Etudes in vivo 1. Infection primaire Tout d abord in n y a pas de réaction immunitaire car l organisme est vierge de tout contact avec ce virus. Le virus va donc infecter la cellule qui mettra en place un programme de prolifération cellulaire et d activation du cycle lytique. Ce phénomène est restreint aux organes lymphoïdes secondaires et aux amygdales. Puis le virus va envahir l organisme, les lymphocytes vont évoluer vers des lymphocytes B mémoires (quiescents) circulants. Se met alors en place un nouveau programme ; le programme de latence. Il n y a donc aucune expression protéique. Le virus est à l abri de toute réaction immunitaire. (Certains lymphocytes seront éliminés car présentent antigènes.) 2. EBV in vivo chez les porteurs sains EBV + Le nombre de cellules mémoires EBV+ chez l immunodéprimé est 50 fois supérieur au nombre de LB mémoires de l immunocompétent. Les cellules B mémoire sont des cellules qui normalement ne se multiplient pas. Chez le sujet EBV+ immunocompétent, le programme de latence est là et de temps en temps au niveau des amygdales plus particulièrement (un peu dans les organes lymphoïdes secondaires), le virus va se réactiver, va ressortir dans la salive et être transmis au voisin. Des auteurs anglais ont regardé le rythme de ces réactivations, on s est alors aperçu qu on excrétait du virus en permanence et qu il y a en permanence une petite réponse immunitaire qui bloque réactivation. Constat : Que ce soit après ou durant la primo-infection (clinique ou inapparente) ou chez les immunodéprimés, le programme de prolifération ne s exprime pas au niveau du sang circulant où les cellules infectées restent dans un état quiescent, mais seulement dans les organes lymphoïdes secondaires. 3. La réponse immunitaire Centre germinatif : C est une structure contenant des LB matures naïfs (qui n ont pas rencontré d antigène et qui seront infectés par EBV). Il va y avoir une évolution dans ce centre germinatif avec une série de cellules où se fait la réponse humorale B(plasmocytes, cellule mémoire ). On repère très bien ces centres dans les OLS et les amygdales.
Rappel d immuno : Stimulation par un Ag dans le cadre de la réponse immune humorale : Le lymphocyte B naïf deviendra lymphoblaste activé qui se différencie soit en plasmocyte (qui fabrique les anticorps), soit en cellule B mémoire quiescente qui ne se multiplie pas, sauf de temps en temps (un peu comme une cure de rajeunissement). Pour l EBV, le circuit est le même : Le LB naïf développe un programme de prolifération, se différencie en blaste. Mais le programme par défaut pousse la différenciation vers le LB mémoire. Les gènes viraux EBV procurent les signaux requis pour la transition des cellules B naïves vers les LB mémoires. Il ya également un programme de latence. On a de temps en temps la différenciation des LB en plasmocytes avec le cycle lytique. Il y aura donc excrétion du virus dans la salive. La «cure de rajeunissement» dépend d EBNA1 : c est le programme EBNA1 seul. Ainsi EBV est conservé à l intérieur de ces cellules. On retrouve le programme par défaut dans les cellules caractéristiques de la maladie de Hodgkin, le carcinome nasopharyngé. Remarque : On a fait le système à l envers : on a commencé par regarder ce qu il y avait dans le lymphome de Hodgkin, le lymphome de l immunodéprimé, etc, et on s est aperçus que toutes ces situations qu on croyait pathologiques ne sont que des situations réelles qu on retrouve chez l individu normal. Le génie du virus c est d utiliser le système immunitaire classique et de pousser la cellule à suivre ce système pour pouvoir se mettre à l abri dans un épisome où il ne se multiplie pas. C est un mécanisme commun aux herpès : la latence se retrouve dans des zones où les cellules ne se multiplient pas trop. Détaillons ces programmes de transcription utilisés par EBV pour établir et maintenir l infection : dans le LB naïf, EBV met en place le programme de prolifération. On aura EBNA1 et LMP exprimés. La cellule est activée.
dans les cellules du centre germinatif on aura le programme par défaut et différenciation vers les cellules mémoires. dans les cellules périphériques c est le programme de latence qui permet l arrêt des transcriptions/traductions virales. pour la cure de rajeunissement : expression unique d EBNA1 qui permet la division de l ADN viral en latence. Division des cellules B mémoires EBV+ non liées à L EBV mais à un mécanisme normal de pérennisation des cellules mémoires. EBNA1 est le garant de la duplication du génome de l EBV lors de la division cellulaire dans les cellules plasmatiques on voit le programme lytique avec tous les gènes lytiques qui permettront au virus de se répliquer. De plus, la réponse immunitaire ne peut se faire que contre des cellules qui expriment des protéines. Or EBNA1 n est pas reconnue par le système immunitaire. C est ce qu on appelle le phénomène d échappement. 4. Equilibre danger-bénéfices Entre les stades B naïf et B activé : Danger pour le virus et l hôte car l hôte risque de développer une néoplasie fatale qui va limiter le temps de diffusion du virus vers de nouveaux hôtes. Entre les stades B activé et B mémoire : Bénéfice pour le virus et l hôte. Le virus a la capacité de limiter le temps de prolifération des lymphoblastes en les dirigeant vers le statut de cellules quiescentes qui caractérisent les B mémoires. Et le Virus persiste. 5. Processus oncogènes L évènement bloquant à l origine de ces cancers pourrait être une mutation au niveau du gène cellulaire en raison de la forte perturbation immunologique associée au cycle biologique du virus dans le centre germinatif. Dans la maladie de Hodgkin, un évènement bloquant pourrait survenir quand une cellule infectée se trouve engagée dans le programme «par défaut» Dans ce cas, les cellules vont exprimer le programme par défaut. La maladie de Hodgkin est une prolifération cellulaire où les cellules sont en latence 2. Dans le lymphome de Burkitt, l évènement bloquant pourrait survenir dans le compartiment des cellules mémoires à un stade de prolifération concomitant avec l activation de l oncogène c- myc. Dans ce cas, les cellules vont exprimer EBNA1. Paradoxalement on en vient à se demander si EBV a réellement un rôle dans le lymphome de Burkitt et si c-myc n est pas l unique responsable. Dans le lymphome de l immunodéprimé, des cellules B autres que les cellules naïves peuvent être infectées par l EBV (Bystander B Cell). Elles vont exprimer le programme de prolifération, qui se prolongera sans différentiation et continuera à produire du virus sans possibilité de différentiation, mais ces cellules seront détruites par la réponse cytotoxique chez les immunocompétents.