Cancer du pénis : étude de la ploïdie par cytométrie de flux chez 90 patients

ARTICLE ORIGINAL Progrès en Urologie (2000), 10, 72-77 Cancer du pénis : étude de la ploïdie par cytométrie de flux chez 90 patients Antonio Augusto ORNELLAS, Mercia MENDES CAMPOS, Maria Helena ORNELLAS, Aristoleles WISNESCKY, Nelson KOIFMAN, Ramza CABRAL HARAB Instituto Nacional de cancer, Rio de Janeiro, Brésil RESUME Buts : Faire une étude prospective de la ploïdie des tumeurs du pénis par cytométrie de flux et comparer les résultats de la cytométrie de flux au stade clinique et anatomopathologique des tumeurs afin de déterminer si la ploïdie est un facteur de risque indépendant de métastase ganglionnaire. Patients et Méthodes : Nous avons analysé le contenu en ADN des cancers du pénis à partir de biopsies obtenues chez 80 patients porteurs d un carcinome épidermoïde de verge et chez 10 patients porteurs d un carcinome verruqueux. Les prélèvement ont été étudié par cytométrie de flux (système FACS scan, logiciel CellFIT). Résultats : Tous les prélèvements effectués sur les carcinomes verruqueux étaient diploïdes. Le pourcentage d aneuploïdie des tumeurs du pénis a été fonction du degré de différentiation tumorale : 5,5% (1/18) pour les tumeurs bien différenciées, 28,8% (17/59) pour les tumeurs moyennement différenciées, et 66,6% (2/3) pour les tumeurs indifférenciées. Conclusion : La ploïdie des tumeurs épidermoïdes du pénis est proportionnelle au degré de différentiation tumorale. L'aneuploïdie semble être un facteur de risque de dissémination métastatique. Mots clés : Pénis, carcinome, tumeur épidermoïde, cytométrie de flux, tumeur verruqueuse. L étude des tumeurs par cytométrie de flux est utilisée pour déterminer le risque de dissémination métastatique. Plusieurs études ont d ors et déjà démontré l intérêt de cette technique pour les tumeurs du colon [13], du sein [7], du poumon [18], de l œsophage [22] et de l estomac [20]. La valeur pronostique de la ploïdie a été étudiées à plusieurs reprises. Il semble que l aneuploïdie soit un facteur de mauvais pronostic pour la plupart des tumeurs [3, 8, 9, 16, 17], bien que ceci n ait pas été confirmé par toutes les études certaines ayant apporté des résultats contradictoires [12]. Le cancer épidermoïde du pénis est une tumeur rare pour laquelle il n existe pratiquement pas de données concernant l évaluation par cytométrie de flux [4, 5, 6, 21]. Le but de cette étude était d étudier le contenu en ADN d une série de 90 tumeurs épidermoïdes du pénis et d étudier la valeur pronostique de la ploidie pour ce type tumoral. PATIENTS ET METHODES 90 patients porteurs d une tumeur du pénis ont été opérés consécuti vement dans notre institution ent re décembre 1994 et Décembre 1998. L analyse histologique définitive a conclu dans 80 cas à ces tumeurs épidermoïdes et dans 10 cas à des carcinomes verruqueux. 52 des 80 patients porteurs d un cancer épidermoïdes ont eu un curage lymphonodal inguinal. Les 28 autres patients ont soit refusé le curage (7/28) soit présentaient une contre indication d ordre général (21/28) : patient âgé de plus de 75 ans (7), cancer localement avancé (5), risque thromboembolique (3), pathologie psychiatrique associée (2), accident vascu- Manuscrit reçu : juin 1999, accepté : novembre 1999. Adresse pour correspondance : Dr. A.A. Ornellas, Instituto Nacional de cancer, Praça da Cruz Vermelha 23, Rio de Janeiro, Brazil. 72

laire cérébral (1), insuffisance rénale chronique en hémodialyse (1), insuffisance cardiaque (1), obésité pathologique (1). Dans la mesure où il n existe pas de système de gradation spécifique pour l évaluation du degré de différentiation tumorale pour les tumeurs épidermoïdes du pénis, nous avons décidé par convention d utiliser le score de Broders qui a été développé pour les carcinomes épidermoïdes de la peau. Les patients ont été répartis en trois groupes en fonction du degré de différentiation tumoral. Par ailleurs les patients ont été classés en utilisant la classification TNM de 1978. Le contenu en ADN a été mesuré sur des prélèvements non fixés. La durée moyenne de suivi des patients a été de 13 mois avec des extrêmes allant de 1 à 43 mois. L étude statistique a été réalisée en utilisant le test du Chi 2 ainsi que le test de Mantel-Haenszel. Par ailleurs les courbes de survie actuarielles ont été réalisé selon la technique de Kaplan Meier, les groupes étant comparés par le test du log rank. Le différences ont été considérés statistiquement significatives lorsque le p était inférieur à 0,05. Préparation des échantillons Les prélèvements tissulaires ont été coupés en bandes de 1mm puis soumis à une dégradation enzymatique réalisée à l aide de la trypsine concentrée à 0,25% (Sigma T8253) et broyés pendant 30 minutes à 37 c (Mixeur Vortex). Technique de coloration La coloration des broyats a été réalisée en ajoutant à 10 6 cellules extraites de la préparation pendant 15 minutes à température ambiante 500 microlitres de la solution A (Propidium iodide à 50 microgrammes/ml, Tampon citrate 4 mm, et triton X 100, 0,3% v/v). Après cette première incubation, les préparations ont incubé pendant 15 minutes à 37 c avec la solution B (Ribonuclease A 100 microgrammes /ml dans un tampon citrate à 40 mm) et ce immédiatement avant l analyse par le cytomètre de flux. Technique de cytométrie de flux Les différents prélèvements ont été analysés par cytomètre de flux FACS scan (Becton-Dickinson Immunocytometry systems) équipé d un module de reconnaissance et d un logiciel pour l acquisition et le traitement des données (logiciel CellFIT). Le FACS scan utilise un rayon laser Argon de 488nn. 10000 mesures ont été effectuées sur chaque échantillon pour la mesure du contenu en ADN. L analyse de la ploidie a été effectuée à partir de la surface et de la largeur des pics obtenus. Les prélèvements ont ainsi été classées en fonction de leur index ADN (DI) : hypodiploïde (DI< 1,0), diploïde (DI compris entre 1,0 et 1,10), hyperdiploïde (DI compris entre 1,10 et 1,85), tétraploïde (DI compris entre 1,85 et 2,15), et hypertétraploïde (DI > 2,15) L index de prolifération tumorale a été défini par la pourcentage de cellules en phase S. RESULTATS Tous les prélèvements effectués sur les carcinomes verruqueux ont été diploïdes. Concernant les carcinomes épidermoïdes le taux d'aneuploïdie a été de 5,5% (1/18) pour les tumeurs bien diff é r e n t i é e s, 28,8% (17/59) pour les tumeurs moyennement diff é- renti ées et 66,6% (2/3) pour les tumeurs faiblement d i fférentiées. La Figure 1 il lustre un exemple d histogramme diploïde. Parmi les histogrammes de type aneuploïde, 12 étaient des hyperdiploïdie, 4 des tétraploïdies, 1 une hypertétraploïdie et 2 une hypodiploïdie. L index d ADN moyen des prélèvements aneuploïdes était de 1,46. Les Figures 2 et 3 illustrent des exemples d hist ogrammes hyperdiploïdes et tétraploïdes. Le taux d aneuploïdie a ét é de 0% (0/5) pour les tumeurs de stade T1, 28% (7/28) pour les tumeurs de stade T2, 37% (9/24) pour les tumeurs de stade T3 et 23% (4/17) pour les tumeurs de stade T4. Par ailleurs, le taux d aneuploïdie a été de 20% (6/30) pour les tumeurs de stade N0, 25% (2/8) pour les tumeurs de stade N1, 30% (8/26) pour les tumeurs de stade N2 et 30% (4/13) pour les tumeurs de stade N3. 52 patients ont eu un curage inguinal. Le taux d envahissement lymphonodal parmi les patients dont la tumeur primitive était aneuploïde a été de 66% (8/12) contre 47% (19/40) pour les patients dont la tumeur primitive était diploïde. Tous les patients dont qui avaient un index d ADN augmenté (n=4, 1,96 ; 2,12 ; 2,14 ; et 2,18) avaient un envahissement lymphonodal inguinal prouvé histologiquement. L index de prolifération (nombre de cellules en phase S) était en moyenne de 6,21% (extrêmes : 0,7 32,5%) pour les tumeurs diploïdes contre 22,7% (extrêmes : 2,7 84,2%) pour les tumeurs aneuploïdes. En revanche nous n avons pas trouvé de corrélation entre l index de prolifération et le stade pathologique. Le taux de survie actuarielle des patients porteurs diploïdes a été supérieur au taux de survie des patients porteurs de tumeurs aneuploïdes mais sans que le seuil de significativité soit atteint (Figure 4). Notre étude n a pas permis de démontrer une valeur pronostique à la ploïdie cellulaire pour les tumeurs épidermoïdes du pénis. 73

Figure 1. Résultat de la cytométrie de flux pour les tumeurs diploïdes. Figure 2. Résultat de la cytométrie de flux pour les tumeurs hyperdiploïdes (index en ADN : 1,15). 74

Figure 3. Résultats de la cytométrie de flux pour les tumeurs tétraploïdes (Index en ADN 2,18). Figure 4. Taux de survie actuarielle pour les patients porteurs de tumeurs diploïdes (60) et pour les patients porteurs de tumeurs aneuploïdes (20) (courbe Kaplan-Meier, p=0,44, non significatif, test du log rank. DISCUSSION Dans notre étude le taux d'aneuploïdie des tumeurs épidermoïdes du pénis a été de 25%. Ce résultat est conforme aux données publiées par GUSTAFFSON [4], YU [21] et HALL [5] qui avaient trouvé une aneuploïdie chez environ 30% de leurs patients. Parmi les 52 patients qui ont eu un curage lymphonodal inguinal, 66% des tumeurs aneuploïdes (8/12) avaient un envahissement lymphonodal contre seulement 47% pour les tumeurs diploïdes (19/60) bien que cette différence ne soit pas statistiquement significative (p=0,248). Tous les carcinomes verruqueux de notre série étaient diploïdes, ces données étant conformes à celle précédemment publiées par MASIH [10]. Les carcinomes verruqueux du pénis représentent par ailleurs une entité histologique particulière qui, dans notre expérience, ne donne pas d atteinte lymphonodale [19]. La plupart des tumeurs du pénis sont des tumeurs de bas grade [10]. Dans notre série, nous avons observé essentiellement des carcinomes épidermoïdes bien ou moyennement différenciés. Il existe une corrélation entre le pronostic en terme de survie et le degré de différentiation tumoral, les tumeurs indifférentiées ayant une survie moins longue et ce quel que soit le traitement proposé [14]. Cependant, fort heureusement ce type tumoral est rare et n a représenté que 4,3% de l ensemble des tumeurs de verge dans notre série [15]. Selon GUSTAFSSON [4] il existe une prédominance de tumeurs diploïdes parmi les tumeurs de bas grade tandis que les tumeurs aneuploïdes sont plutôt des tumeurs de haut grade habituellement [4]. Dans notre étude nous avons trouvé une corrélation entre la ploidie cellulaire et le degré de différentiation cellulaire. Les résultats prélimi naires semblent indiquer que les tumeurs qui ont un index en ADN élevé auraient un risque de dissémination métastatique plus élevé. Ainsi nous avons observé que les tumeurs aneuploïdes avaient un nombre de cellules en phase S plus élevé 75

que les tumeurs diploïdes, suggérant qu il existerait une corrélation indirecte entre la ploïdie cellulaire et l index de proliférat ion cellulaire. Cependant, selon HOOFNAGLE [6] il n existerait pas de corrélation entre l index de prolifération cellulaire et le stade TNM lors de la découverte de la maladie. Enfin, bien que le taux de survie à 3 ans soit supérieur pour les patients avec une tumeur diploïde par rapport aux tumeurs aneuploïdes, cette différence n est pas statistiquement significative. CONCLUSION 1. Il existe une corrélation entre ploidie et degré de différentiation pour les tumeurs épidermoïdes du pénis. 2. Tous les carcinomes verruqueux sont diploïdes, ces tumeurs ne donnant par ailleurs pas d envahissement lymphonodal. 3. Les tumeurs à index en ADN élevé semblent avoir un risque métastatique plus important. A rticle traduit par François Haab, Service d Uro l o g i e, Hôpital Tenon, Paris. REFERENCES 1. ATKIN N.B., RAY R. 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SUMMARY Flow cytometric analysis of DNA cellular content in 90 consecutive cases of squamous cell carcinoma of penis. Objective : To evaluate prospectively 90 consecutive cases of squamous cell carcinoma of penis, referred to our Institute, by flow cytometry analysis of cellular DNA content. To compare deoxyribonucleic acid (DNA) flow cytometry with clinical and pathological variables to determine the prognostic significance of this analysis to guide the selecion of patients at high risk for development of lymph node metastases. Patients and Methods : We determined the nuclear DNA of tis - sues in fresh biopsy specimens of 80 patients diagnosed histolo - gically as invasive squamous cell penile carcinoma and in fresh biopsy specimens of 10 patients with verrucous carcinoma of penis. Samples were analyzed with a FACScan flow cytometer, equipped with a doublet discrimination module, using the CellFIT software package for data acquisition and analysis. Results : The DNA pattern was diploid in all samples excised from patients with verrucous carcinoma. According to histologi - cal type the frequency of aneuploidy was 5.5% (1 of 18) in well differentiated carcinoma, 28.8% (17 of 59) in moderately diffe - rentiated carcinoma and 66.6% (2 of 3) in poorly differentiated carcinoma. Conclusion : The frequency of DNA aneuploidy showed correla - tion with histological type of invasive squamous cell carcinoma of the penis. Preliminary analysis suggests that patients with high DNA index may be at increased risk of metastatic involve - ment. Key words : Penile neoplasm, carcinoma, squamous cell, DNA flow cytometry, verrucous tumour. 77