Albinisme oculo-cutané : un peu de chemin parcouru ensemble. Benoît Arveiler Laboratoire de Génétique Moléculaire, Service de Génétique Médicale CHU de Bordeaux Laboratoire Maladies Rares: Génétique et Métabolisme (EA4576) Université Bordeaux Segalen Assemblée Générale Genespoir 15-17 mars 2013
Tout a commencé en 1998 : patient avec AOC associé à une leucodystrophie. mutation de TYR et d une grande délétion de toute la région 11q14.1. TYR, puis OCA2, puis TYRP1, puis SLC45A4, puis OA1, puis HPS1. Recherche de mutations ponctuelles : changement d une lettre Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 ** * *** * * *** *** ** *** Recherche de remaniements génomiques : environ 10% des mutations Exon 1 Exon 4 Exon 5 X X Chaque patient a deux mutations différentes
Délétion Hétérozygote des exons 2 à 20 d OCA2 F9 DSCR1 Peak height Exons Exons Th 030857 DSCR1 Fc IX Exon2 Exon3 Exon7 Exon10 Exon15 Exon20 Exon24 Exon25 DSCR1 5074 1891-0,92 2,76 2,11 2,19 1,60 1,94 1,94 1,02 0,96 Fc IX 2556 1034 1,09-3,00 2,29 2,38 1,74 2,11 2,10 1,11 1,05 Exon2 4907 662 0,36 0,33-0,76 0,79 0,58 0,70 0,70 0,37 0,35 Exon3 7001 1238 0,47 0,44 1,31-1,04 0,76 0,92 0,92 0,48 0,46 Exon7 6015 1022 0,46 0,42 1,26 0,96-0,73 0,89 0,88 0,46 0,44 Exon10 4763 1108 0,62 0,58 1,72 1,32 1,37-1,21 1,21 0,64 0,60 Exon15 4083 783 0,51 0,47 1,42 1,08 1,13 0,82-1,00 0,52 0,50 Exon20 5553 1069 0,52 0,48 1,43 1,09 1,13 0,83 1,00-0,53 0,50 Exon24 5005 1829 0,98 0,90 2,71 2,07 2,15 1,57 1,91 1,90-0,95 Exon25 6373 2462 1,04 0,95 2,86 2,18 2,27 1,66 2,01 2,01 1,06 -
15q11-q12 Délétion OCA2/Angelman 5 Mb
OCA2 délétion «polonaise» duplication TYR SLC45A2 Exon2 (8 kb) Exon3-5 (340 kb) (145kb)
D15S1007 D15S1048 D15S815 D15S1019 OCA-I2 OCA-I17 OCA-I20 OCA-I22 OCA-I24 D15S217 D15S156 D15S219 D15S1002 D15S986 080107 178 222 96 224 235 156 185 155 158 161 232 177 101 183 180 216 116 210 235 150 201 155 164 177 234 167 116 193 080816 178 222 120 210 231 del del 155 148 189 221 167 114 193 174 210 116 210 231 del del 155 148 189 221 167 114 183 070606 162 220 116 210 231 del del 155 148 189 221 167 113 181 180 220 120 215 235 160 200 155 162 185 235 177 115 183 090657 178 218 116 210 231 del del 155 148 189 221 169 101 178 182 224 116 210 235 150 185 155 144 189 234 167 113 183 030857 181 200 116 217 del del 185 / 145 189 220 175 101 183 183 228 112 210 233 156 203 / 145 161 234 169 112 179 délétion polonaise del dup Rooryck et al, 2011, Hum Genet
102007 101227 101225 101226 Réarrangement complexe d OCA2 chez deux patients non apparentés
Nombre d analyses réalisées par an : 2003-2012 300 250 200 150 100 50 0 2002 2004 2006 2008 2010 2012 2014
BILAN MUTATIONS 399 PATIENTS OCA1, OCA2, OCA3, OCA4, OA1, HPS1 6% SLC45A2-1 Mut; 1; 0% TYRP1-1 Mut; 1; 0% OCA2-1 Mut; 17; 4% TYR - 1 Mut; 7; 2% OA1-1 Mut; 26; 6% HPS1-2 Mut; 5; 1% SLC45A2-2 Mut; 45; 11% TYRP1-2 Mut; 7; 2% Pas de mutation; 52; 13% OCA2-2 Mut; 98; 25% TYR - 2 Mutations; 94; 24% TYR - 1 Mut + R402Q; 46; 12%
19% des patients restent sans diagnostic pourquoi? 1) Les mutations se cachent dans des régions non explorées des gènes: Exon 1 Exon 3 Exon 4 Exon 2 Exon 5 // // // // 2) Les patients n ont pas un AOC pur, mais une forme syndromique. 3) D autres gènes sont à découvrir: Gènes candidats Cartographie d homozygotie chez 9 patients Exome séquencé chez 5 patients; 6 autres à venir
«Les mutations se cachent dans des régions non explorées des gènes.» Moyen : séquençage de l intégralité des gènes TYR, OCA2, TYRP1, SLC45A2 = exons + introns + régions régulatrices LCR enh CAAT TATA introns LCR // // // 10-100 kb 1-10 kb -70b -40b promoteur Région adjacente 5 régulatrice 5 UTR exons 3 UTR TYR: 157 889 OCA2: 384 437 TYRP1: 56 882 SLC45A2: 80 060 TOTAL : 679 268 pb Impossible à faire avec techniques de séquençage classique Fait par NGS sur 16 patients porteurs d une seule mutation (octobre 2012) (Integragen, Evry) Rien de particulier pour l instant Analyse toujours en cours
«D autres gènes sont à découvrir : Gènes candidats» Gènes candidats impliqués dans la pigmentation : AP3B1 (HPS2), ASIP, BLOC1S3 (HPS8), CNO, CYP1A2, CYP2C8, CYP4B1, DCT, DTNBP1 (HPS7), EDN3 (ET3) (WS4), EDNRB (WS4), ERCC1, ERCC2, ERCC3, ERCC4, ERCC5, ERCC6, ERCC8, EXOC2, Gαi3, GNAS, GPR143, HPS1, HPS3, HPS4, HPS5, HPS6, IRF4/SEC5L1, KIF26A, KIT, KITLG, LYST, MC1R, MITF, MLPH, MYO5A (GS1,3), MYO7A (USH1B), OBSCN, OCA2, PAX3 (WS1,3), PLDN (HPS9), PRKAR1A, RAB27A (GS2), SILV, SLC24A4, SLC24A5, SLC45A2, SOX10 (WS4), TPCN2, TP53, TYR, TRP1, UBE3A, 6p25.3, 15q26,17q25.3, 21q22.13,
«D autres gènes sont à découvrir» Cartographie d homozygotie Principe : chez des patients issus d union consanguine, le gène et la région qui l entoure se retrouvent à l état homozygote. x x x x x x x
Cartographie d homozygotie Identifier à travers le génome des régions homozygotes, dans lesquelles on recherche des gènes candidats porteurs de mutations homozygotes. Moyen: analyser 500 000 marqueurs; collaboration Pr. JL Mandel (Strasbourg). Recherche ciblée sur régions candidates: gènes d albinisme, de pigmentation Recherche sans a priori : - y a-t-il des régions communes à plusieurs patients? - regarder dans chaque région si des gènes font figure de candidat Homozygotie au locus HPS1 chez 2 patients Identification d une mutation homozygote chez un patient turque : c.972delc/p.met325trpfsx6.
Chez deux patients : Gène CNO Homologue de la Protéine cappuccino de souris Rôle dans la biogenèse d organelles associées avec les mélanosomes, granules denses des plaquettes, les lysosomes. Rôle possible dans le trafic de vésicules intracellulaires. Souris cno-/-: modèle de Syndrome d Hermansky-Pudlak. Pas de mutation trouvée après séquençage de CNO.
Chez trois patients : Petite région en 15q14, faiblement positive, contenant SLC24A5. SLC24A5 Pas de mutation trouvée après séquençage de SLC24A5. sauvage Golden
«D autres gènes sont à découvrir» Séquençage d exome Génome Humain : 25000 gènes environ 180,000 exons 1% du génome 85% des mutations responsables de maladies sont situées dans les régions codant pour des protéines. Stratégie très efficace et éprouvée pour identifier de nouveaux gènes de maladies. Analyse de 6 patients «sans mutation» (Integragen, Evry). Près de 50 000 variants par patient! Application d une série de «filtres» pour rechercher des variants potentiellement pathogènes.
EXOME PATIENT ALBINISME - Illumina HiSeq2000 (180000 exons; 50 Mb) Chr Nb SNPs Profo ndeur (moye nne) HZ HTZ Référ encés (dbsn p) Nouv eaux (no dbsnp ) 3'UTR 5'UTR Coda nts Nouv eaux Coda nts Nonsens Fauxsens Silenc ieux Intron En dehors des gènes 1 4777 77 1794 2983 4552 225 276 329 2190 92 10 1092 1088 2083 257 4 2 3344 77 1224 2120 3232 112 186 212 1352 42 0 630 722 1530 327 7 3 2518 83 898 1620 2448 70 127 200 1120 42 4 524 592 1193 147 11 4 1897 83 788 1109 1806 91 83 103 812 36 2 367 443 859 152 6 5 2009 80 692 1317 1939 70 95 121 905 22 3 425 477 966 85 3 6 2474 81 787 1687 2413 61 151 159 1085 27 4 534 547 1112 101 1 7 2401 81 870 1531 2273 128 183 182 903 47 4 427 472 997 319 25 8 1593 76 640 953 1502 91 82 137 678 29 2 341 335 696 96 6 9 2009 69 803 1206 1903 106 111 126 787 40 2 353 432 915 185 2 10 2050 72 754 1296 1973 77 134 135 796 30 1 373 422 1006 161 15 11 3113 80 1368 1745 3018 95 173 173 1500 49 11 746 743 1186 314 7 12 2435 79 989 1446 2358 77 146 147 1016 42 3 451 562 1127 179 6 13 920 75 352 568 890 30 66 53 322 6 3 126 193 448 94 0 14 1571 83 692 879 1513 58 67 95 642 25 0 311 331 569 275 6 15 1670 73 679 991 1581 89 91 106 635 19 2 289 344 682 228 1 16 2123 69 697 1426 2010 113 136 94 864 47 3 393 468 973 175 11 17 2764 69 929 1835 2656 108 202 170 1280 48 7 597 676 1250 89 8 18 773 83 296 477 756 17 31 27 364 10 0 180 184 317 68 1 19 3441 70 1233 2208 3290 151 202 199 1696 80 9 806 881 1331 208 18 20 1201 78 413 788 1167 34 83 95 501 16 1 190 310 512 76 4 21 655 72 256 399 630 25 61 43 269 9 1 134 134 326 62 1 22 1208 60 436 772 1135 73 94 81 468 24 7 216 245 460 188 0 X 593 44 541 52 544 49 55 53 290 23 3 140 147 237 37 9 Y 39 70 7 32 37 2 2 0 2 1 0 1 1 3 33 0 47578 74.33 18138 29440 45626 1952 2837 3040 20477 806 82 9646 10749 20778 3856 152 mir
ADN Séquençage Exome 50000 Variants Filtres : hypothèse maladie rare récessive -2 variants dans un même gène -Frq htz < 1 hmz =0 -Couverture > 8x -Variants affectant des séquences codantes (Exon, faux sens, non sens, épissage) 500-900 variants Sélection de Gènes - Pathogénicité des variants (Polyphen2, Alamut) -Fonction du Gène - Confirmation par séquençage Sanger - Etude de ségrégation chez les parents 50 variants Séquençage Sanger de gènes candidats chez d autres patients OCA = confirmation 15 gènes candidats investigués Etudes fonctionnelles
Autres 1) Optimisation des outils, techniques : nouvelles amorces PCR, 2) Etudes fonctionnelles sur mutations d épissage 3) Base de données clinico biologiques 4) Collaboration R. Aquaron : Analyses haplotypes G47D (TYR) et del exon 7 (OCA2) Utilisation des crédits: - Réactifs, prestations séquençage NGS - Salaires: S. François (technicien); F. Morice-Picard (thèse); D. Simon (vacations)
PERSPECTIVES 1) Finir analyse exome : - Analyse de 5 gènes candidats restants chez 20 patients sans mutation (phénotype AOC typique, ADN disponible) - Séquencer l exome de 6 nouveaux patients (dont deux apparentés) Appel d Offres Fondation Maladies Rares 2013 2) Analyse des nouveaux gènes OCA6 et OCA7 chez 20 patients : - c10orf11 : aucune mutation trouvée (ponctuelle, délétions) - SLC24A5 : 5/20 patients mutés à confirmer pour certains. NB: aucun variant de SLC24A5 mis en évidence dans exome 3) Séquençage complet des gènes OCA1-4 : finir l analyse 4) Analyse des 19 gènes d albinisme syndromique
APPLICATION DIAGNOSTIC HOSPITALIER Le NGS de débitmoyenpermetde séquencersimultanémentdes dizainesde gènessurun nombrerestreintde patients : totalement adapté au diagnostic de maladies rares. But principal : faire plus viteet plus complètementcequel onfaisaitdéjà. Actuellement: OCA1, 2, 3, 4, OA1, HPS1 Temps de réponse : 1 à 12 mois Nouvelles possibilités grâce au NGS machine installée : Analyse de tous les gènes d albinisme : OCA: TYR, OCA2, TRP1, SLC45A2, GPR143, c10orf11, SLC24A5, nouveaux gènes à venir HPS: HPS1, AP3B1 (HPS2), HPS3, HPS4, HPS5, HPS6, DTNBP1 (HPS7), BLOC1S3(HPS8), PLDN(HPS9) WS : PAX3 (WS1,3), MITF (WS2), EDN3(ET3) (WS4), EDNRB (WS4), SOX10(WS4) GS: MYO5A(GS1,3), RAB27A(GS2), MLPH(GS3) CHS: LYST Piebaldism: KIT Modificateurs: MC1R, KITLG, SLC24A4, (SLC24A5),. Séquençage de gènes entiers (exons + introns + séquences flanquantes) Avantages: Exhaustivité Flexibilité accrue Rapidité : semaines -mois
Conseil Génétique Distinguer les formes syndromiques des non syndromiques. Mode de transmission : autosomique récessive. Risque de récurrence familial = 25%. Diagnostic prénatal à discuter, en fonction notamment de la sévérité de la forme familiale, du vécu familial,. Plus le nombre de patients testés est élevé, meilleure est la connaissance de la maladie d un point de vue médicoscientifique: corrélation génotype-phénotype : relation entre mutation dans tel ou tel gène et expression de la maladie.
Remerciements: Service de Génétique Médicale, CHU Bordeaux: Fanny Morice-Picard (UB) Eulalie Lasseaux (CHU) Stéphane François (UB) Delphine Simon (UB) Claudio Plaisant (CHU) Dorothée Cailley (CHU) Caroline Rooryck-Thambo (UB, CHU) Audrey Rouault (CHU) Claire Castaing (CHU) Didier Lacombe (UB, CHU) Service de Dermatologie, CHU de Bordeaux: Alain Taieb Nombreux cliniciens des CHU Genespoir, les patients et leurs familles DHOS (Min. Santé), UNADEV