02-04 avril 2014 April 02-04, 2014

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1 PLANNING & RÉSUMÉS SOUTENANCES STAGES DE 3 ème ANNÉE Année SCHEDULE & ABSTRACTS DEFENSES 3 rd YEAR INTERNSHIPS Year avril 2014 April 02-04, INGENIEURS ENSTBB PROMOTION 2014 (18 ème promotion) 43 ENSTBB ENGINEERS CLASS OF 2014 (18 th class) ENSTBB Institut Polytechnique de Bordeaux146, rue Léo Saignat Bordeaux cedexfrance Té : +33(0) Fax : +33(0)

2 ROYAUME-UNI / UNITED KINGDOM GLAXOSMITHKLINE BIOPHARM R&D (STEVENAGE) Marie SALAT KYMAB Ltd (CAMBRIDGE) Emeline LUDWIG *** (CAMBRIDGE) Amandine GEORGES Pauline RUFFIÉ RECOMBINANT ANTIBODY TECHNOLOGY Ltd (CAMBRIDGE) Renaud MEVEL ROSLIN INSTITUTE (SCOTLAND) Elvire BERTHENET ADISSEO France SAS CINABio (TOULOUSE) Alfonso Manuel GONZALEZ FLORES BLUEBIRD BIO France (PARIS) Joëlle CHEUZEVILLE EUROQUALITY (BORDEAUX) Eléonore DIAS ARBOR VITA Corporation (FREMONT) Sophie BOURGOIS Cyrielle CALMELS FRANCE MERCK BIODEVELOPMENT (MARTILLAC) Carole AVIAS Armelle GILLETTA DE SAINT JOSEPH Laurianne GOYON SANOFI-AVENTIS RECHERCHE & DEVELOPPEMENT (VITRY SUR SEINE) Agnès ARMAND SANOFI-PASTEUR (MARCY L'ÉTOILE) Tra Ly NGUYEN TRANSGENE SA (ILLKIRCH) Lolita BOUCHER GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS (LAVAL) Odette BECHEAU CANADA U.S.A BAYER HEALTHCARE PHARMACEUTICALS (BERKELEY) Eva COSSON NEW ENGLAND BIOLABS Inc. (IPSWICH) Hanna EL FEZZAZI Karine TROTTIER Sophie VAUD CRUCELL (LEIDEN) Charline MAIGNAN ATMI (BRUXELLES) Maëlle PASQUIOU UCB PHARMA (BRAINE L'ALLEUD) Alexandre PERMINGEAT ROCHE DIAGNOSTICS GmbH (PENZBERG) Marine MERON EVOLVA (REINACH) Simon BREGE Alice CIBRARIO BELGIQUE / BELGIUM SUISSE / SWITZERLAND GLENMARK PHARMACEUTICALS SA (LA-CHAUX-DE-FONDS) Lucie BOUARD Camille DELON Lauriane GAMAND InSphero AG (Schlieren) Jennifer BOURLAND ALLEMAGNE / GERMANY SANOFI AVENTIS DEUTSCHLAND GmbH (Francfort) Lise DEVAL CEVA PHYLAXIA-Ltd (BUDAPEST) Juline GUENAT PAYS-BAS / NETEHERLANDS PEPSCAN THERAPEUTICS (RC LELYSTAD) Marie OUARNÉ MERCK-SERONO SA Corsier sur Vevey Branch (FENIL-CORSIER) Anaïs ROULET Julie THERY NOVIMMUNE SA (PLAN-LES-OUATES) Coralie BORROSSI Morgane LE BRAS HONGRIE / HUNGARY AUSTRALIE / AUSTRALIA GARVAN INSTITUTE OF MEDICAL RESEARCH (Sidney) Yoann PLANCHENAULT VAXINE Pty Ltd (BEDFORD PARK) Blandine JOUVENAUX Emeline LARONDEAU Morgane LECOINTRE : L'ENSTBB n'est pas autorisée à communiquer le nom et le logo de cette entreprise ENSTBB is not authorized to communicate the name and the logo of this company.

3 PLANNING DES SOUTENANCES SCHEDULE OF THE ORAL PRESENTATIONS Mercredi 02 avril / Wednesday 02 April JURY 1 JURY 2 Jeudi 03 avril / Thursday 03 April JURY 1 JURY 2 Vendredi 04 avril / Friday 04 April JURY 1 JURY 2 Amphithéâtre / Amphitheater salle B21 / Room B21 salle B21 / Room B21 Amphithéâtre / Amphitheater 08h45 Coralie BORROSSI 08h45 Eléonore DIAS NOVIMMUNE SA EUROQUALITY 08h45 Agnès ARMAND 08h45 Alexandre PERMINGEAT SANOFI-AVENTIS R&D UCB PHARMA 09h30 Morgane LE BRAS NOVIMMUNE SA 09h30 Hanna EL FEZZAZI NEW ENGLAND BIOLABS Inc. 09h30 Simon BREGE EVOLVA 09h30 Karine TROTTIER NEW ENGLAND BIOLABS Inc. 10h25 Lucie BOUARD GLENMARK PHARMACEUTICALS SA 10h25 Cyrielle CALMELS ARBOR VITA Corporation 10h25 Alice CIBRARIO EVOLVA 10h25 Armelle GILLETTA DE SAINT JOSEPH MERCK BIODEVELOPMENT 11h10 Marie SALAT 11h10 Camille DELON GLAXOSMITHKLINE BIOPHARM R&D GLENMARK PHARMACEUTICALS SA 11h10 Pauline RUFFIÉ 11h10 Anaïs ROULET *** MERCK-SERONO SA Corsier sur Vevey Branch 11h55 Marie OUARNÉ PEPSCAN THERAPEUTICS 11h55 Lauriane GAMAND GLENMARK PHARMACEUTICALS SA 11h55 Joëlle CHEUZEVILLE BLUEBIRD BIO France 11h55 Amandine GEORGES *** salle B21 / Room B21 Amphithéâtre / Amphitheater Amphithéâtre / Amphitheater salle B21 / Room B21 Amphithéâtre / Amphitheater salle B21 / Room B21 14h00 Tra Ly NGUYEN SANOFI-PASTEUR 14h00 Elvire BERTHENET ROSLIN INSTITUTE 14h00 Juline GUENAT CEVA PHYLAXIA-Ltd 14h00 Maëlle PASQUIOU ATMI 14h00 Blandine JOUVENAUX VAXINE Pty Ltd 14h00 Julie THERY MERCK-SERONO SA Corsier sur Vevey Branch 14h45 Emeline LUDWIG 14h45 Lolita BOUCHER KYMAB Ltd TRANSGENE SA 14h45 Sophie VAUD 14h45 Charline MAIGNAN NEW ENGLAND BIOLABS Inc. CRUCELL 14h45 Emeline LARONDEAU 14h45 Laurianne GOYON VAXINE Pty Ltd MERCK BIODEVELOPMENT 15h40 Carole AVIAS MERCK BIODEVELOPMENT 15h40 Marine MERON ROCHE DIAGNOSTICS GmbH 15h40 Morgane LECOINTRE VAXINE Pty Ltd 15h40 Alfonso Manuel GONZALEZ FLORES ADISSEO France SAS CINABio 15h40 Renaud MEVEL RECOMBINANT ANTIBODY TECHNOLOGY Ltd 15h40 Sophie BOURGOIS ARBOR VITA Corporation 16h25 Odette BECHEAU GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS 16h25 Jennifer BOURLAND InSphero AG 16h25 Eva COSSON BAYER HEALTHCARE PHARMACEUTICALS 16h25 Yoann PLANCHENAULT Garvan Institute of Medical Research 16h25 Lise DEVAL SANOFI AVENTIS DEUTSCHLAND GmbH Soutenances publiques Non-confidential presentations Soutenances confidentielles élèves ENSTBB autorisés Confidential presentations ENSTBB students allowed Soutenances confidentielles élèves ENSTBB non-autorisés Confidential presentations ENSTBB students unauthorized Présence du maître de stage In presence of the supervisor : L'ENSTBB n'est pas autorisée à communiquer le nom de cette entreprise ENSTBB is not authorized to communicate the name of this company. Exposés de 15 minutes suivis de 20 minutes de questions du jury. Toutes les séances de questions du jury seront réalisées à huis-clos. Oral presentations (15 minutes) followed by questions of jury (20 minutes). The session of questions are performed with the board of examiners only.

4 SANOFI AVENTIS RECHERCHE & DEVELOPPEMENT maître(s) de stage / Supervisor(s) : Nadine MICHOT Etude de faisabilité de la production d une protéine biothérapeutique VITRY SUR SEINE France 15/07/ /02/2014 Feasibility study for the production of a biotherapeutic protein Agnès ARMAND Certaines pathologies graves telles que la dystrophie myotonique et la myopathie myotubulaire restent jusqu à présent sans médications efficaces. Avec des fréquences d apparition de 1/8000 et 1/50000 respectivement, ces maladies sont des cibles de choix pour les entreprises pharmaceutiques aux technologies innovantes. C est dans ce cadre qu une entreprise externe à Sanofi a développé un concept qui pourrait permettre de ralentir ces maladies, en ciblant de manière efficace les cellules concernées par ces pathologies. Le concept en question consiste à fusionner une protéine thérapeutique (tronquée ou non) à un anticorps ou un de ses fragments, permettant ainsi de cibler les cellules à traiter. Le rôle de Sanofi dans cette collaboration est d évaluer la faisabilité d une production de 10 milligrammes d une des diverses protéines d intérêt. Celle-ci devra permettre à l entreprise externe d obtenir une preuve du concept sur un modèle murin, afin de transposer ensuite la construction sur un modèle humain. Différentes constructions plasmidiques ont été testées dans des cellules hôtes (HEK293 et CHO) transfectées de manière stable ou transitoire. Les diverses protéines d intérêt se sont révélées être non sécrétées et ne sont retrouvées que dans la fraction insoluble. Afin de pallier ce phénomène, des essais d extraction et de solubilisation ont été mis en place. Par la suite, des étapes de micropurification puis de purification ont été menées afin de répondre aux exigences de l entreprise externe. Some serious diseases like myotonic dystrophy and myotubular myopathy are up to now without effective treatment. With a frequency of occurrence of respectively 1:8,000 and 1:50,000, these diseases are interesting targets for pharmaceutical companies with innovative technologies. An external company to Sanofi has developed a concept which should slow down the disease development by efficiently targeting cells which need to be cured. The present project focuses on a therapeutic protein (truncated or full length) fusionned with an antibody or its fragments. Sanofi s role in this project is to assess the production feasibility for 10 milligrams of one of the interesting proteins. This should enable the external company to obtain a proof of concept in a murine model, in order to adapt the selected construction to a human model. Different plasmidic constructions were tested in host cells (HEK293 and CHO) with both stable and transient transfections. All our proteins of interest were not secreted and were localized in the insoluble fraction. Extraction and solubilization screens were performed in order to overcome this issue. Then, micropurification and purification were conducted to meet the company requirements. MERCK BIODEVELOPMENT maître(s) de stage / Supervisor(s) : David DELVAILLE, Christelle SIHABOUT MARTILLAC France 15/07/ /02/2014 Evaluation d une micro échelle chromatographique utilisant la plateforme Tecan freedom EVO II Evaluation of automated microscale purification on platform Tecan freedom EVO II Carole AVIAS Le site Merck Biodevelopment de Martillac implémente le concept de Quality By Design (QBD) dans le développement de ses procédés de purification. Le QBD est une étude, débutée entre les phases cliniques II et III, qui évalue chaque paramètre intervenant lors du procédé de production d une molécule d intérêt afin de définir des intervalles de travail dans lesquels il n y a aucun impact sur la qualité/sécurité de la molécule. L étude de chaque paramètre est longue et représente des ressources non négligeables. L objectif de mon stage était de mettre en place et d évaluer une méthode permettant de reproduire les étapes chromatographiques actuellement réalisées sur un Akta Explorer (échelle 10 ml) avec un système robotisé, la plateforme Tecan freedom EVO II (échelle 0,5 ml). Cette plateforme présente l avantage de pouvoir effectuer huit chromatographies simultanément avec des micro-colonnes. Les principaux challenges étaient que la plateforme n est pas conçue pour le suivi d UV en ligne, ni pour générer un gradient linéaire. La purification de deux molécules faisant intervenir une élution isocratique a pu être reproduite sur la plateforme. Après optimisation de paramètres physico-chimiques et mécaniques, les chromatogrammes étaient similaires à ceux obtenus sur un système Akta, et la qualité était alignée sur les spécifications attendues. Le système a aussi été testé afin de simuler une chromatographie avec une élution en gradient linéaire, avec des résultats proches de l échelle validée. A terme, l utilisation de la plateforme devra être évaluée et validée pour une étude de QBD. Merck Biodevelopment based on Martillac implements the Quality by design concept (QBD) in the development of its purification processes. The QBD is a study that should start between clinical phases II and III. It evaluates every parameters involved in the production of the targeted molecule in order to define an appropriate range to ensure the desired product quality/safety. The study of each parameter is rather long and represents significant human and material costs. The aim of my internship was to set-up and assesses an automated system that mimics runs performed on a classical Akta Explorer (10 ml scale): the Tecan freedom EVO II platform (0.5 ml scale). This platform offers the advantage to perform eight chromatographic runs simultaneously using micro columns. The main technical challenges were to solve that the platform is not designed for following on-line UV and generating linear gradient. The purification of two molecules with an isocratic gradient was successfully mimicked on the platform. After physicochemical and mechanical parameter optimizations, the chromatograms and the quality of the molecules were comparable to those obtain on a classical Akta. Simulation of a chromatography using a linear gradient has been done and results were in accordance with expected specifications. Finally, the use of the platform should be evaluated and assessed for a QBD study. 1

5 Odette BECHEAU GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS maître(s) de stage / Supervisor(s) : Patrick RHEAULT Evaluation de Chlamydomonas reinhardtii comme système alternatif de production de protéines hétérologues Aujourd hui, les stratégies d expression de protéines recombinantes sont nombreuses et comprennent un large panel d organismes hôtes, eucaryotes ou procaryotes, de vecteurs d expression, de stratégies d intégration. Bien que les bactéries telles Escherichia coli restent largement utilisées tout comme les levures ou les lignées de cellules mammifères (CHO, HEK ), le système idéal de production de protéines recombinantes, notamment virales, n existe pas encore. C est pourquoi depuis les dix dernières années, des études génétiques et métaboliques sur les micro-algues photosynthétiques ont démontré leurs potentiels comme système alternatif de production de protéines hétérologues: milieux de culture à bas coût, possibilité d assembler voire de sécréter des protéines complexes, des génomes simples et entièrement séquencés. Plusieurs molécules à visée thérapeutique ont été correctement exprimées en transformant les génomes aussi bien nucléaire permettant de réaliser des modifications post-traductionnelles, que chloroplastique donnant de meilleurs rendements de production. Lors de ce stage nous avons évalué la capacité de la micro-algue unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii souche sauvage 137c, à produire et sécréter des molécules cibles antigéniques. Pour ce faire, différentes stratégies d intégration ont été analysées, de manière aléatoire au sein du génome nucléaire ou ciblée par recombinaison homologue dans le génome chloroplastique. Différents signaux de sécrétions endogènes et exogènes ont été recherchés pour évaluer la sécrétion après intégration nucléaire. Une première étape de bio-informatique a été réalisée afin de définir les cassettes d expression servant à évaluer le système, en choisissant notamment les gènes d intérêt et les vecteurs d expression. Dans un second temps, les vecteurs d expression ont été clonés à l aide de techniques classiques de biologie moléculaire. Il s en suit plusieurs étapes d optimisation, concernant les conditions de croissance cellulaire, le protocole d électroporation permettant de transformer le génome nucléaire de Chlamydomonas reinhardtii, la mise en place de PCR colonies. A titre d exemple, deux électroporateurs ont été testés ainsi que différentes conditions de voltage et plusieurs concentrations en antibiotique de sélection. Enfin, une dernière méthode physique de transformation par bombardement de billes d or appelée biolistique a été évaluée pour modifier le génome chloroplastique. Finalement après analyse en Western blot, aucune des deux méthodes n a permis d obtenir les protéines d intérêt que l on souhaitait produire, laissant place à différentes hypothèses pour expliquer ces résultats. LAVAL Canada 29/07/ /02/2014 Evaluation of Chlamydomonas reinhardtii as an alternative system to produce heterologous proteins Recombinant protein expression strategies are numerous including a wide range of host organisms, eukaryotes or prokaryotes, diverse expression vectors and integration strategies. Although bacteria, such as Escherichia coli, yeasts or mammalian cell lines (CHO, HEK...) are widely used, each protein production system has its own drawbacks. Genetic and metabolic pathways of new organisms have been studied for ten years or so, including photosynthetic microalgae demonstrating their potential as alternative systems: low production costs, absence of human pathogens and the ability to fold and assemble complex proteins accurately, fully sequenced genomes. In addition, transgenic algae have been shown to support recombinant protein expression, both from the nuclear genome which perform post- translational modifications and chloroplast genome in order to obtain higher yields. During this internship, we evaluated the ability of the microalgae Chlamydomonas reinhardtii, 137c wild-type strain from Invitrogen kit, to produce and secrete antigenic target molecules. To do this, different integration strategies were analyzed, nuclear random integration whereas the introduction of transgene into the C. reinhardtii chloroplast genome is performed by homologous recombination. Endogenous or exogenous peptide secretion signals were tested to assess the ability of this organism to secrete protein of interest from a nuclear integration. First of all, cloning vectors were selected as well as expression cassettes which were designed with bioinformatics tools. Secondly, expression vectors were cloned using molecular biology techniques. Then several optimization steps were performed, regarding cell growth conditions, electroporation protocol in order to transform the C. reinhardtii nuclear genome, colony PCR reactions. For example, two electroporators were used and voltage conditions as well as concentration of the antibiotic selection varied. Lastly, the physical biolistic method of transformation was tested to modify the chloroplast genome. After Western blot analyses, neither method allowed protein production. Multiple hypotheses were found to explain these negative results. ROSLIN INSTITUTE maître(s) de stage / Supervisor(s) :, Jacqueline SMITH Recherches sur le contenu génétique de locus liés à la maladie de Marek SCOTLAND Royaume Uni Investigation of gene content in Marek s Disease loci Elvire BERTHENET La maladie de Marek (MD) est une maladie majeure causée par un virus d'α-herpès aviaire fortement oncogène, le virus de Maladie de Marek (MDV). Cette maladie a un lourd impact sur l'industrie de la volaille, causant une perte globale annuelle de 2 milliards de $. Le but de cette étude est d'identifier des gènes candidats qui pourraient jouer un rôle dans la résistance ou la sensibilité des poulets au MDV. Cette connaissance pourrait mener à une alternative sérieuse à la stratégie de vaccination actuelle par une utilisation de programmes de croisement sélectif. Des poulets susceptibles et résistants provenant de deux populations différentes (lignées Compton et Hyline) fournissent deux ensembles de données comparables. Les gènes trouvés dans différents Locus de caractère quantitatif (QTL) identifiés dans ces deux lignées sont annotés et des gènes intéressants sont mis en évidence selon leurs fonctions connues ou prévues. Ces deux ensembles de données sont alors croisés pour identifier les QTLs particulièrement intéressants. Dans ces gènes intéressants, les polymorphismes nucléotidiques (SNPs) fixes sont identifiés pour établir une liste de gènes candidats qui présentent des différences entre lignes résistantes et susceptibles. En croisant ces résultats avec les données d expression génétique obtenues par J.Smith, il sera possible d identifier certains gènes candidats forts. Des analyses PCR seront alors effectuées pour confirmer ces gènes candidats. Marek's Disease (MD) is a major disease caused by a highly oncogenic avian α-herpes virus, the Marek's Disease Virus (MDV). This disease has a huge impact on the poultry industry, causing an annual global loss of $2 billion. The aim of this study is to identify candidate genes that could play a part in the resistance or susceptibility of birds to MDV. This knowledge could lead to a serious alternative to the actual vaccination strategy by using selective breeding programs. Susceptible and resistant birds from two different populations (Compton lines and Hyline lines) provide two similar sets of data. The genes found in the different Quantitative Trait Locus (QTL) regions identified in these two populations are being annotated and interesting genes highlighted according to their known or predicted functions. These two sets of data are then combined to identify some very interesting QTLs In these interesting genes, fixed Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) are being identified in order to make a list of candidate genes that present differences between resistant and susceptible lines. By combining expression data from J. Smith's project with genes in identified QTL, it will be possible to spot some really strong candidate genes for disease resistance. PCR analysis and sequencing will then be done to confirm some of these candidate genes. 2

6 Coralie BORROSSI NOVIMMUNE SA maître(s) de stage / Supervisor(s) : Ulla RAVN Développement de la plateforme Octet pour la quantification de protéines et la caractérisation d interactions moléculaires Les interactions moléculaires peuvent être mesurées au moyen de différentes technologies et instruments. Concernant les interactions anticorpsantigène, des techniques telles la SPR (Résonnance Plasmonique de Surface), l ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) ou le FACS (Fluorescence- Activated Cell Sorting) sont communément utilisées à NovImmune. Récemment, l acquisition d un nouvel instrument, l Octet RED96 basé sur la technologie BLI (Bio-Layer Interferometry), a permis d élargir le champ d application et d accroître la rapidité des analyses. Le but de mon stage fut donc de développer des applications pour ce nouvel instrument afin d offrir un support supplémentaire à différentes activités du processus de développement d anticorps à NovImmune. Ainsi, plusieurs projets m ont été confiés, tels que : Evaluer l utilité de l Octet RED96 à des fins de sélection dans le cadre d un procédé de Phage Display. Des phages exprimant des anticorps (librairies et phages spécifiques purifiés servant de contrôle) furent utilisés afin de développer une méthode et d en optimiser certains paramètres (concentration en phages, tampons, temps d incubation, élution ). Optimiser les méthodes de quantification ; d abord en testant la robustesse, la reproductibilité et la précision du protocole pour quantifier des anticorps dans différents surnageants de culture cellulaire, puis en étendant cette technique à d autres protéines recombinantes en utilisant différents biosensors. Identifier les meilleurs formats et réactifs pour déterminer un ratio de chaines légères κ et λ dans des surnageants de culture cellulaire et mettre au point un protocole robuste afin de sélectionner parmi différents pools cellulaires le meilleur producteur d anticorps bispécifiques κλ-body, apportant ainsi un outil d analyse fiable applicable au screening de pools en production. PLAN LES OUATES Suisse 01/08/ /02/2014 Application of the Octet Platform to protein quantification and characterization Molecular interactions can be measured by different technologies and platforms. For antibody-antigen interactions, SPR (Surface Plasmon Resonance), ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) and FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) are commonly used at NovImmune. In this context, the acquisition of a new instrument, the Octet RED96, based on the BLI (BioLayer Interferometry) technology, has widened the panel of applications and increased the analysis throughput. The aim of my internship was to extend the scope of application of the Octet platform to support the different activities during the drug development process at NovImmune. Thus, several projects have been entrusted to me such as: Evaluate the feasibility of using the Octet RED in a Phage Display process to follow antibody/antigen binding during selections. Antibody-phage libraries and specific phage were used for the method development (phage concentration, buffers, incubation time, elution ). Implement protein quantification methods by testing the robustness, reproducibility and precision of the methods for antibodies in different crude cell supernatants at first and then by extending the methods to other recombinant proteins using several biosensor types. Find the best assay format and reagents to determine a κ/λ light chain ratio in cell culture supernatant and set up a robust method to select the best bispecific antibody-producing cell pool and thus provide a solid assay to support the manufacturing team. GLENMARK PHARMACEUTICALS SA maître(s) de stage / Supervisor(s) : Fabrizio Comper Anticorps thérapeutiques découverts par phage display: études de deux cibles oncologiques LA CHAUX DE FONDS Suisse 15/07/ /02/2014 Therapeutic antibodies discovery by phage display: case study of two oncology targets Lucie BOUARD Le phage display est une méthode in-vitro rapide et robuste qui permet d isoler des anticorps recombinants. Cette méthode est utilisée dans l industrie biopharmaceutique comme alternative à la technique des hydridomes. Le phage display est basé sur la présentation d une librairie de séquences d anticorps à l extrémité de bactériophages. Chaque bactériophage présente une seule séquence ce qui crée un lien direct entre phénotype et génotype. Après incubation de la librairie sur un antigène préalablement immobilisé et lavages, les phages spécifiques sont récupérés. Cette sélection basée sur l affinité est appelée biopanning et elle est généralement répétée plusieurs fois au cours du processus de sélection. Les bacteriophages sélectionnés peuvent ensuite être identifiés par ELISA et les séquences d anticorps facilement analysées. Ces séquences sont par la suite formatées (sous forme de single-chain variable fragment (scfv), scfv- fragment crystallizable (scfv-fc) ou d Immunoglobuline G (IgG)) afin d être caractérisées par cytométrie en flux (FACS) ou encore par technique Biacore. Glenmark Pharmaceuticals utilise cette technologie comme outil afin de développer sa gamme d anticorps monoclonaux. L entreprise a construit deux librairies différentes en termes de diversité : une librairie issue du sang de donneurs souffrant de diverse maladies auto-immunes et une librairie synthétique basée sur une structure d anticorps spécifique ayant une diversité restreinte aux CDR3 de la partie variable des chaines légères et lourdes. Dans cette étude, la librairie d anticorps synthétique a été utilisé afin d isoler des anticorps recombinants contre deux cibles cliniques : la première est une glycoprotéine transmembranaire impliquée dans l activation des lymphocytes T, la seconde possède une activité ecto-enzymatique ayant un rôle important dans le micro environnement tumoral. En parallèle de ces projets, de nouveaux protocoles de biopanning ont été développés ainsi qu une nouvelle méthode d analyse par FACS sur particules de phages afin de faciliter le processus de sélection. Antibody phage display is a fast and robust in-vitro method to discover and engineer antibodies that is currently used in the biopharmaceutical industry as an alternative to mouse hybridomas. The technology is based on the display of a library of antibody sequences at the tip of bacteriophages wherein one bacteriophage displays one antibody sequence, albeit providing a link between phenotype and genotype. Following incubation of the library onto a previously immobilised antigen, only bound bacteriophages are rescued, and this selection process called biopanning is generally repeated several times. The specific bacteriophages can easily be identified by ELISA, and antibody sequences can be retrieved. Those sequences are then formatted (as single-chain variable fragment (scfv), scfv-fragment crystallizable (scfv-fc) or Immunoglobulin G (IgG) formats) and further characterized by FACS or by Biacore. Glenmark Pharmaceuticals uses phage display as a discovery tool to develop its monoclonal antibodies pipeline. The company built two different type of libraries in terms of diversity, a donor based library originating from auto-immune patient blood donations and a synthetic library based on a stable germline antibody scaffold having diversity restricted to the CDR3 of the variable domain heavy and light chain. In this study, Glenmark s synthetic library was used to isolate and identify antibodies against two clinical targets: first, a transmembrane glycoprotein involved in the differentiation and the activation of T cells, and second an ectoenzyme involved in the tumor microenvironment. The work included setting up protocols for different types of biopanning and the development of FACS methods directly employing bacteriophages to facilitate antibody discovery. 3

7 Lolita BOUCHER TRANSGENE SA maître(s) de stage / Supervisor(s) : Anthony DA SILVA, Marianne GRAS Contribution à la mise en place d une mesure en ligne par spectrométrie Raman pour le suivi et le pilotage du procédé de production des vecteurs poxvirus TRANSGENE est impliqué dans le projet de consortium «CellPAT» dont l objectif est la mise en place d un suivi en continu des procédés biologiques par spectroscopie Raman permettant leur pilotage. Il s agit dans un premier temps d élaborer un modèle de suivi, puis à terme de développer un modèle de pilotage des procédés. Dans le cas de TRANSGENE, le procédé servant de support à ce travail est un procédé de production de vecteurs viraux (Poxvirus) sur une lignée de cellules en suspension. Le but de mon stage consiste à initier le projet dans sa partie réalisée à TRANSGENE. Le premier objectif est d identifier et de sélectionner les différents bio-marqueurs du procédé qui peuvent être utilisés pour le pilotage. On définit ici les bio-marqueurs comme des composés du procédé détectables et quantifiables par spectroscopie Raman, et dont le suivi présente un intérêt pour la compréhension et le suivi du procédé. Cette sélection se fait selon deux types de critères : -Critères biologiques : Permettant l évaluation de l intérêt du composé en tant que bio-marqueur. -Critères analytiques : Permettant l évaluation de la faisabilité du suivi analytique de chaque composé en matière de coût et de durée. L objectif suivant de mon stage est de générer les données nécessaires à l élaboration du modèle de suivi. Il s agit des spectres Raman d une part et des données analytiques d autre part. Ainsi, cela comprend le paramétrage du spectromètre Raman et le suivi analytique à réaliser. ILLKIRCH France 15/07/ /02/2014 Contribution for developing an in line Raman spectroscopy measurement for the parameters following and monitoring of poxvirus vectors production process TRANSGENE is part of a consortium working on a common project called CellPAT. The goal of the project is the development of an inline monitoring model for biological processes using Raman spectroscopy. It means to develop two successive models: a monitoring one and a controlling one. TRANSGENE has decided to work on a viral vectors production process, more specifically a process with infection of suspension cell culture by pox virus. My internship consists in initiating the project. The first objective is to identify and select different process biomarkers, which could be used for the control of the process. Biomarkers are defined as any process component detectable and quantifiable by Raman spectroscopy, and of which monitoring presents an interest for the process comprehension and monitoring. This selection is based on two kind of criteria: -Biological criteria: to evaluate the interest of a component as a biomarker -Analytical criteria: to evaluate the feasibility of analytical monitoring for each component in terms of cost and time. The other objective of my internship is to plan the data generation for the elaboration of the monitoring model. This includes defining the Raman spectrometer parameters and the monitoring by analytical reference methods. Sophie BOURGOIS ARBOR VITA Corporation maître(s) de stage / Supervisor(s) : Alvin YIM Développement d un Plan d Acon Systémaque et Simplifié pour l Opmisaon et le Scale Up du Procédé de Production d Anticorps Monoclonaux Maintenant que le Onco E6 Cervical Test a obtenu le CE mark, le test peut être commercialisé en Europe. Afin de pouvoir assurer la production en masse des kits, la nécessité de développer un procédé de production à plus grande échelle a émergée. Pour cela, le travail de développement d un procédé a été divisé en trois phases: la phase de screening (afin d identifier les paramètres critiques), la phase d optimisation (afin de déterminer la meilleure condition pour chaque paramètre d intérêt) et la phase de scale-up (afin de traiter une quantité 10 fois plus importante de matières). Pour le downstream process, une expérience à micro-échelle utilisant des ZEBA colonnes a été développée et utilisée en tant qu outil de screening afin d évaluer l influence de certains paramètres sur le rendement de purification. Ensuite, une expérience à petite échelle utilisant une colonne de taille réduite et le système AKTA à été mise au point pour optimiser la valeur des paramètres définis comme critiques lors de la phase de screening. Les paramètres ainsi optimisés sont ensuite transférés en Manufacturing. Pour l upstream process, le travail d optimisation a été ciblé sur la production d un clone hautement productif afin de générer une nouvelle Master Cell Bank. Pour sélectionner le clone qui fournira des rendements de production plus importants, une procédure de sous clonage et un test ELISA ont été mis au point. Le 10X scale-up process consiste à définir la colonne appropriée. Le nouveau process est maintenu semblable à l original mais avec l implémentation des changements apportés aux paramètres lors des phases de downstream screening et d optimisation. Pour évaluer le nouveau 10X scale-up process de production d anticorps monoclonaux, des outils analytiques ont été développés comme l ELISA quantitatif et l ELISA d activité. FREMONT Etats Unis 15/07/ /02/2014 Development of a Systematic and Streamlined Process Development Workflow for Optimization and Scale up of mab Production Process Now that the Onco E6 Cervical Test has obtained the CE mark, it can be commercialized in Europe. In order to be able to produce a large quantity of kits, the need to develop a scaled-up production process has emerged. In order to do so, process development work has been initiated and consists of 3 phases: the screening phase (to identify critical parameters), the optimization phase (to determine the best condition for each key parameter) and the scale-up phase (to process 10 times higher amount of materials). For the downstream purification process, a micro-scale experiment using ZEBA columns has been designed and used as a screening tool to evaluate the influence of parameters on the purification recovery. Afterwards, a small scale experiment using a small column and the AKTA system has been developed to optimize levels of the parameters that have been found as critical during the screening phase. Optimal parameters are then transferred to Manufacturing. For the upstream cell culture process, optimization was focused on producing a higher productivity clone to generate a new master cell bank. To select the clone that will give higher manufacturing yields, a subcloning procedure and an ELISA assay have been developed. The 10X scale-up process consisted of defining the appropriate column size. The new scale process was maintained as the original manufacturing one but with the addition of key parameter changes identified in the downstream screening and optimization phase. To evaluate the new 10X scale-up mab production process, analytical tools were developed such as the in-process quantitative ELISA assay and the activity ELISA assay. 4

8 InSphero AG maître(s) de stage / Supervisor(s) : Wolfgang MORITZ Développement et caractérisation de microtissus de foie Schlieren Suisse 01/07/ /02/2014 Development and characterization of liver microtissues Jennifer BOURLAND Pour permettre le développement de nouveaux médicaments et en évaluer les risques, il existe une réelle nécessité de créer de nouveaux modèles pour améliorer les tests toxicologiques in vitro. La culture cellulaire en 2D, couramment utilisée en toxicologie, ne reflète pas toujours parfaitement les effets indésirables pouvant être observés in vivo. Les modèles organotypiques en 3D peuvent permettre de combler ces lacunes. InSphero développe et produit des microtissus organotypiques, sans matrice, par la méthode de la goutte suspendue adaptée au format standard de plaque 96-puits. Ce format est compatible avec les systèmes automatisés et permet un screening toxicologique efficace durant les premières phases de développement. L hépatotoxicité est une des raisons principales amenant au retrait du marché d un médicament, c est pourquoi des modèles hépatiques prédictifs in vitro sont cruciaux pour évaluer les risques au début de la phase préclinique. Lors de mon stage, ma tâche était de développer deux microtissus de foie en 3D : (i) un modèle de foie de chien, et (ii) un modèle de foie humain dérivé de cellules souches induites. Lors des tests précliniques, si des effets indésirables sont observés chez les chiens, ce modèle in vitro permet d étudier les mécanismes de l hépatotoxicité et d interpréter les données cliniques précédemment obtenues. Le but de mon projet était d établir les conditions de culture nécessaire à la formation et au maintien de microtissus fonctionnels durant au moins deux semaines de culture. Le microtissu de foie de chien sera un modèle important en complément des outils toxicologiques in vitro existants. Ce sera également le premier modèle de foie de chien en 3D développé. Mon second projet concerne le développement d un modèle de foie humain basé sur des hépatocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites. Le but de ce projet était d établir la faisabilité ainsi que la caractérisation des microtissus de foie humain dérivés de cellules souches induites. To develop new drugs, and assess their safety, there is a need for advanced in vitro toxicology models to improve toxicology testing. Classical 2D cell culture models, commonly used in toxicology often do not properly reflect in vivo biology. Organotypic 3D models can help to bridge this gap. InSphero develops and produces scaffold-free organotypic 3D microtissues using the hanging drop method adapted to standard 96-well plate format. This format is compatible to liquid handling systems and allows efficient toxicity screening already at early time points in drug development. Hepatotoxicity is a major reason for drug withdrawal from the market, therefore predictive in vitro liver models are crucial for drug safety assessment in early preclinical phases. During my internship I was assigned to develop two different 3D liver microtissue models: (i) dog liver microtissues and (ii) ips-cell derived human liver microtissues. Pre-clinical testing in dogs is an important milestone in a drug development. If adverse effects are observed, this in vitro model will allow to study the mechanisms of canine hepatotoxicity and interpret the clinical data previously obtained. The aim of my project was to establish culture conditions to form and maintain functional microtissues over several weeks in culture. The dog liver microtissues will be an important model complementing the in vitro tools in toxicology due to its translational aspect between in vivo and in vitro data. It will also be the first 3D dog liver model ever developed and fully characterized. A second liver microtissue model was developed, which contained hepatocytes derived from induced pluripotent stem cells (ipsc). The aim of the project was to establish a proof of feasibility and functionality of the ips-cell derived human liver microtissues. EVOLVA maître(s) de stage / Supervisor(s) : Markus SCHWAB, Astrid SCHAFER Ingénierie génétique d une voie métabolique de levure non Saccharomyces pour la production d un composé nutritionnel REINACH Suisse 15/07/ /02/2014 Metabolic engineering of a non Saccharomyces yeast for the production of a nutritional ingredient Simon BREGE Le projet au sein duquel je fus intégré est né du partenariat entre Evolva (Reinach, Switzerland) et Roquette Frères SA (Lestram, France), une multinationale se plaçant dans les 5 leaders internationaux de l industrie amidonnière. Ce projet a pour objectif d optimiser et de développer une voie métabolique pour la production d un composé nutritionnel aux larges applications dans le domaine alimentaire. Mon stage avait pour mission de générer des vecteurs d expression dans le but d optimiser la production de métabolites d intérêt par la souche hôte fournie par Roquette. Cela consistait à cloner des combinaisons de gènes hétérologues sous différents promoteurs puis de faire exprimer ces combinaisons dans cette souche afin d évaluer leur effet sur la production de l ingrédient. Parallèlement à cela, j ai cloné une version améliorée du vecteur utilisé en réduisant la séquence de réplication d origine autonome. La problématique fut de réduire cette séquence de façon assez conséquente pour permettre l insertion de deux à trois cassettes d expression dans le vecteur tout en conservant la stabilité du plasmide. L expression de gènes additionnels permis par ce vecteur fut également observée de façon à démontrer une éventuelle augmentation dans la production de la souche. Une fois les concentrations en métabolites obtenues par analyse chimique, les combinaisons les plus productrices seront intégrées au génome dans de futurs travaux. Ces nouvelles souches sont ensuite envoyées à la plateforme de fermentation pour évaluer leur production dans des conditions industrielles. The project I was working on is originates from a partnership between Evolva (Reinach, Switzerland) and the company Roquette Frères SA (Lestrem, France), one of the 5 global leaders in the starch manufacturing industry. The aim of this project is to develop a novel and optimized biosynthetic production route for an ingredient with important applications in the food sector. My internship consisted in cloning different heterologous genes from a specific metabolic pathway in a vector designed for the host strain provided by Roquette. These genes were expressed from several promoters and the effect of these combinations on the ingredient production was assessed. Additionally, I cloned an improved version of the vector by reducing the size of the originally encoded autonomously replicating sequence while conserving plasmid stability. This modification allowed the generation of double and triple expression plasmids with a reasonable size, after validation of such vector. Metabolite production using these plasmids was also assessed in order to evaluate whether additional gene copies would increase titers. After measurement of metabolite concentrations by analytical chemistry the most productive gene combinations will be integrated into the genome of the strain in future work. Production by these new strains will be then scaled up by the fermentation platform. 5

9 Cyrielle CALMELS ARBOR VITA Corporation maître(s) de stage / Supervisor(s) : Max BREVNOV Développement du test immunocytochimique OncoE6TM: nature de la coloration nucléaire traduisant un résultat positif imprévu dans des échantillons cliniques L infection par le papillomavirus humain (HPV) est une des maladies sexuellement transmissibles les plus représentées. Les HPV à haut risque (hr-hpv) provoquent environ 99% des cancers du col de l utérus, alors que les HPV à faible risque (lr-hpv) n occasionnent que des lésions bénignes. Chaque année à travers le monde on recense nouveaux cas de cancer du col de l utérus causant la mort de femmes. Le test Papanicolaou (Pap test) est l examen de dépistage du cancer du col de l'utérus standard dans les pays développés. L analyse du test, basée sur l observation de la morphologie des cellules, est cependant très subjective et est à l origine de taux de faux positifs et faux négatifs élevés. De plus en plus d entreprises tentent donc de développer des outils de diagnostic basés sur la détection de protéines virales ou d acides nucléiques spécifiques des HPV. En ce qui concerne les hr-hpv, les protéines virales E6 et E7 ont été démontrées comme nécessaires et suffisantes pour la transformation oncogénique des cellules et la progression du cancer. Ainsi, E6 est un biomarqueur prometteur pour la détection de graves lésions du col de l utérus. L entreprise Arbor Vita Corporation travaille sur le développement d un test immunocytochimique (ICC) : OncoE6TM ICC test, destiné à être utilisé en complément du Pap test. Ce test ICC permet la détection qualitative de la protéine E6 dans les échantillons cytologiques cervicaux, l objectif étant d identifier plus facilement les cellules anormales sur la lame de microscope. Au cours de la phase de développement de l OncoE6TM ICC test, une coloration nucléaire traduisant un résultat positif inattendu a été observée dans des échantillons cliniques. Mon projet de stage était axé sur l étude de la spécificité de l anticorps utilisé dans ce test ICC pour différent types de HPV, afin de pouvoir interpréter la nature de la coloration dans un sous-ensemble d'échantillons cliniques. FREMONT Etats Unis 15/07/ /02/2014 Development of the OncoE6TM immunocytochemistry test: elucidating the nature of unexpected positive nuclear staining in clinical samples Human Papillomavirus (HPV) infection is one of the most common sexually transmitted diseases. High-risk (hr) HPVs cause about 99% of cervical cancers, whereas low-risk (lr) HPV types cause benign genital lesions. Worldwide, there are new cases of cervical cancer and deaths annually. The Papanicolaou (Pap) Test is the standard cervical screening method based on cell morphology in the developed countries. However this test is very subjective, resulting in high false positive and false negative rates. Therefore, there is a need for HPV-specific diagnostic tools based on the detection of viral nucleic acids or proteins. The E6 and E7 viral proteins of hr-hpv have been shown to be necessary and sufficient for oncogenic transformation of epithelial cells and for progression to cancer. Hence, E6 is a good marker for detection of high-grade cervical neoplasia. In this context, Arbor Vita Corporation is developing the cytology OncoE6TM immunocytochemistry (ICC) test as an adjunct to the Pap Test. This qualitative ICC assay detects the E6 protein in cervical cytology preparation, and is destined to be used as an aid in the identification of abnormal cells on a microscope slide. During the development phase of the OncoE6TM ICC test, unexpected positive staining was observed in some clinical samples. My internship project focused on the study of the antibody s specificity for different HPV types on ICC format to elucidate the nature of the unexpected positive staining in a subset of clinical samples. Joëlle CHEUZEVILLE BLUEBIRD BIO France maître(s) de stage / Supervisor(s) : Olivier NEGRE Développement d un procédé de purification de vecteurs Lentiviraux par chromatographie d échange d anions La β-thalassémie et la drépanocytose sont deux hémoglobinopathies touchant respectivement et nouveaux nés par an dans le monde. Ce sont des maladies génétiques qui, dans leurs formes les plus sévères, nécessitent des transfusions régulières de culots globulaires. La transfusion permet de maintenir un taux d hémoglobine suffisant dans le sang des patients. Ce traitement doit être renouvelé tous les mois et combiné à une chélation quotidienne du fer. Le seul traitement curatif de ces maladies, avant l arrivée de la thérapie génique, était l allogreffe de cellules souches hématopoïétiques pour les patients disposant d un greffon compatible. La thérapie génique consiste à prélever les cellules souches hématopoiétiques du patient et à y insérer une copie fonctionnelle du gène défectueux grâce à un vecteur de transfert de gène. Les vecteurs Lentiviraux ont montré leur efficacité pour traiter plusieurs maladies génétiques telles que l Immuno Déficience Combinée Sévère liée à l X ou le syndrome de Wiskott-Aldrich. Les cellules génétiquement modifiées sont ensuite greffées aux patients afin de produire dans le sang des cellules contenant la protéine thérapeutique. Les vecteurs Lentiviraux doivent généralement être concentrés avant d être utilisés. La méthode de concentration utilisée actuellement par le laboratoire est l ultracentrifugation. Cette méthode permet d obtenir des suspensions de particules de vecteurs avec un enrichissement de 100 fois et un rendement de 10% à 20%. L ultracentrifugation cause la destruction d'un grand nombre de particules de vecteur et concentre des débris souvent toxiques pour les cellules cibles. Le but de mon stage est de développer une stratégie de purification de vecteurs Lentiviraux par chromatographie d échange d anions, pour augmenter le rendement du procédé et améliorer la pureté du produit final. Après transfection des cellules productrices, le milieu de culture contenant les particules de vecteur est clarifié puis concentré par centrifugation ou purifié par chromatographie. Le titre, nombre de particules de vecteur par millilitre de suspension, est mesuré aux différentes étapes du procédé. Ce procédé sera optimisé pour obtenir un produit final avec le titre le plus élevé possible. PARIS France 16/07/ /01/2014 Development of a Lentiviral vectors purification process by anion exchange chromatography β-thalassaemia and sickle cell disease are both haemoglobinopathies affecting respectively and newborns per year worldwide. In the major forms of these diseases, patients need to be regularly transfused with globular sediment. Transfusions are performed to maintain a sufficient rate of haemoglobin in blood. This treatment has to be renewed every month and combined with a daily iron chelation. The only curative option, before gene therapy, was the allograft of haematopoietic stem cells, although most patients do not have a human-leukocyte-antigen-matched, geno-identical donor. Gene therapy consists in inserting in patient s haematopoietic stem cells a functional copy of the defective gene. This insertion is obtained via a gene transfer vector. Lentiviral vectors have already shown their efficiency to treat several genetic diseases, as X-linked severe combined immunodeficiency or Wiskott-Aldrich Syndrome. Genetically modified cells are then transplanted to the patient in order to produce the therapeutic protein in blood. Lentivectors are usually concentrated before being used. The current concentration method used in the laboratory is ultracentrifugation. With this method, suspensions of vector particles are obtained with a 100 time enrichment and a 10% to 20% yield. A lot of particles are destroyed during ultracentrifugation, and producer cells debris are concentrated. The resulting vector suspension is often toxic for target cells. The aim of my internship was to develop a purification strategy by anion exchange chromatography, in order to increase the yield of the process and to improve the purity of the final product. After transfection of producer cells, the culture medium containing vector particles is clarified and then concentrated by ultracentrifugation or purified by chromatography. The potency (number of vector particles per milliliter of suspension) is measured at different steps of the process. This process will be optimized to obtain a final product with the highest potency. 6

10 EVOLVA maître(s) de stage / Supervisor(s) : Markus SCHWAB Génération d une souche de Saccharomyces cerevisiae pour la production d érythritol REINACH Suisse 15/07/ /02/2014 Generation of a Saccharomyces cerevisiae strain for Erythritol production Alice CIBRARIO L érythritol est un polyol qui dérive de l érythrose-4-phosphate (E4P), un intermédiaire de la phase non-oxydative de la voie des pentoses phosphate. L E4P est un substrat de nombreuses molécules d intérêt pour Evolva mais sa quantification est complexe. En ce sens, l érythritol est un métabolite intéressant pour sa mesure indirecte. Deux enzymes sont impliquées dans la conversion de l E4P en érythritol: une déshydrogenase et une phosphatase. Cette voie existe chez certaines souches de levure et de bactérie mais est absente chez S.Cerevisiae. Le but de mon stage était donc de construire une souche de S.Cerevisiae pour la production d érythritol. Pour chaque enzyme, plusieurs gènes ont été clonés et exprimés chez la levure. La détection de l érythritol par chromatographie a conduit à la sélection des combinaisons de gènes permettant sa production. Dans le but d établir un processus de fermentation en bioréacteur, une souche stable fut générée par intégration des gènes sélectionnés. Pour permettre sa croissance sur milieu minimum, les gènes nécessaires à la restauration de la prototrophie ont été intégrés. Des fermentations en batch seront menées pour évaluer le potentiel de croissance et de production de la souche. Erythritol is a sugar alcohol which is derived from the conversion of Erythrose-4-phosphate (E4P), an intermediate of the nonoxidative part of pentose-phosphate pathway. E4P is a relevant intermediate for several molecules of Evolva s product pipeline and E4P quantification would therefore be interesting to optimize production. Since Erythritol, as a metabolite that leaves the cell, is easier to measure than the intracellular metabolite E4P it can provide a shunt for E4P and thereby function as a surrogate readout for E4P levels. From E4P, a two-step pathway consisting of a dehydrogenase and a phosphatase leads to Erythritol. This pathway exists in some yeast and bacterial strains but is absent in the routinely used S. cerevisiae strain. Therefore, the aim of my internship was to construct a S. cerevisiae strain for Erythritol production. For each enzyme several genes were expressed in yeast upon cloning into vectors that allow expression in yeast. After yeast cultivation, Erythritol was detected in the cell culture supernatant by liquid chromatography to select gene combinations that enabled its production. In order to establish a bioreactor-based fermentation process, a stable strain was generated by integration of the selected genes. To allow growth on minimal medium, pre-existing auxotrophies were removed from the strain by integration of PCR-generated genes. Batch fermentations were then conducted to evaluate its growth potential and Erythritol production levels. BAYER HEALTHCARE PHARMACEUTICALS maître(s) de stage / Supervisor(s) : Hendri TJANDRA Optimisation du Procédé de Purification d un Anticorps Monoclonal BERKELEY Etats Unis 24/06/ /02/2014 Optimization of a Monoclonal Antibody Purification Process Eva COSSON mab2 est un anticorps monoclonal développé dans le but de soigner le cancer de l estomac. Il est actuellement en cours d essais cliniques de Phase I. Le développement et la production de mab2 sont transversaux : le procédé a été développé à Wuppertal en Allemagne et la production des lots cliniques s effectue à Berkeley aux USA. Une production de lots d anticorps destinés aux essais de Phase I a été réalisée à la fin de l année Plusieurs recommandations ont été exprimées pour améliorer l efficacité du procédé et afin que celui-ci soit plus adapté aux opérations et locaux de production à Berkeley pour les productions cliniques à venir. L objectif de mon stage était d optimiser le procédé de purification de l anticorps afin que celui-ci soit plus efficace et plus facile à mettre en œuvre dans les locaux de production. Les études réalisées ont également mené à une meilleure caractérisation des paramètres du procédé de production de mab2. Par exemple, les conditions d élution de l étape de chromatographie protéine A ont été légèrement modifiées afin de permettre la réalisation de la purification sur colonne de protéine A et l inactivation virale sur deux jours différents. Afin de maximiser la productivité de l étape de chromatographie protéine A, les capacités dynamiques de plusieurs résines ont été déterminées. Pour minimiser le nombre d ajustements réalisés sur les intermédiaires du procédé, l ordre des étapes du procédé a été repensé. L impact des changements réalisés sur le procédé a été évalué par analyse des intermédiaires du procédé et/ou de l anticorps purifié à l aide de méthodes telles que l exclusion stérique HPLC et des tests ELISA visant les protéines cellulaires. mab2 is a monoclonal antibody developed for gastric cancer indications. It is currently going through Phase I clinical trials. The development and clinical production of mab2 have been global in nature: process development was done in Wuppertal, Germany, and its clinical production in Berkeley, USA. A Phase I production of the antibody was carried out in late 2012, and a number of recommendations were made to improve process efficiency and to better fit operations/manufacturing facility in Berkeley for future Phase I productions. My internship was focused on optimizing the purification process of the antibody so that it could be more efficient and more convenient to implement in the clinical manufacturing facilities. The studies also led to a better characterization of process parameters used in the manufacturing of mab2 antibody. For example, the protein A elution conditions were tweaked to allow processing of protein A chromatography and viral inactivation on two different days. To maximize productivity of the protein A chromatography, the dynamic binding capacity of protein A resins was determined. To minimize the number of adjustments performed on the process intermediates, the order of process steps was evaluated. The impact of these process adaptions was evaluated by analyzing process intermediates and/or drug substance using analytical methods such as SEC-HPLC and HCP ELISA. 7

11 Camille DELON GLENMARK PHARMACEUTICALS SA maître(s) de stage / Supervisor(s) : Etude préclinique in vitro d un anticorps bispécifique contre le cancer du sein La protéine Her-2 est fortement surexprimée dans 20 à 30% des cancers du sein, c est pourquoi elle constitue la cible de divers traitements contre ces cancers. L approche mise en place par Glenmark Pharmaceuticals SA repose sur l utilisation d un anticorps bispécifique dirigé contre Her-2 et CD3 permettant ainsi de créer un pont entre une cellule cancéreuse et un lymphocyte T cytotoxique et de rediriger l activité lytique de celui-ci de façon spécifique contre les cellules cancéreuses exprimant Her-2. L objectif de ce projet est de développer et conduire des essais pertinents pour tester in vitro le potentiel d efficacité et l innocuité de cet anticorps, dans le but de choisir la dose qui pourra être appliquée aux patients lors de la première phase clinique sans engendrer d effets indésirables. Après avoir développé des essais de lyse redirigée et choisi les conditions optimales pour les effectuer, ces derniers ont permis d évaluer la fenêtre d efficacité de la molécule, c est-à-dire la gamme de concentration pour laquelle on observe une lyse des cellules surexprimant Her-2 sans engendrer la mort les cellules saines. Il a également été possible de vérifier que l utilisation de l anticorps dans cette gamme de concentration n entraine pas de libération systémique de cytokines due à l activation des lymphocytes T lorsqu associée avec des glucocorticostéroïdes. Enfin, la spécificité de l activité biologique de l anticorps a été confirmée puisque ce dernier ne cible que les cellules exprimant Her-2 et n altère pas l intégrité des cellules saines. Ce projet a permis de confirmer l efficacité de l anticorps bispécifique et d établir son innocuité in vitro à une dose de 0,1 pm pouvant être choisie comme MABEL (minimum anticipated biological effect level) pour déterminer une première dose chez l homme. LA CHAUX DE FONDS Suisse 15/07/ /02/2014 Building in vitro preclinical package to validate safety and efficacy of a bispecific antibody targeting breast cancer Human epidermal growth factor receptor 2 (Her-2/Erb-b2) is particularly overexpressed at the surface of 20 to 30% of breast cancer cells and several treatments against Her-2 positive breast cancer target this protein but yet with only limited clinical efficacy. The strategy developed at Glenmark Pharmaceutical is to use a bispecific antibody that bridges Her-2 positive cancer cells and T lymphocytes by targeting Her-2 and CD3, causing a re-directed lysis by cytotoxic T cells leading to the specific killing of cancer cells expressing Her-2. This project aimed to develop and set up assays to establish the safety and efficacy of this bispecific antibody via in vitro assays. This preclinical package will lead to the determination of the first-in-human dose for the clinical phase I. After set up and optimisation of re-directed lysis assays, results showed a good therapeutic window between cells with high level of Her-2 where killing is observed at low dose of antibody, and cells that express low level of Her-2 (similar to normal cells) and that are killed at high concentration. Measure of the cytokine release during these assays also showed that associated with glucocorticosteroids as a comedication, the antibody does not induce massive cytokine release due to the activation of T cells. Results also confirmed that the antibody only targets Her-2 expressing cells and does not affect normal cells. This project demonstrated the safety and efficacy of the antibody and established the in vitro minimal active concentration at 0.1 pm. The latter can be seen as the MABEL (minimum anticipated biological effect level) which can be used to determine a first-in-human dose. SANOFI AVENTIS DEUTSCHLAND GmbH Head Office Germany maître(s) de stage / Supervisor(s) : Harald THUERING Développement et optimisation d un procédé de purification de peptides Francfort Allemagne 01/09/ /02/2014 Development and optimization of a process for peptides purification Lise DEVAL Sanofi, quatrième groupe pharmaceutique mondial en 2012 et numéro deux mondial du diabète, a fait de ce domaine une de ses «plateformes de croissance». En effet, les diabétiques représentent 371 millions de personnes et les prévisions sont de plus de 552 millions de malades pour Sanofi veut ainsi gérer la perte de son chiffre d affaire due à l expiration de nombreux brevets, dont celui de son analogue de l insuline Lantus en 2015, conduisant à la concurrence des génériques. Mon projet concerne de nouveaux peptides obtenus par synthèse chimique et utilisés pour le traitement du diabète de type II qui représente 90% des cas de diabète dans le monde. En soutien à la Chemistry unit, mes missions ont été de mettre en place un procédé de purification en phase inverse à une étape ; de tester la robustesse et l efficacité de ce procédé sur différents peptides candidats et d optimiser ce procédé (par l utilisation de différents ion-pairing agents, colonnes, overloading ) en tenant compte des restrictions dues au futur scale-up du médicament. La purification des peptides après la synthèse est une étape critique du process. En effet, on a une grande similarité et une faible différence de masse entre les peptides cibles et les autres produits de synthèse (la séquence peut varier que d un seul acide aminé). De bonnes conditions d élutions doivent donc être trouvées, pour qu ils ne soient pas élués au même moment. The Sanofi Group is the world's 4th largest pharmaceutical company in 2012, ranking second in diabetes treatments, a therapeutic area that is part of the 7 growth platforms of the company. Moreover, diabetics represent 371 million people globally and it is expected that this figure will rise to 552 million by The Sanofi Group wants to deal with the loss of turnover due to expiry of patents, including the insulin analogue Lantus patent in 2015, which results in generic competition. My project concern new peptides. These are to be obtained by chemical synthesis and used for the treatment of type II diabetes which represents almost 90% of diabetic cases. It consists, in support of the chemistry unit, of developing a process for one step reverse phase peptide purification ; of testing its robustness and efficacy on different peptides candidates and also optimizing this process (by use of different ion-pairing agents, columns, overloading, ), whilst considering the restrictions due to the future scaleup production of the drug. The purification of the peptides after synthesis is a critical and complex step in the process. Because of the similarity and the small mass difference between the target peptides and the others synthesis products (the sequence can just have one amino acid different); elution conditions have to be found, where no elution at almost the same time occurs. 8

12 EUROQUALITY maître(s) de stage / Supervisor(s) : Angeline SERRE Assistance au montage et à la gestion de projets européens BORDEAUX France 22/07/ /02/2014 Consulting in setting up and management of European projects Eléonore DIAS Dans le contexte économique actuel, l innovation est un atout pour les acteurs du marché européen. Ces acteurs sont essentiellement des petites et moyennes entreprises (PME), des centres de recherche publics et privés, des grandes entreprises et des associations. Afin de supporter cette innovation et ainsi renforcer la compétitivité et la croissance européenne, la Commission Européenne a mis en place des programmes de financement pour les projets de recherche collaboratifs. Au fil de l évolution de ces programmes, la place accordée aux PME est devenue de plus en plus importante. En Europe, les PME innovantes sont nombreuses mais n ont pas toujours les moyens de mettre en œuvre leurs projets de recherche et développement (R&D). Dans ce contexte, le cabinet de conseil Euroquality a pour vocation d aider ces entreprises à monter et gérer leurs projets innovants. Au cours de mon stage, j ai donc joué le rôle de consultante en innovation. En assistant la Responsable du Département Santé, j ai participé aux différentes actions qui font le quotidien des consultants en innovation, à savoir le lancement de campagne de prospection d entreprises innovantes dont l activité correspond aux appels d offres européens et/ou nationaux, la rédaction de réponses aux appels d offres émis par les centres de recherche, les pôles de compétitivité et les établissements publics d Etat, la préparation d une proposition de projet en réponse aux appels de la Commission Européenne et le management et le suivi de projets ayant déjà obtenu des financements. Ce dernier aspect ayant été prépondérant, je suis intervenue sur de nombreux aspects : j ai accompli des missions de support dans les démarches entreprises par le coordinateur d un projet durant la phase de négociation avec la Commission Européenne, j ai participé au suivi des différents projets en cours, en organisant et participant à plusieurs conférences téléphoniques, en contribuant à la rédaction de compte-rendu d activité (reporting), en mettant à jour des sites internet, et en apportant mon aide à l organisation d une réunion à Mexico city pour le projet MASCOT. En 6 mois et demi de stage, j ai pu effectuer de manière encadrée puis quasi-autonome les principales activités liées au conseil en montage et gestion de projets innovants à l échelle européenne. In the present economic circumstances, innovation is strength for European market actors. These actors are essentially small and medium enterprises (SMEs), public and private research centers, corporations, and associations. To support this innovation and thus increase Europe's growth and competitiveness, the European Commission has set up funding programs for collaborative research projects. As these programs have evolved, the place accorded to SMEs became more and more important. In Europe, there are many innovative SMEs, but they are not always financially able to concretize their own Research and Development projects alone. In this context, Euroquality aims therefore at providing support to these enterprises to set up and manage their innovative projects. During my internship, I consequently worked as a consultant in innovation. By assisting the Head of Health Unit, I have been involved in the daily tasks of a consultant in innovation, which are the launching of prospection campaign of innovative enterprises whose activities match the European and/or national funding calls, the writing of competitive tenders published by research center, competitiveness clusters and state-owned public establishment, the preparation of a proposal targeting a European Commission call, and the management and follow-up of the already funded projects. This last task was the most important and I took part in several aspects: I have provided support to a project coordinator during the negotiation phase with the European Commission, I have taken part to the follow-up of the different ongoing projects through organization and participation to phone conferences and website updating, assistance in technical report drafting, and contribution to the organization of a meeting in Mexico City for MASCOT project. In a six months and a half - internship, I was given the opportunity to carry out the main consulting activities in setting-up and managing of European innovative projects, first under the supervision of my tutor and then almost autonomously. NEW ENGLAND BIOLABS Inc. maître(s) de stage / Supervisor(s) : Henry ZHU Expression dans E. coli, purification et caractérisation d enzymes TET IPSWICH Etats Unis 22/07/ /02/2014 Expression, purification and characterization of E.coli expressed TET dioxygenase enzymes Hanna EL FEZZAZI Les protéines Ten-Eleven-Translocation (TET 1, 2, 3) sont des dioxygénases Fer (II) et alpha cétoglutarate-dépendantes capable de modifier l état d oxydation d un marqueur épigénétique bien connu, la 5-methylcytosine (5mC) de l ADN. Les enzymes TET catalysent l oxydation de 5mC en 5- hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) et 5-carboxycytosine (5caC), qui sont de potentiels intermédiaires dans l active déméthylation de l ADN. La grande taille des protéines TET rend leur expression et leur repliement correct dans E. coli difficiles. Un de mes projets s est donc concentré sur la recherche d un domaine catalytique (CD) minimal des protéines TET. Trois délétions différentes ont été introduites dans le gène TET 2CD de souris et une fois les protéines exprimées dans E. coli et purifiées, leur activité a été testée par suivi de la conversion de 5mc en 5hmC, 5fC et 5caC par chromatographie liquide-spectroscopie de masse (LC/MS). Des résultats préliminaires indiquent qu une des délétions dans le gène TET2 CD de souris a conduit à une protéine moins dégradée et avec une meilleure activité que la protéine TET sans délétion. Des expériences supplémentaires ont permis d obtenir une protéine plus pure, d optimiser les conditions réactionnelles et obtenir une meilleure activité sur l ADN génomique. Une expression et une purification réussie de protéines TET actives pourraient s avérer être un outil pour la biologie moléculaire. Ten-eleven-translocation proteins (TET 1, 2, 3) are Fe (II) and α-ketoglutarate-dependent dioxygenases able to modify the oxidation status of a well-characterized epigenetic mark, the 5-methylcytosine (5mC) of DNA. TET enzymes catalyze the iterative oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxycytosine (5caC), which are potential intermediates in the process of DNA active demethylation. The big size of TET makes it a challenge to express and fold the protein correctly in E. coli. Thus one of my projects focused on finding the minimal catalytic domain of TET proteins. Three different deletions in the catalytic domain (CD) of mouse TET2 gene were designed and once the proteins expressed in E. coli and purified, their activity was tested by monitoring the conversion of 5mC to 5hmC, 5fC and 5caC with liquid chromatography-mass spectroscopy (LC/MS). Preliminary results indicate that one of the deletions in mouse TET2CD led to a protein with less degradation and higher activity than the full-length CD. Further experiments were carried out to increase the purity of the protein, optimize its reaction conditions and its activity on genomic DNA substrates. The successful expression of active TET enzymes could lead to useful reagents for the molecular biology research. 9

13 GLENMARK PHARMACEUTICALS SA maître(s) de stage / Supervisor(s) : Martin BERTSCHINGER Caractérisation des mécanismes impliqués dans l instabilité d expression des cellules CHO S recombinantes. LA CHAUX DE FONDS Suisse 15/07/ /02/2014 Characterization of expression instability mechanisms in recombinant CHO S cells Lauriane GAMAND Un procédé de production d anticorps recombinants monoclonaux en cellules de mammifères requiert une lignée cellulaire capable de maintenir un haut niveau d expression ainsi que l intégrité de la protéine d intérêt pendant un grand nombre de générations cellulaires. De la décongélation d une banque jusqu à la récolte d un bioréacteur de 1000L, un clone aura typiquement traversé plus de 60 dédoublements. Une diminution du niveau d expression de l anticorps durant cette période entraîne une baisse de rendement et donc une augmentation des coûts de production. La propension de la cellule hôte CHO pour l instabilité d expression a été largement documentée dans la littérature et continue de faire l objet de nombreuses investigations. Plusieurs mécanismes conduisant à une diminution du niveau de transcription de la protéine d intérêt ont été décrits, tels que la perte de copies des transgènes introduits dans le génome, la modification de la structure de la chromatine, ou encore la méthylation de l ADN génomique des cellules La stratégie de génération et de criblage des clones mise en place à Glenmark Pharmaceuticals vise à sélectionner les clones ayant le meilleur niveau d expression et un phénotype stable. La compréhension des mécanismes d instabilité chez certains clones de cette plateforme reste un enjeu capital pour minimiser de manière rationnelle l apparition de phénotypes instables. L objectif de ce projet est de déterminer les causes de l instabilité de différents clones recombinants générés au sein de la plateforme de développement cellulaire de Glenmark. Dans un premier temps, un nouveau système dynamique de culture à haut débit en plaque 96 puits a été mis en place afin de permettre l étude de nombreux clones en parallèle. Plusieurs clones ont ainsi pu être maintenus en culture durant un grand nombre de générations et la stabilité de chaque clone a pu être décrite lors de procédés de types batch et fed-batch. Dans un deuxième temps, des phénomènes épigénétiques ont été mises en évidence comme étant à l origine de l instabilité d expression. Enfin, des stratégies visant à éviter l émergence de clones instables ont été étudiées. Des éléments régulateurs ont notamment été inclus dans les constructions des vecteurs et leur impact sur la stabilité a été analysé, montrant que certains éléments étaient efficaces pour augmenter la stabilité de l expression des cellules CHO-S. The production of recombinant monoclonal antibodies in mammalian cells requires cell lines maintaining a high expression level of the protein of interest during long-term culture. From the thawing of a cell bank until the harvest of a 1000L bioreactor, a clone would typically have experienced more than 60 doubling events. During this period, a decrease of the expression level of the antibody would cause lower yields and consequently an increase of the production costs. Expression instability in CHO cells has been widely described in the literature and is still the focus of many investigations. Several mechanisms have been observed such as loss of transgene copies integrated in the genome, modification of the chromatin structure, or methylation of the genomic DNA eventually leading to a decrease of the transcription level of the protein of interest. The cell line development platform established at Glenmark Pharmaceuticals has been optimized for the selection of high expressing and stable clones. Nevertheless, the understanding of the silencing mechanisms occurring in unstable cell lines remains of high interest in order to rationally optimize the platform and further reduce the frequency of these unwanted phenotypes. The aim of this project is to elucidate the causes of instability in clones generated with Glenmark s platform. The first step was to develop and validate a new dynamic culture system in 96 well-plate allowing the study of several cell lines in parallel in an efficient manner. Several clones were maintained in culture over an extended number of generations and the stability of each clone has been assessed in batch and fed-batch processes. In a second part of this work, epigenetic events were evidenced as causes of the expression instability. Finally, strategies to avoid the emergence of unstable clones were investigated. In particular, the effect on the stability of different regulatory elements included in vector constructs was studied, and elements were found to be efficient to increase the expression stability in CHO-S cells. -L'ENSTBB n'est pas autorisée à communiquer le nom de cette entreprise- *** -ENSTBB is not authorized to communicate the name of this companymaître(s) de stage / Supervisor(s) : Carole URBACH Purification et caractérisation d une protéase présentant un intérêt thérapeutique CAMBRIDGE Royaume Uni 15/07/ /02/2014 Purification and characterisation of a protease of therapeutic interest Amandine GEORGES Les protéases font partie des cibles majoritaires en thérapie; toutefois elles sont moins reconnues pour leur utilisation comme molécules à visée thérapeutique. Dans un marché dominé par les anticorps, l intérêt des protéases réside notamment dans le fait qu une seule molécule peut inhiber un grand nombre de cibles, et ceci de façon irréversible. Cette propriété pourrait potentiellement permettre de réduire les doses thérapeutiques et les effets secondaires associés à l utilisation d anticorps. Dans le but d exploiter ce potentiel, MedImmune a sélectionné une protéase capable de cliver spécifiquement une cible thérapeutique. Néanmoins, celle-ci possède une activité autolytique non négligeable et est sensible aux protéases endogènes présentes dans le sérum, inconvénient majeur pour son application en thérapie. Des techniques d évolution dirigée ont donc été employées pour isoler des mutations permettant d augmenter sa stabilité tout en conservant son activité originelle. Le principal objectif de mon stage consiste à mettre en œuvre des techniques appropriées pour la caractérisation de l activité et de la stabilité des différents mutants de protéases, afin de procéder par la suite à leur analyse comparative. Avant d être testées, les protéases sont pour cela produites en cellules mammifères HEK (Human Embryonic Kidney) puis purifiées sur colonne par IMAC (Immobilized Metal ion Affinity Chromatography). Ce projet vise également la production de molécules fluorescentes de type FRET, composées de fluorochromes fusionnés aux extrémités N et C terminales de la séquence de clivage spécifiquement reconnue par la protéase, permettant ainsi le suivi en temps réel de l activité protéolytique Proteases are among the most targeted molecules in therapy, however they are not well-recognized for their use as therapeutics yet. In a sector dominated by antibodies, the interest of proteases lies in the irreversible neutralisation of a number of targets by only one molecule, potentially allowing the reduction of doses and avoiding related side effects. In order to exploit this potential, MedImmune has selected a protease for its ability to specifically cleave a validated target. Nevertheless, this protease is prone to autolysis and susceptible to endogenous serum proteases; the resulting instability of this protease appears to be a major drawback for its use in therapeutic applications. Directed evolution techniques were employed in order to identify mutations that could enhance the stability of the protease while maintaining its original level of activity. The main objective of my internship is to implement relevant methods for the comparative characterisation of the activity and stability of the different protease mutants. For this purpose, the proteases are produced in HEK cells (Human Embryonic Kidney) and then purified by IMAC (Immobilized metal ion affinity chromatography) before being tested. In order to monitor the proteolytic activity in real time, this project also aims at producing FRET-based molecules, composed of fluorescent proteins fused at the N and C-terminus of the cleavage sequence specifically recognised by the protease. 10

14 MERCK BIODEVELOPMENT maître(s) de stage / Supervisor(s) : Aurore LAHILLE, Sonia BEAUDEAN Evaluation de la qualité des anticorps monoclonaux sur harvest Molecule Quality on Harvest MARTILLAC France 15/07/ /02/2014 Armelle GILLETTA DE SAINT JOSEPH Le marché des anticorps a connu une réelle expansion ces dernières années dans le milieu pharmaceutique, et ces molécules prennent aujourd hui une place importante parmi les protéines thérapeutiques en cours de développement. Ces protéines, comme toute molécule destinée à l injection humaine, nécessitent un contrôle très strict de ses caractéristiques physico-chimiques. La caractérisation de la qualité de la molécule produite est donc primordiale depuis les phases de sélection clonale et de développement jusqu aux phases de production. Un travail de recherche bibliographique a donc été réalisé afin de comparer les méthodes actuelles d analyse des molécules produites en culture cellulaire. La qualité de ces molécules est entre autre évaluée par étude des modifications post traductionnelles, plus particulièrement des glycosylations qui sont très majoritairement liées au procédé de culture cellulaire. Il n existe malheureusement pas de technique actuellement disponible permettant d étudier les glycosylations sur des échantillons de culture, il est donc nécessaire de purifier la molécule d intérêt avant analyse. De plus, la production en parallèle dans différents bioréacteurs génère chaque jour plusieurs échantillons de faibles volumes, pour limiter les quantités prélevées. Ainsi, l un des premiers objectifs du projet a donc été de mettre en place un protocole de capture «high throughput» des anticorps à partir de surnageant de culture en testant différents dispositifs disponibles sur le marché. L amélioration de l analyse des glycosylations est un second objectif du projet qui sera réalisé par électrophorèse capillaire. Over the last years, monoclonal antibodies are more and more present on therapeutic markets and are a significant class of molecule under development. As these molecules are used for human injection, they require a close control of their physicochemical characteristics. Molecule quality assessment is required from clonal selection and process development stages, to large scale production of the molecule. In this project, a literature research was performed to compare different analytical methods available on molecule produced in cell culture. Molecule quality can be studied through post translational modifications, and especially glycosylations which mainly depend on cell culture conditions. Unfortunately, there is no technique able to analyze glycosylations directly on harvest samples, so it is necessary to purify the molecule prior to analysis. Furthermore, several cell culture systems are launched in parallel, creating multiple daily samples with low volumes, to limit the amount of molecule removed every day. One of the first objectives was to deliver a high-throughput protocol to purify antibodies from harvest. Thus, different systems available on the market have been assessed and compared. The improvement of the glycosylation analytical method was the second objective defined. This will be performed with capillary electrophoresis methods. ADISSEO France SAS CINABio maître(s) de stage / Supervisor(s) : Anne-Sophie COTTEAU Production d intermédiaire de synthèse par fermentation TOULOUSE France 19/08/ /02/2014 Production of a synthetic intermediate by fermentation Alfonso Manuel GONZALEZ FLORES La molécule X est une molécule produite par différents microorganismes. Cette molécule peut être utilisée dans plusieurs secteurs comme combustibles, pharmaceutique, plastique et notamment comme molécule intermédiaire dans la production d additifs alimentaires pour la nutrition animale. Le but de ce stage est de valider la plate-forme de production proposée pour la production de la molécule X en faisant une transposition du procédé aux fermenteurs présents dans le laboratoire et de déterminer les conditions optimales de fermentation pour la bioproduction de la molécule X à partir d une souche modifiée de levure ainsi que, dans la mesure du possible, de réaliser des améliorations nécessaires afin d obtenir un procédé transposable à l échelle industrielle. The molecule X can be produced by different microorganisms. This molecule has extensive industrial applications in different sectors such as fuels, pharmacological, plastics and especially as an intermediate molecule in the production of a food additive for animal nutrition. The main aim of this internship is to validate the production process of the molecule X by a transposition of the process into the bioreactors found in the laboratory and to define the optimal conditions of fermentation to bio-produce the molecule X using a modified yeast strain; and to make the necessary improvements to obtain a replicable process on an industrial scale. MERCK BIODEVELOPMENT maître(s) de stage / Supervisor(s) : Virginie PERRIER, Sandrine FISCH Mise en place et développement d une plateforme de culture générique pour la levure Pichia pastoris MARTILLAC France 15/07/ /01/2014 Implementation and development of a generic platform for Pichia pastoris culture Laurianne GOYON Le site Merck Serono Biodevelopment de Martillac a récemment élargit son activité au développement et à la production de molécules recombinantes à partir de micro-organismes dont Escherichia coli et Pichia Pastoris en milieux semi-complexes. Dans le but de réduire la complexité, le coût et le temps du développement des procédés liés à l arrivée des nouveaux clones, le département de développement souhaite mettre en place une plateforme «générique» pour la levure P. pastoris. L objectif de ce stage a été de développer l étape de fermentation de cette plateforme. Le projet a débuté par la mise en place d un système de culture en microplaque (Système Duetz Enzyscreen ) afin de miniaturiser la fermentation et de permettre un criblage haut débit. Le système a été évalué selon deux aspects : la croissance en batch, et la simulation du procédé fed-batch et de l induction. Après validation du système pour l étude de la croissance de P. pastoris, le projet a consisté à développer un milieu de culture chimiquement défini selon une stratégie de simplification. L établissement de plans d expériences a permis d évaluer l impact individuel de chaque élément du milieu afin de ne conserver que ceux essentiels à la croissance. Suite au criblage, des essais ont été mis en œuvre pour optimiser les concentrations et mettre en évidence des interactions entre les éléments. En parallèle, le croisement des données issues du criblage et de la simulation du procédé en microplaque ont permis d évaluer la capacité de P. pastoris à produire la molécule d intérêt dans le milieu minimum retenu sur des bioréacteurs de 1 litre (système Cellferm-pro, DasGip ). Merck Biodevelopment Martillac has recently extended its activity to the development and the production of heterologous proteins by micro-organisms such as Escherichia coli and Pichia pastoris using semi-complex culture media. In order to limit development process costs, complexity and duration linked to new clone implementation, the development unit aims to set up a generic platform for Pichia pastoris. The goal of this internship was to develop the fermentation step of the platform. First, a 24-well plate system, Duetz System by Enzyscreen, has been implemented for fermentation miniaturization and high throughput screening purposes. Two aspects were evaluated: growth during a batch process, and evolution of biomass and protein production from the overall process simulation. After system validation for growth studies, a chemically defined medium has been developed according to a simplification strategy. The establishment of design of experiments was used to assess the individual impact of each element in order to retain only those essential for growth. After this screening, attemps were carried out to optimize elements concentrations and to highlight interactions between the compounds. At the same time, screening and simulation fed-batch data were used to evaluate P. pastoris ability to produce the molecule of interest on the selected minimal medium using a 1-liter bioreactor (Cellferm-pro system, DasGip ). 11

15 CEVA PHYLAXIA Ltd maître(s) de stage / Supervisor(s) : Jérôme THEVENON, Zoltan ROZSNYAY Etapes de validation d un test cohémolytique Analyse et évaluation de différents modèles d'un vaccin porcin BUDAPEST Hongrie 17/01/ /01/2014 Validation steps of a cohemolytic assay Evaluation of swine vaccine prototypes Juline GUENAT La production de vaccins à usage vétérinaire est un processus complexe. Les étapes essentielles comprennent la fermentation des bonnes souches pathogènes, des contrôles pertinents du procédé, la quantification des antigènes clés, des contrôles qualités et une assurance qualité. Un vaccin de nouvelle génération est en cours de développement chez Ceva, il est destiné à combattre une maladie infectieuse responsable de pertes économiques considérables en élevage porcin. Le profil cible du vaccin inactivé doit répondre à une qualité optimisée, une bonne innocuité et une meilleure efficacité. De nouveaux adjuvants sont à l étude en raison de leur potentiel à renforcer la réponse immunitaire. Ils permettent de surpasser la possible interférence négative des anticorps d origine maternelle chez les jeunes animaux, et ainsi d induire une immunité de longue durée sans avoir recours à une deuxième vaccination. Au cours de ce stage, trois objectifs majeurs ont été définis. Dans un premier temps, une vue d ensemble du procédé de fermentation et des méthodes de caractérisation des souches et des antigènes associés à la production de vaccins a été étudiée. Dans un second temps, un test de cohémolyse a été développé et validé afin d'assurer le contrôle de l état d inactivation des exotoxines bactérienne. Ces dernières correspondent aux antigènes clés de la protection du vaccin. Les étapes de validation et de performances du test de cohémolyse ont été démontrées et discutées. Dans un dernier temps, de nouveaux vaccins adjuvés ont été étudié dans des études d innocuité de d efficacité. Parmi les dix-sept vaccins candidats et les différents contrôles, deux formulations expérimentales ont montré une efficacité significativement plus élevée avec un taux acceptable d effets indésirables. Une loi dose-effet sur ces derniers sera établie dans un futur proche. La définition finale du produit correspondra au meilleur équilibre entre l innocuité et l efficacité. The veterinary vaccine manufacturing is a complex process in which the critical aspects include fermentation of the proper pathogen strains with the right in process measurements, quantitative determination of the key antigens, the appropriate blending with adjuvant components, quality controls and quality assurance. Ceva is developing a new generation vaccine against an infectious swine disease responsible for important economic loss. This killed vaccine product upgrading refers mainly to an improvement in safety and efficiency. New adjuvant products are being screened to further optimize the protective vaccination by overcoming the interference caused by the maternal antibodies in the suckling piglets and by extending the duration of immunity without the requirement of a booster vaccination. In the course of this internship, three major objectives were set. The first one was to overview the fermentation process, the strain and product characterization methods associated with the vaccine production. The second objective was to develop and validate a cohemolytic assay as an in-process inactivation control to monitor the detoxification of bacterial exotoxins that serves as key protective antigens in the vaccine. The individual validation steps and the performance of the cohemolytic assay were demonstrated and discussed. The third objective was to investigate the safety and potency profile of vaccine prototypes utilizing different adjuvants models. Among seventeen vaccine candidates and several controls, two experimental formulations exhibited significantly higher potency and an acceptable level of adverse reactions. Using these two best vaccine prototypes, a new antigen dose-effect studies will be performed to select the best balanced safety-efficacy in terms of product definition. VAXINE Pty Ltd maître(s) de stage / Supervisor(s) : Nikolai PETROVSKY Evaluation de la réponse immunitaire humorale humaine suite à une immunisation contre la grippe BEDFORD PARK Australie 29/07/ /01/2014 Assessment of human humoral immune responses to influenza immunization Blandine JOUVENAUX L évaluation de l efficacité du vaccin contre la grippe est essentielle pour son développement. Il existe actuellement trois méthodes de choix permettant de détecter les anticorps spécifiques du vaccin contre la grippe : Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA), le test de l Inhibition de l Hémaglutination (HI) et le Test de MicroNeutralisation (MNT). Toutes ces méthodes permettent de détecter les anticorps spécifiques du vaccin mais différemment. La technique ELISA mesure un isotype particulier d anticorps, par exemple les immunoglobulines G (IgG), dirigé contre les antigènes contenus dans le vaccin. Le test HI mesure les anticorps qui bloquent le site de liaison au récepteur viral de la protéine hémagglutinine. Enfin, le MNT mesure l ensemble des anticorps empêchant l infection des cellules par le virus. Cette dernière technique permet ainsi la détermination plus précise du titre d anticorps corrélé à une protection. Le but de mon projet de stage était d optimiser et de valider la méthode pour évaluer le titre d anticorps permettant une protection chez les sujets vaccinés et ainsi déterminer quelle méthode est la plus appropriée pour le développement de vaccins. Le test HI a été la méthode principalement utilisée pour étudier les réponses immunitaires suite à une vaccination contre le virus de la grippe A/H1N1pdm09. Cependant, le MNT s est révélé être plus sensible et plus spécifique que le test HI. Dans cette étude, le MNT a été réalisé avec des sérums collectés à partir de 148 sujets pour détecter les anticorps avant et 28 jours après immunisation. Avant d effectuer le MNT, les cellules MDCK et les virus ont été cultivés, le titre de chaque virus utilisé a dû être déterminé et les sérums ont été traités avec une enzyme détruisant le récepteur (RDE) afin d éliminer les inhibiteurs non-spécifiques. Evaluation of the efficacy of influenza vaccine is essential for vaccine development. Currently, three methods of choice exist in terms of their ability to detect antibody responses specific to influenza vaccine: Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA), Haemagglutination Inhibition (HI) assay and MicroNeutralisation Test (MNT). All of these methods enable measurement of antibodies specific to the vaccine but differently: ELISA measures individual antibody isotypes, e.g. IgG, against all the vaccine contained antigens, HI assay measures antibodies that block the viral attachment receptor site on the hemagglutinin protein and MNT measures total antibodies that are able to block the ability of the virus to infect cells, and thus may determine the antibody level correlated with protection more precisely. The aim of my internship project was to optimize and validate the method to evaluate the level of protective antibody in vaccinated subjects and thus determine which method is the most appropriate for vaccine development. HI assay has been the main method used to investigate immune responses to vaccination against influenza A/H1N1pdm09 virus. However MNT has been reported to be more sensitive and more specific than HI assay. In this study, MNT was performed to detect antibody responses in serum pairs collected from 148 immunized subjects before and 28 days after vaccination. Before carrying out the MNT, MDCK cells had to be cultivated, virus expanded, the titer of viruses calculated and sera treated with Receptor Destroying Enzyme (RDE) to remove nonspecific inhibitors. 12

16 VAXINE Pty Ltd maître(s) de stage / Supervisor(s) : Nikolai PETROVSKY Etude de la réponse immunitaire post vaccination chez des sujets Humains BEDFORD PARK Australie 29/07/ /01/2014 Study the immune responses post vaccination in Human subjects Emeline LARONDEAU Influenza, plus communément connu sous le nom de grippe, est une maladie infectieuse causée par des virus a ARN, et qui peut engendrer des hospitalisations ou même être fatales chez certains groupes a risque (les plus jeunes, les personnes âgées ou à maladie chronique). Les épidémies annuelles d Influenza entrainent à l échelle mondiale de trois à cinq million de cas de maladies graves, et de à morts. La vaccination est à l heure actuelle le moyen le plus efficace de prévenir cette maladie ou ses conséquences dramatiques. Même si des vaccins sûrs et efficaces sont disponibles depuis plus de 60 ans, l efficacité reste limitée par la variabilité antigénique, liées aux dérives antigéniques et cassures antigéniques. Le but de ce projet a été d étudier la réponse immunitaire post-vaccination chez des sujets humains, en analysant les échantillons d un précédent essai clinique. Pour chacun des patients, les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) ont été isolées avant vaccination, puis à différentes semaines de l étude, semaines 1, 2 et 3 après vaccination et ont ensuite été cryopréservées. Après immunisation ou infection, les lymphocytes B commencent à se différencier. Une semaine après vaccination, un pic de plasmablastes, hautement enrichi en cellules secrétant l antigène vaccin-spécifique, apparait dans le sang périphérique. Cela peut être utilisé pour analyser la réponse des lymphocytes B au vaccin, d autant plus que ces cellules ne nécessitent pas une sélection antigène-spécifique. Ce genre d étude est possible car les plasmablastes sont identifiables par cytométrie en flux, basée sur l expression de marqueurs de surface bien définis. Au cours de ce projet, les plasmablastes des semaines 1 et 2 ont été triés et la fréquence des plasmablastes a été calculée pour chaque sujet de l étude. Puis, les résultats obtenus pour les autres analyses réalisées sur les sujets de cet essai clinique (ELISA) ont été mis en relation pour permettre une analyse globale de cet essai clinique. Influenza, commonly referred to as the flu, is an infectious disease caused by RNA viruses which can result in hospitalizations and deaths mainly among high-risk groups (the very young, elderly or chronically ill). Worldwide, Influenza annual epidemics result in about three to five million cases of severe illness, and about to deaths. The most effective way to prevent the disease or severe outcomes from the illness is vaccination. Even if safe and effective vaccines have been available and used for more than 60 years, vaccine effectiveness is limited by antigenic variability, which occurs by antigenic drift or shift. The aim of my project was to study immune responses post-vaccination in human subjects by analysing samples from a previously conducted clinical trial. For each patient, peripheral blood mononucleated cells (PBMC) were isolated before vaccination and at different weeks of the study, weeks 1, 2 and 3 post-vaccination and then cryopreserved. After immunization or infection, activated B cells started to differentiate. So on day 7 after vaccination, a burst of plasmablasts, highly enriched for vaccine-specific antibody secreting cells, appears in the peripheral blood. This can be used to analyse the B cell response to the vaccine and these cells don t need to be selected based on antigen specificity. This kind of study is possible because plasmablasts are identifiable by flow-cytometry based on the expression of well-defined surface markers. As part of the project, plasmablasts from week 1 and week 2 post-immunization samples were sorted and the plasmablast frequencies were calculated for each subject in the trial. Then, the results obtained by other assays performed on subjects in this study (ELISA) were analysed and combined with the plasmablast data to provide more information about this clinical trial. NOVIMMUNE SA maître(s) de stage / Supervisor(s) : Giovanni MAGISTRELLI Expression et caractérisation de mélanges d anticorps recombinants PLAN LES OUATES Suisse 01/08/ /02/2014 Expression and characterization of recombinant antibody mixtures Morgane LE BRAS Les anticorps monoclonaux sont des biomolécules thérapeutiques spécifiques qui connaissent un large essor dans le traitement de diverses pathologies. Cependant, dans de nombreux cas, cibler une unique molécule ne permet pas d atteindre une efficacité maximale. C'est pourquoi NovImmune se concentre actuellement sur une nouvelle génération de produits thérapeutiques : les mélanges d anticorps polyclonaux recombinants. Cette nouvelle approche pourrait avoir plusieurs avantages. En effet, elle permettrait d améliorer l'efficacité des traitements grâce à l utilisation d une large gamme d'anticorps dirigés contre plusieurs cibles ou epitopes (à la différence des anticorps monoclonaux). Mon stage a consisté à développer l expression et la génération de mélanges d'anticorps recombinants. Dans une première partie, différents candidats monoclonaux liant différents epitopes ou cibles ont été sélectionnés selon leurs caractéristiques (affinité, liaison spécifique à la cible). Ces anticorps ont été exprimés dans des cellules de mammifères, seuls ou co-exprimés en utilisant un unique vecteur comprenant plusieurs promoteurs. Après purification, l'expression de chaque anticorps exprimé dans les mélanges a été estimée par de multiples méthodes analytiques (Agilent, IEF et FACS). L efficacité des mélanges d anticorps a été évaluée et comparée à celle des anticorps monoclonaux à l aide d essais spécifiques et fonctionnels. Monoclonal antibodies represent an expanding class of specific therapeutics that has shown great success to treat a variety of diseases. However, in many cases, targeting a single molecule is not sufficient to achieve therapeutic efficacy. That s why Novimmune is currently focusing on a next generation of antibody therapeutics, the recombinant polyclonal antibody mixtures. This new approach may have several advantages. Indeed, using a wide range of antibodies directed against different targets or/and epitopes (contrary to monoclonal antibodies) could improve the potency and efficacy of treatments. In my internship, I developed an approach to generate and characterize recombinant antibody mixtures. In a first part, different monoclonal candidates binding non-overlapping epitopes or distinct targets were selected according to their characteristics. These antibodies were expressed in mammalian cells alone or co-expressed, using a single vector containing multiple promoters. After purification, the level of expression of each antibody expressed in the mixture was determined by multiple analytical methods (Agilent, IEF, and FACS). In a second time, we evaluated the potency of these mixture compared with the monoclonal antibodies by relevant and functional assays to observe an eventual improvement of their effect. 13

17 VAXINE Pty Ltd maître(s) de stage / Supervisor(s) : Nikolai PETROVSKY Mécanismes cellulaire et moléculaire de l action d un adjuvant vaccinal BEDFORD PARK Australie 29/07/ /02/2014 Cellular and molecular mechanism of vaccine adjuvant action Morgane LECOINTRE Contrairement aux vaccins conventionnels basés sur des pathogènes entiers atténués ou inactivés, les vaccins reposants sur des antigènes pures solubles, recombinants et synthétiques sont plus surs, mieux tolérés mais souvent bien moins immunogènes. C est pourquoi l addition d un adjuvant est généralement nécessaire. Le produit phare de Vaxine est un adjuvant polysaccharidique commercialisé sous le nom d Advax. De nombreuses études, pour une gamme variée de vaccins, ont démontré qu Advax avait la capacité d activer à la fois les réponses immunitaires humorale et cellulaire spécifiques de l antigène qui lui était associé sans aucune réactogénicité, contrairement à l hydroxyde d aluminium et aux émulsions huile-eau. Advax est donc un adjuvant candidat idéal. Cependant, son mécanisme d'action n'a pas encore été totalement élucidé. Le but de ce projet était d étudier in vitro son action à l échelle moléculaire et à l échelle cellulaire. Pour cela, différentes cellules immunitaires isolées à partir de sang humain ont été cultivées et induites par Advax. La sécrétion de plusieurs cytokines a alors été étudiée et mesurée par ELISA sandwich. Afin d obtenir des informations en termes de sécurité et de réactogénicité, tout un ensemble d autres adjuvants a été inclus dans les expériences. Au niveau cellulaire, des expériences de liaison ont été réalisées. Différentes populations cellulaires ont été cultivées en présence ou en absence de l adjuvant, et la liaison a été évaluée par cytométrie de flux dans le but d appréhender les interactions cellulaires avec Advax. De plus, les voies de signalisation potentielles ont également été étudiées par des méthodes d ELISA, de Western Blot ou encore de RT-qPCR, afin de comprendre les mécanismes de faible réactogénicité d Advax. Unlike conventional vaccines based on live and killed whole pathogens, vaccines relying on pure soluble, recombinant and synthetic antigens are safer, better tolerated, but often much less immunogenic. This is why addition of an adjuvant is generally needed. The lead product of Vaxine is a polysaccharide adjuvant that goes under the trade name Advax. Many studies demonstrated that Advax had the ability to promote both humoral and cellular antigen-specific immune response across a broad range of vaccines without any reactogenicity, unlike aluminium hydroxide and oil-in-water emulsions. Thus, Advax is an ideal adjuvant candidate. However, its mechanism of action has not been fully elucidated yet. The purpose of this project was to investigate in vitro its action at the molecular and cellular levels. To do so, different immune cells isolated from human blood were cultured and induced with Advax. Secretion of several cytokines was then studied and measured by sandwich ELISA. In order to get notions about safety and reactogenicity, a whole set of other adjuvants was also included in the experiments. At the cellular level, binding experiments were performed. Different cell populations were cultured with or without labelled Advax and binding was assessed by flow cytometry in order to understand cellular interactions with the adjuvant. Furthermore, the potential signalling pathways have also being studied by using ELISA, Western Blot or RT-qPCR methods to understand the mechanisms of low reactogenicity of Advax. KYMAB Ltd maître(s) de stage / Supervisor(s) : Ian KIRBY Epitope mapping d un antigène cible CAMBRIDGE Royaume Uni 15/07/ /02/2014 Epitope mapping of a target antigen Emeline LUDWIG Dans le but d apporter des solutions thérapuetiques à diverses maladies, beaucoup d entreprises ont développé des anticorps dirigés contre un antigène cible connu pour être impliqué dans le développement des tumeurs. Ces anticorps sont des agonistes, ils vont donc bloquer la liaison entre la cible et son récepteur, ce qui devrait minimiser les effets de la maladie. Le but de mon stage était de développer une méthode pour analyser et définir les acides aminés impliqués dans la liaison de cet antigène cible à différents anticorps, dans le but de l utiliser par la suite quelque soit l antigène cible étudié. Pour cela, une méthodologie a été créée afin de rapidement synthétiser, produire et analyser toutes les mutations ponctuelles par une alanine sur la totalité de la sequence d acides aminés de cet antigène. Cette méthode a été optimisée à l échelle de plaques 96 puits afin de minimiser l utilisation de réactifs et donc les coûts. As a part of the research and discovery process, a lot of companies have produced antibodies against a target antigen that is known to be implicated in the tumour development process. These agonistic antibodies block binding of this target antigen to its receptor and hence would be expected to moderate the disease. The aim of my internship project was to develop a method to try and define the amino acids involved in the binding of various antibodies to this tumour antigen, which could be consequently used for any other target. To achieve a methodology was designed to rapidly synthesise, express and analyse alanine scan mutations in the whole of the tumour antigen amino acid sequence and a 96 well scale to minimise reagent usage and costs. CRUCELL maître(s) de stage / Supervisor(s) : Sarah MERCIER LEIDEN Pays Bas 20/08/ /02/2014 «Utilisation du chemostat pour la compréhension des cultures de cellules PER.C6» Use of Chemostat for understanding of PER.C6 cultures Charline MAIGNAN La lignée PER.C6 est dérivée d une cellule rétinienne humaine dans laquelle de l ADN recombinant a été inséré afin de permettre aux cellules de se répliquer indéfiniment. La première partie du projet a consisté à mettre en place un chemostat pour la lignée cellulaire avec des conditions optimales afin que les cellules PER.C6 atteignent un "steady state". Les paramètres tels que la température, le ph et la vitesse d agitation avaient été préalablement fixés à leur valeur de consigne optimale. Dans le cadre de ce projet, différents tubes pour extraire la culture du bioréacteur ainsi que différents débits ont été testés. Les caractéristiques intrinsèques de la lignée PER.C6 ont alors été déterminées à un taux de dilution donné. Ainsi, en parallèle, le modèle de fichier Excel utilisé dans les autres expériences du département USP a été adapté afin de correspondre aux conditions de chemostat, c.-à-d. les formules de taux de consommation (ou production) des nutriments, le calcul du taux de croissance ainsi que celui du temps de doublement de population ont été modifiés. La seconde partie du projet a démarré lorsque les conditions optimales du chemostat avaient été fixées et que les cellules avaient atteint un "steady state". Afin de mieux caractériser la lignée PER.C6, plusieurs perturbations ont été introduites au sein de la culture et leurs effets sur la croissance cellulaire et les paramètres métaboliques ont été évalués. The PER.C6 cell line is derived from a human retinal cell in which recombinant DNA was introduced, allowing the cells to replicate indefinitely. The first part of the project was to set up a chemostat for the cell line with the optimal conditions so the PER.C6 cells can reach a steady-state. Temperature, ph and stirring speed were already set at their optimal set point. In this project, different pipes to extract culture from the vessel and different flow rates were tested. PER.C6 characteristics were then determined at a given dilution rate. Therefore in parallel, the excel file used as a data analysis template in the other USP processes was modified to match with chemostat conditions, i.e. formulas for nutrient uptakes (or production) rates, calculation of the growth rate and population doubling time are changed. The second part of the project started when the optimum chemostat conditions were fixed and a steady state was reached. In order to further characterize the PER.C6 cell line, several process disturbances were introduced to the chemostat culture, and the effect on the culture growth and metabolic parameters were assessed. 14

18 Marine MERON ROCHE DIAGNOSTICS GmbH maître(s) de stage / Supervisor(s) : Heiko WITTOR Planification, facilitation, et documentation d une analyse de risques dans une unité de production multiproduits L importance de la gestion du risque dans le cadre d un management efficace de la qualité au sein d une industrie pharmaceutique est grandissante et sa valeur démontrée. Le Quality Risk Management (QRM) fait même l objet d une des lignes directrices qualité de l International Conference of Harmonization (ICH Q9). Le risque est communément défini comme le produit de la sévérité d un dommage, de sa probabilité de survenue et, éventuellement, de sa détectabilité. L évaluation des risques peut en outre être réalisée à l aide de différentes méthodes, dont l emploi dépend de la situation étudiée. La fabrication et la purification de plusieurs produits dans une même unité de prodution peuvent entraîner un certain degré de risque. La mise en œuvre d une analyse de risques multi-produits, projet dont j ai été en charge, s inscrit dans ce cadre, et doit permettre d identifier, d analyser, d évaluer et de contrôler les risques potentiels à l aide de la méthode Failure mode and effect analysis (FMEA). PENZBERG Allemagne 02/09/ /02/2014 Planning, facilitation, and documentation of a risk assessment in a multi product manufacturing facility Quality risk management (QRM) is gaining in importance in pharmaceutical industries and is now recognized as a valuable factor of an effective quality system. In fact, a whole chapter of the ICH (International Conference of Harmonization) quality guidelines is dedicated to this subject (ICH Q9). Risk is commonly defined as the combination of the severity of harm, the probability of occurrence of that harm and, eventually, the detectability. The assessment of the risk might be performed using different tools and methodologies, depending on the situation. The production and purification of multiple products in a manufacturing facility necessarily entail some degree of risk. In this context, my project was to carry out and facilitate the realization of a multi-product risk assessment in order to identify, analyze, evaluate, and control potential risks, using a failure mode and effect analysis (FMEA) methodology. Renaud MEVEL RECOMBINANT ANTIBODY TECHNOLOGY Ltd maître(s) de stage / Supervisor(s) : Marianne BRUGGEMANN Caractérisation du répertoire d anticorps produits par une lignée de rat transgénique produisant des anticorps a chaine lourde uniquement De nombreux anticorps monoclonaux ont été développés, et leur utilisation en médicine compte comme une avancée majeure des 15 dernières années. Depuis le développement de la technologie des hybridomes en 1975, de nombreux progrès ont été fait quant à la génération d anticorps monoclonaux. On compte parmi eux l utilisation d animaux transgéniques possédant des gènes d immunoglobuline humains dans la configuration germinale, et ayant le locus endogène inactivé. Les animaux produits ont la capacité de réarranger ces gènes de manière productive pour générer des lymphocytes B exprimant des chaines lourdes et légères. De nombreuses souris transgéniques sont dorénavant disponibles sur le marché. Open Monoclonal Technology a généré la première lignée de rat ayant le loci de production d immunoglobulines endogène inactivé grâce à l utilisation de zinc-finger nucleases. En tant qu associé de recherche d OMT, RAT a généré OmniRat, le premier rat transgénique produisant des anticorps conventionnels ayant des idiotypes humain : parties «variable» V, «diversity» D et «joining» J humaines en association avec des parties constantes de rat. Différentes lignées possédant des caractéristiques spécifiques sont actuellement en développement. L objectif de mon stage était de caractériser la diversité du répertoire d anticorps exprimé par une lignée de rat produisant des anticorps à chaine lourde, avant et après leur immunisation. La recherche de transcrits contenant des séquences VDJ productives et réarrangées, mu et gamma, a été effectuée par RACE PCR et analysée en via des outils de bio-informatique. La structure de ces anticorps a été évaluée après purification d affinité par SDS PAGE et Western Blot. Par ailleurs, des séquences d animaux immunisés ont été sélectionnées et exprimées dans des cellules HEK293 a l aide d un vecteur navette E. coli cellules mammifères. Le but de cette stratégie était d identifier leur expression en tant que chaines lourdes humaines recombinantes, et d étudier leur affinité pour l antigène par ELISA. L analyse des transcrits à mis en évidence une conséquente diversité de séquences produites, par réarrangements et hypermutations somatiques. En revanche, peu de commutation de classe d IgM vers IgG a été observée. Les séquences identifiées ont été correctement re-exprimées en tant que IgG1 CH1 humain, cepdendant aucun d eux n a montré de haute affinité pour l antigène. CAMBRIDGE Royaume Uni 15/07/ /02/2014 Characterisation of the antibody repertoire of a transgenic rat strain producing heavy chain only antibodies Numerous monoclonal antibodies have been produced and their use in medicine has become one of the major breakthroughs of the last 15 years. Since the development of the hybridoma technology in 1975, significant progress has been made on new technologies for generating monoclonal antibodies. This includes the use of transgenic animals, carrying human Ig genes in germline configuration, and having the endogenous Ig loci knocked-out. The engineered animals can undergo productive rearrangement with the generation of B lymphocytes expressing human heavy and light chains. Several transgenic mice are now commercially available. Open Monoclonal Technology generated a rat strain having the endogenous Ig loci silenced using zinc finger nucleases. As a research affiliate of OMT, Recombinant Antibody Technology (RAT) generated OmniRat, the first transgenic rat that makes conventional antibodies with human idiotypes: human variable (V), diversity (D), and joining (J) segments with rat constant regions. Different rat strains with unique specifications are now in development. The aim of my project was to characterise the diversity of the antibody repertoire expressed by a transgenic rat strain producing single heavy chain antibodies, before and after immunisation. The investigation of productive mu and gamma V(D)J rearranged transcripts was performed by Rapid Amplification of cdna Ends (RACE) PCR, and analysis using immunological bioinformatics. The structure of these antibodies was evaluated after affinity purification by SDS-PAGE and western blotting. In addition, sequences obtained from immunised animals were selected and expressed in Human Embryonic Kidney 293 cells using an E. Coli - mammalian shuttle vector. The goal of this strategy was to evaluate their expression as human recombinant heavy-chains, and to study antigen-binding using the ELISA technology. The transcript analysis revealed that sizeable diversity was generated by Ig rearrangements and somatic hypermutations, but only little class switching from IgM to IgG was observed. The sequences identified have been successfully re-expressed as fully human IgG1 CH1, however no high affinity binders were detected. 15

19 SANOFI PASTEUR maître(s) de stage / Supervisor(s) : Eric ABACHIN Développement des outils analytiques pour la caractérisation des vaccins MARCY L'ÉTOILE France 02/09/ /02/2014 Development of analytic tools for the vaccines characterization Tra Ly NGUYEN Les anticorps, polyclonaux ou monoclonaux, sont les protéines d affinité indispensables dans des applications comme la recherche, le diagnostic ou la thérapie. Pourtant, ces molécules présentent aussi des inconvénients, autant au niveau de leurs propriétés biophysiques, que de leur production qui est longue, laborieuse et nécessite un recours aux animaux de laboratoire. Le but de mon stage est d évaluer l utilisation de ligands alternatifs aux anticorps pour les techniques analytiques afin de réaliser le dosage d antigènes vaccinaux : caractérisation des ligands en termes de spécificité et du type de motif reconnu, de leur utilisation dans un test analytique, et évaluation de leurs avantages sur les anticorps en tant que molécule permettant la reconnaissance d un antigène vaccinal. Antibodies, polyclonal or monoclonal, are the most necessary binding molecules in many applications such as research, diagnostics and therapy. However, those molecules have limitations based on their biophysical properties, the long and laborious production and the need of laboratory animals. The aim of my internship is to evaluate the use of an alternative to antibodies to overcome limitations of antibodies used for the vaccine controls: ligand characterization in terms of specificity and binding site recognition, development of methods using these alternatives, then reviews of benefits and drawbacks of using an alternative to antibodies. Marie OUARNÉ PEPSCAN THERAPEUTICS maître(s) de stage / Supervisor(s) : Peter TIMMERMAN Synthèse et criblage de bibliothèques de peptides 2 CLIPS bicycliques comme potentiels inhibiteurs de l Avastin L angiogenèse permet aux tumeurs de croître et de se métastaser. Or, le VEFG est l un des plus importants facteurs stimulant ce phénomène. De ce fait, de nombreuses recherches ont été effectuées et le bevacizumab (AvastinTM, Genentech), un anticorps monoclonal humanisé anti-vegf, a été approuvé par la FDA contre le cancer colorectal métastatique en Même si le traitement est sûr et généralement bien toléré, il induit des problèmes de cicatrisation qui sont un obstacle aux interventions chirurgicales souvent nécessaires car cela implique un délai de 28 jours entre la dernière dose et la chirurgie. De plus, les plaies doivent toutes être parfaitement cicatrisées avant reprise du traitement. L objectif de ce projet est donc de trouver un peptide qui puisse neutraliser le bevacizumab en se liant rapidement à l anticorps à la place du VEGF afin de supprimer ces effets secondaires indésirables. Dans ce but, des peptides ont étés créés en utilisant la technologie CLIPSTM. Grâce à elle, les peptides possèdent une structure en double boucle qui leur permet de mimer plus efficacement le site fonctionnel du VEGF. Après réaction et purification, les peptides ont étés testés via des ELISA et de la polarisation de la fluorescence pour étudier leur compétitivité vis-à-vis du VEGF. En fonction des résultats obtenus, des bibliothèques de peptides ont été synthétisées et criblées. Les meilleurs peptides en étant issus ont été resynthétisés et testés comme les précédents. De nouvelles bibliothèques ont été créées en vue d une optimisation continue. RC LELYSTAD Pays Bas 15/08/ /02/2014 Synthesis and activity screening of bicyclic "2 CLIPs" peptide libraries as potential inhibitors of Avastin Angiogenesis allows tumours to grow and metastasize and VEGF is one of the more important factors stimulating it. Because of this, research have been performed and in 2004, the bevacizumab (AvastinTM, Genentech), an anti-vegf humanized monoclonal antibody, has been approved by the FDA for treatment of colorectal cancer. Even if the treatment is safe and generally well tolerated, it involves wound healing difficulties which are an important problem when most patients require curative surgery in addition to Avastin. Delay between last dose and surgery should be at least 28 days and surgical incisions should also to be fully healed before administering bevacizumab a new time. So, the aim of this project is to find a peptide which can neutralize Avastin through a competitive binding with VEGF quickly in order to suppress these unwanted side effects. For this purpose, peptides have been designed using CLIPSTM technology. Through this, peptides obtain a double loop structure that could mimic the functional site of VEGF. After reaction and purification, peptides have been tested in ELISA and fluorescence polarization assays to study their competitive skills against VEGF. Depending on the results, libraries have been synthesized and screened. Best peptides have been synthesized to be tested in the same way as the first ones. New libraries have been designed in order to continue to improve competitive skills of peptides. 16

20 Maëlle PASQUIOU ATMI maître(s) de stage / Supervisor(s) : Matthieu EGLOFF Suivi du développement et préparation de la mise sur le marché d un nouveau produit: une centrifugeuse à usage unique pour la bio production Pour répondre aux besoins de clients en thérapie cellulaire ATMI LifeSciences, société spécialisée dans les bioréacteurs à usage unique, développe actuellement un nouveau produit : une centrifugeuse conçue pour concentrer et récolter les cellules après culture. Dans le cadre de mon stage en "product management", l objectif de mon projet était le suivi du développement de la centrifugeuse et la préparation de sa mise sur le marché. La version bêta du produit étant déjà fonctionnelle et en cours d utilisation chez quelques clients, j ai pu travailler sur le suivi de cette version et le développement de la future version commerciale, en collaboration avec les ingénieurs, les scientifiques, les partenaires commerciaux, le marketing, la finance et les clients potentiels. Le chef de produit doit s'assurer du succès des produits dont il est responsable : il intervient tout au long du cycle de vie, en se concentrant sur le positionnement, la présentation, la promotion et l'adaptation de ces produits aux marchés. Durant mon stage j ai travaillé sur l'élaboration du cahier des charges de la version commerciale, la documentation technique et client, le développement d'outils pour l'équipe de vente ainsi que le plan marketing et communication. Afin d'élargir le potentiel de la centrifuge au-delà de la thérapie cellulaire, une deuxième partie de mon projet a été la conduite d une étude de marché pour identifier de nouvelles opportunités dans l industrie des bioprocédés. J ai ensuite validé les résultats de cette étude par un sondage auprès de clients potentiels pour évaluer leurs besoins et leur intérêt pour la centrifugeuse. BRUXELLES Belgique 12/08/ /02/2014 New product introduction: single use continuous centrifuge for bioproduction To meet the needs of clients in cell therapy, ATMI LifeSciences, a company specializing in single-use bioreactor, is currently developing a new product: a centrifuge to concentrate and harvest cells after culture. As an intern in product management, the goal of my project was to monitor the development of the centrifuge and the preparation of its introduction on the market. The beta version of the product being already functional and used by some customers, I worked on the monitoring of this version and the development of the future commercial version in collaboration with the engineers, scientists, sales force, marketing, finance and potential customers. Product managers are responsible for the success of the products they are working on: they guide products throughout their life cycle by focusing on positioning, presentation, promotion and adaptation of these products to the markets. During my internship I worked on the creation of the user requirement specifications for the commercial version, wrote technical and customer documentation, developed tools for the sales force and participated in the marketing and communication plans. To expand the potential of the centrifuge beyond cell therapy, a second part of my project was the conduction of a market research to identify new opportunities in the bioprocess industry. To validate the results of the study, I conducted a survey with potential customers to assess their needs and their interest in the centrifuge. UCB PHARMA maître(s) de stage / Supervisor(s) : Mareike HARMSEN Etude et amélioration de modèles réduits de culture cellulaire BRAINE L'ALLEUD Belgique 15/07/ /02/2014 Evaluation and refinement of bioreactor scale down models Alexandre PERMINGEAT Les modèles réduits de procédés sont d un intérêt spécial en culture cellulaire étant donné qu ils permettent de mieux comprendre un procédé donné, de résoudre plus facilement certains problèmes qui peuvent survenir en échelle de production, et sont une échelle de travail commode pour développer un procédé. Le but de mon stage était d affiner un modèle réduit de culture cellulaire en bioréacteurs de 2L, afin d obtenir une meilleure comparabilité des résultats avec l échelle de production (80L et 2000L). Après une analyse des résultats d expériences précédentes, une nouvelle expérience a été décidée puis testée, ce qui a permis de conclure sur l étude. Scale-down models are important tools in cell culture process development as they allow to better understand a process and to troubleshoot any issues at manufacturing scale. Furthermore a suitable scale-down model can be used to optimize a process. The aim of my internship project was to refine a scale down model in 2L bioreactors, in order to have a better comparability to the intermediate and manufacturing scale (80 and 2000L scale respectively). Following analysis of data across the scales, a new set of experiment was designed and tested and an analysis of the results was made, including statistical tests. 17

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