Un logiciel libre conçu pour aider à la validation des identifications en protéomique et pour mieux exploiter les données de séquençage de novo

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1 Un logiciel libre conçu pour aider à la validation des identifications en protéomique et pour mieux exploiter les données de séquençage de novo Hélène Rogniaux & Dominique Tessier I.N.R.A. UR1268 Biopolymères Interactions Assemblages NANTES

2 «Validation» des identifications? Pratiques de validation des résultats : 31 publications (5 issues - Proteomics, MCP, JPR ; études protéomiques à grande échelle ; MS/MS uniquement) Lauriane KUHN (CEA EDyP)

3 «Validation» des identifications? Comment? Par l application de critères «utilisateur-définis» sur le nombre de peptides de score «significatif» par protéine validée Par l utilisation de plusieurs algorithmes de recherche en banque et/ou de plusieurs analyses de l échantillon et la confrontation des résultats obtenus Par l utilisation d approches permettant d évaluer le pourcentage de faux positifs dans le résultat (FDR) ( n a de sens que si jeu de données suffisant) Et aussi : En s appuyant sur la corrélation avec les informations «connues» (taxonomie, MW et pi de la protéine) En examinant la corrélation du spectre MS/MS expérimental avec celui attendu

4 complexité des designs expérimentaux & complexification des échantillons PMF (mass measurement) PFF (mass + fragments) X 3 several search engines DATABANK SEARCH several databanks (including decoy DB), Sequest Entrez Protein La validation des résultats ne peut plus reposer (que) sur une expertise e manuelle!

5 Cas des protéines non répertoriées en DB? pea P. sativum rapeseed B. napus wheat T. aestivum M. truncatula amaranth A. hypochondriacus Uniprot 23/09/08 ( entries) ème congrès de la SFEAP - Tours 2008

6 100 % 100 % % mass mass e mass % mass % e e e mass % mass % mass % mass % e e mass e e e3 Design expérimental pour les protéines non répertoriées en DB Identified proteins Non-assigned MS/MS spectra New identifications Increased seq. coverage DE NOVO SEQUENCING PLGS Peaks MS-BLAST Shevchenko et al. Anal. Chem FAST-S Mackey et al. Mol. Mol. Cell. Proteomics 2002 B L A S T Aujourd hui, l intégration des résultats de séquençage de novo reste manuelle

7 Principales fonctions d OVNIp 1- Aide à organiser les résultats de recherche en banque associés à un même échantillon et issus de différentes recherches (plusieurs algorithmes, plusieurs banques, ) 2- Aide à valider les identifications proposées en mettant à disposition différents outils : - de visualisation des résultats possiblement conflictuels (contrôle l unicité d interprétation dans le résultat validé) - de validation automatique suivant des critères de score des peptides définis par l utilisateur - de calcul du taux de faux positifs (FDR) 3- Permet d exporter les résultats validés dans un rapport,, qui peut être conçu pour intégrer les informations requises pour publier 4- Automatise et optimise l exploitation et l intégration des résultats de séquençage de novo 5- S installe facilement et présente une interface graphique simple & conviviale

8 DB search engine (Mascot,, PLGS) De novo sequencing tool (PLGS) import results OVNIp an independent model is generated filters formatted output of de novo sequences results are gathered & displayed validate results Automatic validation FDR calculation Unicity of interpretation is controlled templates formatted output for reporting homology search engine (MS-BLAST)

9 Une visite du logiciel Création d un projet dans OVNIp (import de résultats et organisation) Visualisation des résultats Validation automatique des protéines Calcul et application de FDR Export des résultats validés Import de séquences de novo Utilisation de MS-BLAST pour identifier des protéines non répertoriées en DB

10 Création d un projet.. Organisation des données

11 Création d un projet.. Organisation des données Projet Sous-projet Echantillon / analyse - DB search result 1 - DB search result 2 - De novo sequencing -..

12 Visualisation des résultats

13 Visualisation des résultats Proteins summary view Apply filter to sort the list according to protein score / nb.. of peptides / keyword Apply filter to display selected peptides Click <Mascot Link> to open the MASCOT search result in your browser

14 Visualisation des résultats Protein detailed view Position = rank among all possible interpretations found for the same query Interpretations = nb.. of distinct interpretations assigned to the same query Proteins = nb.. of protein entries sharing the same sequence (within the same DB search result)

15 Visualisation des résultats Spectrum view = the 3 interpretations of the query = the 20 protein entries sharing the same sequence

16 Visualisation des résultats Spectrum view = all interpretations of the query in all DB searches ran on the sample

17 Visualisation des résultats Spectrum view

18 Validation des résultats G La validation dans OVNIp est un processus «peptide centric» qui comprend 3 niveaux : On sélectionne l interprétation assignée à un spectre MS/MS (et associée à une protéine donnée) ; cette sélection est propagée pour p l ensemble des protéines qui partagent la même interprétation du spectre; une interprétation différente du spectre ne peut plus être sélectionnée. La protéine est ensuite validée si par exemple elle a plus de 2 peptides sélectionnés Les protéines que l on veut exporter dans le rapport sont indiquées par un «flag»

19 Validation des résultats Validation manuelle Step 1. Select valid interpretations of the spectra

20 Validation des résultats Validation manuelle Step 2. Validate protein

21 Validation des résultats Validation manuelle Step 3. Flag the protein to export into a report

22 Validation des résultats Validation automatique

23 Validation des résultats Validation automatique

24 Estimation du FDR et application pour la validation Permet de filtrer les résultats rendus par le moteur de recherche pour limiter le taux de faux positifs à une valeur définie (FDR). Principes : - Les résultats obtenus dans une banque de séquences «vraies» sont confrontés à ceux obtenus dans une banque générée de manière aléatoire atoire (banque «decoy») ; les résultats obtenus dans la banque aléatoire sont considérés comme faux ; on suppose que le taux d erreur est égal entre dans les 2 recherches - On fixe une valeur jugée acceptable pour le FDR (ex. 2%) : le filtre sur le score des peptides est ajusté de façon qu en l appliquant, on ait t au plus 1% de peptides issus de la recherche aléatoire dans le jeu de résultats. Pour générer la banque decoy depuis OVNIp : - lecture inversée de chaque séquence protéique, ajout d un préfixe dc_ devant le n d accession d origine, concaténation avec la banque vraie

25 Estimation du FDR et application pour la validation False positive hits

26 Estimation du FDR et application pour la validation threshold score at 2% FDR (25.8 < x <57.8)

27 Export des données validées dans un rapport Utilisation de la librairie JAVA FreeMarker (un outil générique qui permet d exporter des documents au format texte à partir d un modèle). Les informations souhaitées peuvent être récupérées en se basant sur un modèle définissant les différents attributs des objets : protéines,, peptides etc.

28 Export des données validées dans un rapport

29 Exploitation des données de séquençage de novo Non-interpreted mass spectra are submitted to de novo sequencing by a relevant tool (Peaks, PepNovo,, others) OVNIp is currently compatible with PLGS (Waters) Import results Apply filters to keep the best amino acid stretches OVNIp Import MS-BLAST results Tentative alignment of the retrieved sequences with the identified ed proteins Export non-assigned de novo sequences Apply filters to remove redundancy, concatenate or split sequences MS-BLAST

30 Exploitation des données de séquençage de novo

31 Exploitation des données de séquençage de novo

32 Exploitation des données de séquençage de novo

33 Exploitation des données de séquençage de novo

34 Conclusions OVNIp : 1- A été implémenté en Java & peut facilement être installé sur un PC. 2- Utilise des outils open sources (librairies FreeMarker, Jaligner & Jython) 3- Est diffusé gratuitement sous licence CECILL. Une version stabilisée e pour Windows est disponible à : wwwappli.nantes..nantes.inra.fr:8180/ovnip 4- Est aujourd hui compatible avec les sorties Mascot (Matrix Science) & PLGS (Waters) (recherche en banque et séquens quençage de novo,, respectivement) et est interfacé avec MS-BLAST (EMBL) 5- A été conçu suivant un modèle objet rendant facile l implémentation ion de nouvelles fonctionnalités 6- Est fourni avec une documentation complète : Installation Guide, Developer s guide & User s guide

35 Conclusions EC Publier 25 ème et congrès Échanger de en la protéomique SFEAP - Tours

36 Remerciements INRA UR1268 BIA: Les testeurs Cellule Bioinformatique & Gestion de données Dominique Tessier Pascal Yclon Ingrid Jacquemin Plate-forme BIBS Audrey Geairon David Ropartz Stéphanie Penninck Colette Larré (INRA Nantes) Benoît Valot (INRA Moulon) Julien Jardin & Daniel Mollé (INRA Rennes) Christophe Chambon (INRA Clermont- Theix) Alain Guillot (INRA Jouy-en-Josas) Valérie Labas (INRA Nouzilly) Samuel Granjeaud (Inserm ICIM Marseille) contact :

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