Programme P2 anovectorisationpar squalénisationd agents anticancéreux pour les cancers à oncogènes de jonction Aide allouée: 470 696 1 er octobre2011-30 mars 2015 Coordinatrice: Liliane Massade
Consortium UMR 8203 CRS Vectorologyet thérapies anticancéreuses Pr. aude Mavy Dr. Jean-Rémi Bertrand Dr. Angelo Paci M. Alain Deroussent UMR 8612 CRS Institut Gallien Pr. Patrick Couvreur Dr. Didier Desmaële Dr. Sindra Lepêtre-Mouelhi
Thématique de recherche Introduire une nouvelle nanomédecine à base de molécules squalénées pour les cancers à oncogène de jonction Macromolécules : sira Petites molécules : ifosfamide o Cancer papillaire de la thyroïde(ptc) o Cancer de la prostate (CaP) o Sarcome d Ewing(SE) But final Proposer un traitement personnalisé pour les patients atteints de cancers causés par les oncogènes de jonction Synthèse chimique Didier Desmaële Application Biologique Liliane Massade
Principe de la squalénisation D D Squalene is an acyclic triterpene so named because of its occurrence in shark liver oil. owever, it is widely distributed in nature with significant amounts found in olive oil and olive leaves. D ydrophilic or hydrophobic drug In vivo clivable linkage : ester, amide, phosphate, disulfide etc.. D D D D 4
Structure des brins sens des sira choisis 2 5'-CGU-UAC-CAU-CGA-GGA-UCC-A- 2 RET/PTC1 sense strand P - P - Modified base to increase resistance to 3 - nuclease S Functionnal group available for conjugation
Synthèse du maléimide-squalène doté d un bras espaceur hydrophile BS/ 2 /TF 1) K 2 C 3, Me 2) 3 I 5, Et 2 3) Cr 3, 2 S 4, 0 C, acetone 35% Br 55% Squalene C 2 Et 2 ac 3, 2 40 % overall TF, Et 3, 24 h, 20 C 20%
sira RET/PTC1-Squalene nanoparticles 2 5'-CGU-UAC-CAU-CGA-GGA-UCC-A sira sens strand modified with a propylthiol group at 3 end of the last base P - P - 2 Reaction mixture without Me Reaction mixture + 30% Me Reaction mixture + 50% Me 30 % 45 % S 7 % DMF, PBS, Me 2 5'-CGU-UAC-CAU-CGA-GGA-UCC-AdA P S Microwave activation improved the yield to 55% 7
Encapsulation des sira dans des anoparticules Polyisopréniques Cationiques 2 C 3 2 2 Ac, 2 h 100 C 2 Ac 2 SQ-( 2) C= 2 +, Ac - Size (nm) PdI Zeta potential (mv) SQ-( 2 )C= 2+ Ps 169.7 ± 6.5 0.11 + 82.4 ± 2.9 sira/sq-( 2 )C= 2+ Ps (/P = 6) 190.1 ± 4.0 0.18-51.3 ± 2.8
Conjugaison Biomimétique de l Ifosfamide P Cyt. P450 P P Rétro-Michael - 2 C=CC P Ifosfamide 4-hydroxy-ifosfamide Aldo-ifosfamide Isophophoramide P oxydation anodique Me BF P 3.Et 2, C 2 2, - 78 C 53% P S 40% S P 9
Thématique de recherche Introduire une nouvelle nanomédecine à base de molécules squalénées pour les cancers à oncogène de jonction Macromolécules : sira Petites molécules : ifosfamide o Cancer papillaire de la thyroïde(ptc) o Cancer de la prostate (CaP) o Sarcome d Ewing(SE) But final Proposer un traitement personnalisé pour les patients atteints de cancers causés par les oncogènes de jonction Synthèse chimique Didier Desmaële Application Biologique Liliane Massade
ncogènes de jonction et cancers Les oncogènes de jonction sont la conséquence de réarrangements chromosomiques et sont à l origine du développement de plus de 20% des cancers. BCR-ABL: Chronic myeloid leukemia[t(9, 22)](> 95%) EWS-Fli: Ewing sarcoma[t(11, 22)](85%) RET/PTC: papillary thyroid carcinoma(ptc),[inv 10q)(50%-70%) TMPRSS2-ERG: prostate cancer[del(21q22)](> 50%) Les séquences des oncogènes de jonction sont uniquement présentes dans les cellules tumorales Représentent une cible intéressant pour un thérapie personnalisée (e.g. sira)
Small interfering RA (sira) Séparation du DB Avantages Mécanisme naturelde suppression de gènes AR double brins de petite taille (19-21bp) Spécifiques Actifs à faible doseet peu toxiques Inconvénients Dégradation rapide dans le plasma Macromolécules très hydrophiles ne pénètrent pas spontanément dans les cellules Effetsoff-target Mécanisme d action des sira RISC = RA Induced Silencing Complex VECTRISATI
RET/PTC et carcinomes papillaires de la thyroïde Résultats Les sira RET/PTC1 et RET/PTC3 sont efficaces sur leur propre oncogène de jonction AG CGTGACCATC GAGGATCCAAA GTGGGAATTCCCTCG 4 RET sira RET/PTC1 siret/ptc1 on traitées si RA Contrôle TUEL RET/PTC1 TTF-1 RET/PTC1 β-actin Expression RET/PTC1 Viabilité Apoptose Résultats similaires pour RET/PTC3 Expression TTF-1 - Gilbert-Sirieix et al., Thyroid, 2010 -Ali et al., Expert Rev. in. Pharmacol. 2012 -Ali et al., Thyroid,2014 -Ali et al.,plosone, 2014 afiz Ali Marie Gilbert Lara Malhab
Résultats RET/PTC et carcinomes papillaires de la thyroïde Les sira [RET/PTC1 et RET/PTC3]-vectorisés inhibent la croissance tumorale Squalénisation des siras sira PBS (100mM. p 7) DMF 2 sira -SQ Ps Collaboration: Patrick Couvreur, UMR 8612 Brevet international, 2012 In vivo Croissance tumorale (Fold change) 30 25 20 15 10 5 0 on traités P sira CT-SQ P siret/ptc1-sq *** 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 jours -66% RET/PTC1 mra intra tumoral levels 1.5 1 0.5 RET/PTC1 ß-actin -70% *** Résultats similaires pour RET/PTC3 - Thèse de sciences Mouna Raouane, 2012 -Raouane et al.,j. Med. Chem.,2011 - Raouane et al., Bioconjugate Chemistry, 2012 Mouna Raouane Marilyn Dernissian Andrey Massimenko
Résultats Cancers de la prostate Les sira TMPRSS2-ERG inhibent la croissance tumorale 1,5 1 mra expression 0,5 0 ERG Caspase-3-37KDa -19KDa -11KDa GAPD GAPD Urbinati et al., soumis Quentin Rousseau
Conclusions 1 - Etabli une nouvelle méthode de vectorisation des sira par couplage covalent des sira au squalène - Montré que les nanoparticules sira SQ sont efficaces dans des modèles précliniques pour deux tumeurs à oncogène de jonction: le cancerdelaprostateetlecancerdelathyroïde Proposer des traitements personnalisés pour les patients atteints de cancers à oncogènes de jonction
Résultats Sarcome d Ewing Le sira inhibent l oncogène EWS-Fli1 in vitro EWS Junction EWS/Fli1 Fli1 GCAGCAGAACCCUUCUUAU EWS/Fli1 mra expression (% of untreated cells) EWS/Fli-1 β-actine 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 T AS Ct
Résultats Sarcome d Ewing Les nanoparticules sira-cationiques protègent le sira EWS-Fli1 Caractéristiques des Ps SQ-2 : Taille= 170 nm; PdI= 0,1; ζ = 80 mv C 2 28 48 4 (+) MW 501,77 (+) C 3 -C - % sira libre (IF BET) 120 100 80 60 40 20 0 P-SQ cationiques forment des complexes avec le sira 0 1 2 3 4 5 6 7 Ratio de charge (/P) % sira intact 120 100 80 60 40 20 0 Protège le sira EWS-Fli1 de la dégradation sira libre sira:sq- 2 1 2 3 4 5 6 7 Temps (h) Viabilité cellulaire (% cellules non traitées) 140 120 100 80 60 40 20 0 Peu toxiques P sira EWS-Fli1 SQ- 2 P sira CT SQ- 2 P SQ- 2 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 Concentration en SQ (mg/l)
Résultats Sarcome d Ewing 1-Les nanoparticules siraews-fli1/sq- 2 inhibent l oncogène 2-L association PsIF-SQ et siraews-fli1/sq- 2 diminue la viabilité cellulaire Internalisation du sira EWS-Fli1 dans les cellules et inhibition de l oncogène et de l oncoprotéine mra EWS/Fli1 % of untreated cells 160 120 80 40 EWS/Fli-1 β-actine 24h 48h 120 ** *** ** L association diminue la viabilité cellulaire on traité (T) Cells growth (% of untreated cells) 100 80 60 * sira EWS-Fli-1 SQ-2 sira CT SQ-2 T-IF-SQ sira EWS-Fli-1 IF-SQ 40 sira CT IF-SQ
Conclusions 2 in vitro - Les nanoparticules squalène-cationiques: - protègent le sira EWS-Fli1 de la dégradation, - inhibent l oncogène et l oncoprotéine - L IF-squalène semble potentialiser les effets antinéoplasiques du sira EWS-Fli-1
Reste à faire (demande de prolongation) - Confirmer les effets de l association sira EWF-Fli1 et IF: - Inhibition d EWS-Fli1 en présence du double traitement - Mesure de l apoptose au cours du traitement - Tester in vivo l effet de cette combinaison sur la croissance tumorale -Etudier la biodistributiondes nanoparticules : Amélioration du traitement
Articles ou revues publiés 1- Raouane et al. Lipid Conjugated ligonucleotides: A Useful Strategy for Delivery. Bioconjugate Chemistry, 23(6), 1091-1104, 2012, Cover page Bioconjug. chem, June 2012 2- Ali et al."significance and applications of nanoparticles in sira delivery for cancer therapy" Expert Rev. in. Pharmacol., 403-12, 2012 3- Ali et al. Effects of silencing RET/PTC1 oncogene in papillary thyroid carcinoma by sira-squalene nanoparticles with and without fusogenic companion GALA- Cholesterol. Thyroid 24(2), 327-338, 2014 4- Ali etal. EffectsofsiRAonRET/PTC3 junctiononcogene in papillary thyroid carcinoma: from molecular and cellular studies to preclinical investigations. Plosne. 23;9(4):e95964, 2014 5- Massaad-Massade L. Relevance of targeting RET/PTC junction oncogene and Wnt/β-catenin pathway in the treatment of papillary thyroid carcinoma: skill of 8-year work. Biopolym. Cell. 30(5):343-348, 2014 Articles en révision - Urbinati, et al. Antineoplastic effects of sira against TMPRSS2-ERG junction oncogene in prostate cancer: from molecular and cellular studies to preclinical investigations. - Skarbek et al. Pre-activated oxazaphosphorines designed for isophosphoramide mustard delivery as bulk form or nano-assemblies: synthesis and proof of concept. - Bertrand et al. Turning squalene into cationic lipid allows a delivery of sira in cultured cells. Production scientifique Communications orales MalvyC.SMI,London,UK,2012 Massade L. 17th World Congress on Advances in ncology 2012, ersonissos, Greece. Massade L. 18th World Congress on Advances in ncology 2013, Greece. Award of outstanding achievement. Paci A. BIT s 6th Annual World Congress of cancer, Xian (Cina), 2013 Ali M. From Molecular to Cellular Events in uman Pathology. Paris, 2013 Urbinati G. From Molecular to Cellular Events in uman Pathology, Paris, 2013 Massade L. Drug delivery course, McGill University, 2014 Massade L. From Molecular to Cellular Events in uman Pathology. Biopolymers and Cell, Riga, 2014 Communications par affiche -Lesueur et al., 8th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology. Istanbul, 2012. - Martens et al., AACR Annual Meeting, April 2012, Chicago USA. - Consortium présenté par L. Massade, Journées ationales anosciences et anotechnologies, ovembre 2012, Bordeaux, France - Consortium présenté par L. Massade, Journées ationales anosciences et anotechnologies, ovembre 2013, Marseille, France. - Skarbek et al., 3rd Conference Innovation in Drug Delivery: Advances in Local Drug Delivery. September 22-25, 2013; Pisa, Italy
http://anr.nanosqualonc.com/ UMR 8203 CRS Pr. aude Mavy Dr. Jean-Rémi Bertrand Dr. Angelo Paci M. Alain Deroussent UMR 8613 CRS Pr. Patrick Couvreur Dr. Didier Desmaële Dr. Sindra Lepêtre-Mouelhi ubert Chapuis MCU (2013) Giorgia Urbinati CR2 (2013) Quentin Rousseau MSc(2012) afiz M Ali Thèse (2014) Squalenisation TMPRSS2-ERG RET/PTC Deborah Le ogue M2 (2014) Sandra aveau MSc(2014) Charles Skarbek en thèse EWS/Fli1 et IF iocminh Pham M2 (2013)