INTERPRETATION DES RESULTATS : LA MISE EN PLACE DE LA BASE DE DONNEES VOUS DONNE UN ACCES DIRECT A VOS SEQUENCES. POUR VALIDER LA QUALITE DE CES SEQUENCES, VOUS DEVEZ VISUALISER LEUR CHROMATOGRAMME. POUR INTERPRETER UN CHROMATOGRAMME, VOUS AVEZ BESOIN DE LOGICIEL D EDITION TELECHARGEABLE VIA LA PARTIE TELECHARGEMENT DE LA PAGE WEB UN CONTROLE QUALITE DE LA PLAQUE SUR LAQUELLE SE TROUVE VOTRE SEQUENCE EST EFFECTUE PAR LE SERVICE. EN CAS DE PROBLEME GENERAL SUR CETTE PLAQUE, VOUS ETES AVERTIS PAR MAIL. LORSQUE LE CHROMATOGRAMME DE VOTRE SEQUENCE NE PRESENTE PAS LA QUALITE QUE VOUS ATTENDEZ, OBSERVEZ ATTENTIVEMENT LES PROFILS CARACTERISTIQUES QUE NOUS AVONS SELECTIONNES SI VOUS NE RESOLVEZ PAS VOTRE PROBLEME, APPELEZ NOUS AU 0140516565 OU ENVOYER UN MAIL A : sequence@mail.cochin.inserm.fr 1
COMMENT INTERPRETER UN CHROMATOGRAMME Vous visualisez ci dessous le chromatogramme d une séquence de bonne qualité. Les icônes présentes dans le coin inférieur gauche, donnent accès à certaines informations. En cliquant sur CATG, vous avez accès à la séquence en format texte. 2
Attention, les corrections effectuées sur le chromatogramme seront automatiquement effectuées sur ce fichier texte. En cliquant sur A, vous aurez accès à la feuille d annotation ci dessous. Celle ci renferme des données qui peuvent être importante dans l analyse de vos résultats. Dans FILE : vous avez accès au numéro de la plaque sur laquelle a été passée cette séquence (ici IC265) et la position de la séquence sur cette plaque (ici E11). Dans PEAK ONE LOCATION : vous avez accès au premier point de fluorescence identifié par le logiciel d analyse. Sa valeur normale est comprise entre 350 et 450 points. Dans AVE. SIGNAL INTENSITY : vous avez accès aux valeurs d intensité moyenne de la séquence pour les 4 bases. Une intensité de moins de 50 points pour le G signifie que votre séquence n a pas bénéficie de conditions optimales pour diverses raisons (cf plus loin). 3
En cliquant sur, vous aurez accès aux données brutes de votre séquence. Ces données vont donnent accès aux données d électro injection : A _ Injection de bonne qualité B _ Injection de mauvaise qualité On observe des remontées des lignes de base : elles correspondent à des co injections de particules contaminantes (sels, impuretés). Les impuretés viennent perturber la migration électrophorétique de l échantillon. Elles proviennent d une purification incorrecte de votre matrice. 4
PROFILS CARACTERISTIQUES LORSQUE LE CHROMATOGRAMME DE VOTRE SEQUENCE NE PRESENTE PAS LA QUALITE QUE VOUS ATTENDEZ, OBSERVEZ LES PROFILS CI DESSOUS. LES PRINCIPAUX PROBLEMES ET LEUR ORIGINE Y ONT ETE REPERTORIES ET VOUS SONT PRESENTES. DES MOYENS POUR Y REMEDIER SONT PROPOSES. LE SERVICE DE SEQUENCE ASSURE UN CONTROLE QUALITE DE LA PLAQUE SUR LAQUELLE SE TROUVE VOS SEQUENCES. EN CAS DE PROBLEME GENERAL SUR CETTE PLAQUE, VOUS SEREZ AVERTIS PAR MAIL. VOUS TROUVEREZ DE A À J DES PROFILS ATYPIQUES DONT L ORIGINE EST LIEE À UN PROBLEME TECHNIQUE. VOUS TROUVEREZ DE K A M DES PROFILS ATYPIQUES DONT L ORIGINE EST LIE A LA STRUCTURE DE LA MATRICE UTILISEE. 5
A - VOTRE CHROMATOGRAMME PRESENTE LE PROFIL Vous visualisez beaucoup de N, vous ne retrouvez pas votre séquence, vous observez un mélange anarchique de pics. Affichez la feuille d annotation et regardez les valeurs d AVE. SIGNAL INTENSITY : si elles sont inférieures à 10 pour le G et les autres signaux, cela veut dire que la réaction de séquence a généré un signal d intensité nulle. Aucune fluorescence spécifique n a été enregistrée, le seul signal présent correspond au bruit de fond. Plusieurs causes peuvent en être à l origine : - Problème lié à l amorce. Soit l amorce utilisée ne possède pas de séquence complémentaire sur la matrice d ADN, soit elle n est pas présente dans l échantillon (oublié), soit elle est dégradée. 6
- Problème lié à la matrice d ADN présente soit en trop faible quantité (inférieure au seuil de détection de la technique), soit inexistante lors de la migration (ADN dégradée ou oublié). - Problème lié au bon fonctionnement de la Taq. Nous contrôlons ce paramètre avec nos témoins de plaque. Comment remédier au problème : - contrôler la qualité de la préparation de la matrice (en particulier vérifier la quantité sur gel) et re préparer cette matrice dans de bonnes conditions. - vérifier la séquence de l amorce, vérifier sa fixation sur votre matrice. - re préparer une nouvelle dilution de l amorce si besoin. B - VOTRE CHROMATOGRAMME PRESENTE LE PROFIL Vous retrouvez difficilement votre séquence, vous trouvez un mélange de signaux sur la même position. Affichez la feuille d annotation et regardez les valeurs d AVE. SIGNAL INTENSITY : si elles sont inférieures à 10-20 pour le G et les autres signaux, cela veut dire que la réaction de séquence a généré un signal d intensité faible. 7
La principale cause responsable de ce type de profil est la qualité de la préparation de la matrice. Des préparations de plasmides, si elles sont mal extraites, présentent souvent des sels ou des impuretés (protéines, débris cellulaires, ARN résiduel). Les impuretés perturbent et parfois inhibent le fonctionnement de la taq polymérase au cours de la réaction de séquence. Pour remédier à ce type de problèmes il est nécessaire de refaire la préparation des plasmides, de doser à la fois au spectrophotomètre et sur gel d agarose coloré au Bromure d éthidium. C - VOTRE CHROMATOGRAMME PRESENTE LE PROFIL Vous observez un début de séquence correct puis assez rapidement un allongement anormal des pics (dans des zones ou la résolution du gel est suffisante, c est à dire, à moins de 500 bases lues). 8
Fenêtre de présentation des données analysées d une séquence présentant des problèmes d électroinjection Ce phénomène est lié à des problèmes d électroinjection qui se produisent de manière aléatoire. Pour remédier à ce problème, il est nécessaire de ré-injecter la séquence. Prévenez nous en précisant la position de l échantillon (exemple ci dessous : D02) et le numéro de la plaque (exemple ci dessous : IC270). Exemple: DB_2E1(16)AS_14_D02_IC270.ab1 D - VOTRE CHROMATOGRAMME PRESENTE LE PROFIL Normalement, vous devez lire les 5-10 premières bases derrière l amorce. Si vous observez une séquence correspondant à la séquence attendue mais avec un décalage (les premières bases lues sont situées plus loin dans votre séquence). Affichez la feuille d annotation et regardez les valeurs de Base Call Start : celles ci doivent être comprises entre 400 et 600 points. Si vous avez des valeurs supérieures, prévenez nous : nous pouvons corriger cette erreur d analyse. 9
E - VOTRE CHROMATOGRAMME PRESENTE LE PROFIL Lorsqu on observe une zone de séquence normale puis une zone de mélange, cela peut-être dû au mélange d un plasmide sauvage et d un plasmide recombinant. Cela arrive en particulier lorsque la position à partir de laquelle le mélange apparaît correspond à un site de restriction. 10
Pour remédier a ce type de problèmes, il est nécessaire de ré étaler le clone bactérien sur une boite de culture. F - VOTRE CHROMATOGRAMME PRESENTE LE PROFIL Lorsqu on observe une zone de mélange puis une zone de séquence normale, cela peut provenir du mélange de 2 produit de PCR de taille différentes et peut se présenter sous forme d un signal double jusqu'à ce que la taille du plus petit fragment soit atteinte (cas d un produit de PCR contaminant par exemple dimère d amorces généré lors de la PCR). 11
Pour remédier a ce type de problème, vous pouvez éventuellement purifier sur gel le produit PCR (éviter les purifications utilisant des billes de silice). Autre possibilité : refaire la PCR en modifiant les conditions pour éliminer le produit contaminant. G - VOTRE CHROMATOGRAMME PRESENTE LE PROFIL Lorsqu on observe un mélange de signal localisé sur une position, cela peut provenir d un mélange de 2 produits de PCR dont la séquence diffère seulement au niveau d une base (cas de recherche de mutations hétérozygotes par exemple). Dans ce cas au niveau de cette base seulement il y aura deux pics de fluorescence. 12
H - VOTRE CHROMATOGRAMME PRESENTE LE PROFIL Lorsqu on observe un profil double avec un décalage du cadre de lecture d une paire de bases (profil n-1). Le moyen d y remédier est de refaire synthétiser cette amorce 13
I - VOTRE CHROMATOGRAMME PRESENTE LE PROFIL Lorsqu on observe des pics non spécifiques très intenses en milieu de séquence, cela peut être du à la présence de cristaux d urée présents dans le polymère de migration, à des défauts d injection du polymère dans le capillaire. Ces évènements aléatoires sont indépendants de la séquence. Fenêtre de présentation des données analysées d une séquence présentant des pics d urée. Fenêtre de présentation des données analysées d une séquence dont le capillaire présente des défauts d injection du polymère. Si vous êtes bloqués pour la lecture de votre séquence avec de tels évènements, prévenez nous. Nous pouvons ré injecter la séquence. 14
J - VOTRE CHROMATOGRAMME PRESENTE LE PROFIL Sur certains chromatogrammes, on observe en début de séquence et à certaines positions bien définies de larges pics de forte intensité (souvent des pics de T) qui ne sont pas spécifique à la séquence du brin matrice. Ces pics proviennent de la fluorescence parasite de ddntp non incorporés qui ont mal été éliminés lors de l étape de purification. Fenêtre de présentation des données analysées d une séquence présentant un pic de T contaminant. Vous pouvez lire «par soustraction» la séquence correcte : exemple ici, on lit CAGTTTG Si vous êtes bloqués pour la lecture de votre séquence, prévenez nous. 15
K - VOTRE CHROMATOGRAMME PRESENTE LE PROFIL Vous observez une séquence correcte puis un arrêt brusque de la séquence. Parfois, la zone entourant cet arrêt est très riche en G. Le kit utilisé en routine est bloqué par certaines structures (on se réfère ci-dessous à la séquence du brin allongé c est à dire la séquence qu on lit sur le chromatogramme). Il s agit en particulier des séquences répétées de G. Comment remédier au problème? Signaler nous que votre séquence a présenté (avec le kit de routine) ce type de profil. Nous disposons de différents kits pour tenter de passer ces structures (chimie et enzymes différentes). Le seul inconvénient de ce kit spécial est qu il provoque des bandes de compressions. Sur le chromatogramme ce profil est caractérisé par la présence d une part de pics très rapprochés voir confondus et d autre part de pics très éloignés. 16
Fenêtre de présentation des données analysées d une séquence présentant des bandes de compressions après utilisation du kit dgtp Il est possible de s en sortir en combinant les informations issues des 2 types de chimie. 17
L - VOTRE CHROMATOGRAMME PRESENTE LE PROFIL Vous observez une lecture correcte de la séquence suivie d une répétition d un homopolymère (stretch de A ou T) ; on observe ensuite un décalage des cadres de lecture. Fenêtre de présentation des données analysées d une séquence qui contient un stretch de A La longueur de la répétition influence directement ce phénomène. Plus le stretch est grand et plus l enzyme dérape ce qui rend en général la lecture impossible après la zone de répétition. On peut résoudre ce type de problème par séquençage de la matrice dans l autre sens en utilisant une amorce antisens qui permet de connaître la séquence qui se trouve en 3 du stretch. Pour un homopolymère T on peut éventuellement synthétiser un mélange d amorces polyt avec une queue 3 A, G ou C.Ce type d amorce se fixe en 3 de l homopolymère et permet le séquençage de la partie située en 3. En pratique ce type d amorce est plus compliqué à synthétiser et à maintenir stable car son faible Tm rend son utilisation difficile. 18
M - VOTRE CHROMATOGRAMME PRESENTE LE PROFIL Si vous devez passer des structures GT riches, vous aurez la aussi des phénomènes de dérapage de la Taq dans la partie 3 de la répétition, entraînant des mélanges de signaux. Fenêtre de présentation des données analysées d une séquence GT riche Il est possible de remédier a ces problèmes en utilisant un kit spécial structure, prévenez nous en apportant vos échantillons. 19