Apoptose/chimiorésistance des cellules d ostéosarcome
Associées à des métastases Les ostéosarcomes Tumeurs primitives osseuses- Ostéoblastes malins Localisées principalement dans les os longs Surviennent majoritairement dans la deuxième décennie (moyenne à 16 ans), 2 ème pic d apparition après 65 ans Tumeurs hétérogènes constituées d un os pathologique, associées à des lésions ostéolytiques Tumeurs résistantes : 70% des patients survivent sans évènement à 5 ans
Les ostéosarcomes: étiologie Altérations des gènes contrôlant le cycle cellulaire p53 prb c-myc p16 Altérations de l expression des gènes impliqués dans la différenciation ostéoblastique Runx2 Ostérix Perte du contrôle du cycle cellulaire Déstabilisation du génome Signalisation induite par WNT Altérations de la différenciation
Les ostéosarcomes : traitements Protocole OS2006 : étude clinique de phase III Chirurgie conservatrice Chimiothérapie préopératoire et postopératoire (suivant l âge) Inhibiteur TopoII Etoposide (VP-16) Agents Alkylants Ifosfamide Anti métabolites Méthotrexate Transcription Réplication Agents intercalants doxorubicine, cisplatine Bisphosphonate : zolédronate
Les ostéosarcomes: résistance aux traitements agents cytotoxiques Import des agents cytotoxiques Export des agents cytotoxiques transporteurs ABC Inactivation des agents cytotoxiques GST Perturbation des points de contrôle du cycle cellulaire Chk1 Réparation de l ADN NER, TLS Altération de l apoptose Bcl-2, Bax, survivine diminution de la réponse apoptotique
Signalisation WNT et développement des ostéosarcomes WIF-1 -Expression de LRP5 dans des tumeurs humaines corrèle avec la présence de métastases et une survie réduite des patients (Hoang et coll., Int J Cancer, 2004) -L inhibition de LRP5 par un dominant négatif (DN) diminue la croissance tumorale et les métastases dans un modèle de tumeurs chez la souris b-catenin GSK3 APC AXIN b-catenin (Guo et coll., Clin Orthop Relat Res, 2008) -WIF-1 est inhibé par des modifications épigénétiques (Kansara et coll., J Clin Invest, 2010) -Altérations fréquentes du gène Apc qui corrèle avec un mauvais pronostic (Entz-Werlé et coll., Neoplasia, 2007) -Les souris Apc1638N/+Twist-null/+ développent des tumeurs de type ostéosarcome (Entz-Werlé et coll., Trans Onc, 2010)
Altérations de la b-caténine dans les ostéosarcomes? -Accumulation de la b-caténine dans le cytoplasme ou dans les noyaux (Haydon et coll., Int J Cancer, 2002) -Accumulation de la b-caténine à la membrane -Inactivation de la voie Wnt (Cai et coll., J Pathol, 2009) Signalisation Wnt et réponse à la chimiothérapie????????
Activation de la voie Wnt/b-caténine/TCF dans des lignées de cellules humaines dérivées d ostéosarcome WRE WRE Plasmide TOPFlash WRE WRE WRE LUCIFERASE 8 7 Cellules d ostéosarcome Cellules ostéoblastiques 6 5 4 3 2 1 0 Activité transcriptionnelle des facteurs TCF
Le syndécan-2 Enzymes Facteurs de croissance Matrice extracellulaire Assemblage Clivage Récepteur Intégrines signalisation -Prolifération -Différenciation -Adhésion/migration -Dépôt de la matrice
Syndécan-2 et apoptose SYNDÉCAN-2 Le SYNDECAN-2 module la signalisation cellulaire pour induire ou favoriser l APOPTOSE E F Y A JNK JNK-P ERK PI3K NFkB PKCδ E F Y A Activité catalytique de PKCd Modrowski et coll., Bone, 2005 Orosco, A. et coll., J Cell Biochem, 2006. Villena, J., et coll., Apoptosis, 2006. APOPTOSE
Syndécan-2 = suppresseur de tumeur Cellules K7M2 sont dérivées d un ostéosarcome spontané chez la souris BalB/c K7M2 K7M2+SYND2 Apoptose Le syndécan-2 module la réponse aux agents de chimiothérapie +Syndécan-2 Doxorubicine sirna Syndécan-2 Doxorubicine
Expression Relative du Syndecan-2 Expression du Syndecan-2 Défaut de syndécan-2 dans les ostéosarcomes PCR Immunohistochimie 1.2 1 0.8 0.6 * 4 3 2 * 0.4 1 0.2 Cellules MG63 U2OS SaOS2 OHS4 Ostéoblastiques Tissus Osseux sains Tissus Tumoraux * Indique P <0,05 Orosco et coll., Cancer Research, 2007
R LU DDCT Les facteurs TCF répriment l expression de syndécan-2 Sites de liaison TCF/LEF 5 UTR LUC ChIP Activité promoteur syndécan-2 3 2,5 2 ARNm syndécan-2 * 2 1 * 1,5 1 0,5 * Indique P <0,05 0 Ctl TCF 0 Ctl sitcf
RLU Wnt/β-caténine/TCF réprime le syndécan-2 WNT FZD Activité Promoteur Syndécan-2 3 2 * * LRP5/6 1 β-caténine TCF 0 contrôle β- caténine Wnt3a * Indique P <0,05 Expression du Syndecan-2
Signalisation Wnt/β-caténine/TCF et chimiorésistance des ostéosarcomes
Viabilité Sélection de cellules résistantes Lignées cellulaires d ostéosarcome Traitement 24h Doxorubicine 50ng/mL 120 semaine 1 Traitement 100 80 60 U2OS Résistantes U2OS semaine 2 40 semaine 3 Traitement 20 0 0 50 100 150 200 ng/ml doxorubicine Traitement semaine 4
Viabilité (% de cellules contrôle) La surexpression de syndécan-2 rétablit la sensibilité à la doxorubicine 100 80 60 40 20 0 10 25 50 75 U2OS U2OS + Syndécan-2 U2OS résistantes U2OS résistantes + Syndécan-2 Doxorubicine (ng/ml)
ΔΔCT La doxorubicine n induit pas le syndécan-2 dans les cellules résistantes Expression du syndécan-2 dans des tumeurs humaines avant Chimiothérapie après Chimiothérapie ARNm du Syndécan-2 3.0 U2OS Cellules U2OS 8012 13301 2.5 2.0 * U2OS Résistantes 1.5 1.0 0.5 Cellules U2OS résistantes 12174 13549 0.0 Doxorubicine - + - + (50ng/ml)
ΔΔ CT ΔΔCT FoxO3a module l induction de syndécan-2 par la Doxorubicine ARNm du syndécan-2 ARNm du syndécan-2 3.0 2.5 * 2.5 2.0 * * 2.0 1.5 1.5 1.0 1.0 0.5 0.0 0.5 0.0 Vecteur vide FoxO3a Contrôle Doxorubicine Doxorubicine + sifoxo3a * Indique P <0,05
R LU FoxO3a module l induction de syndécan-2 par la doxorubicine de façon indirecte AACA Site de liaison pour FoxO3a Activité de p-3,62-luc Région 5 du syndécan-2 p-3.62-luc 5 UTR LUC 2.5 2.0 AACA * ATCA * ATCA Site de liaison pour FoxO3a muté 1.5 1.0 p-3.62-luc 5 UTR LUC 0.5 0.0 Région 5 du syndécan-2 * Indique P <0,05
FoxO3a interagit avec β-caténine sous stress oxydatif Essers et Coll, Science, 2005
% Input ΔΔ CT Doxorubicine/FoxO3a interagit avec WNT/β-caténine/TCF 100 Liaison de TCF4 au promoteur du syndécan-2 Expression du syndécan-2 80 60 40 Doxo FoxO* Wnt b-cat TCF 1.8 1.4 1.0 0.6 * 20 0 Doxorubicine - + 0.2 Doxorubicine - + + TCF - + - b-cat* - - + * Indique P< 0,05
Résumé Cellules sensibles Cellules résistantes Doxorubicine Wnt Doxorubicine Wnt Syndécan-2 FoxO bcat TCF Syndécan-2 bcat TCF Transcription du syndécan-2 Transcription du syndécan-2
Effets des inhibiteurs Wnt sur la réponse à la doxorubicine WNT sfrp-1 DKK1 FZD LRP5/6 β-caténine TCF PKF115-584 Expression du Syndecan- 2/ Réponse à la doxorubicine?
R LU (cellules traitées/ cellules non-traitées) Effets des inhibiteurs de Wnt sur l activité de la doxorubicine FoxO3a β-caténine Activité transcriptionelle des facteurs FoxO Contrôle U2OS U2OS résistantes 2.5 * * 2.0 Doxorubicine 1.5 * 1.0 0.5 0.0 Doxorubicine + sfrp1/ Dkk1 * Indique P <0,05 Doxorubicine + PKF 115-584 β-caténine est nécessaire à l action de la Doxorubicine
L inhibition de l activité TCF réduit la viabilité cellulaire in vitro Viabilité cellulaire (% des contrôles) 120 100 Cellules sensibles Cellules résistantes 80 b 60 40 a b a b 20 0 Doxorubicine - + - + - + - + + PKF115 - - + + - - + + H&E/Safran
Modèle d ostéosarcomes in vivo PKF 115-584 0,5mg/kg IP J-0 J-21 J-28 J-35 PBS Injection des cellules Doxorubicine 2 mg/kg IV Doxorubicine 2 mg/kg IV Sacrifice K7M2
Volume Tumoral (mm3) L inhibition de l activité transcriptionnelle TCF augmente l effet de la doxorubicine in vivo p= 0.0012 1400 1200 p= 0.028 p= 0.07 * 1000 800 600 400 200 0 Sans cellules * K7M2 Doxorubicine K7M2 K7M2 Doxorubicine + PKF 115-584
Conclusions -Activation de la signalisation Wnt/b-caténine/TCF Freine la réponse aux agents de chimiothérapie -La b-caténine est impliquée dans l inhibition et l induction de la réponse cellulaire Inhibition ciblée de l activité des facteurs TCF = Nouvelle stratégie thérapeutique dans l ostéosarcome?
β-caténine : molécule clé du système Wnt Ostéoprogéniteur Pré-ostéoblaste Ostéoblaste Prolifération Différenciation Survie Renouvellement Engagement CSM + + + b-caténine + - + + + Minéralisation de la matrice Multifonctions de la signalisation Wnt/β-caténine dans les cellules souches embryonnaires dépend de: Ostéocyte 1- expression des effecteurs Wnt 2- recrutement de co-facteurs par la β-caténine Apoptose D après Khosla, 2008
Activités transcriptionnelles et épigénétiques de la b-caténine
Développement de petites molécules ciblant spécifiquement une activité de la b-caténine PKF-115-584 ICG-001 Apoptose des cellules cancéreuses CBP b-caténine TCF IQ-1 Renouvellement des cellules souches p300 Phénotype Cellules Souche Initiation de la Différenciation