Les techniques d Immuno-analyse. Ingrid Marcq 31/01/2017

Les techniques d Immuno-analyse Ingrid Marcq 31/01/2017 Ingrid.marcq@u-picardie.fr

CALENDRIER COURS IMMUNOLOGIE TECHNIQUE TEC2 Le 31/01/2017 2.00 08 h 30 10 h 30 Immunologie TEC2 Le 07/02/2017 2.00 08 h 30 10 h 30 Immunologie TEC2 Le 28/02/2017 2.00 08 h 30 10 h 30 Immunologie TEC2 Le 7/03/2017 2.00 08 h 30 10 h 30 Immunologie TEC2 Le 14/03/2017 2.00 08 h 30 10 h 30 Immunologie TEC2 Le 21/03/2017 2.00 08 h 30 10 h 30 Immunologie TEC2 Le 28/03/2017 2.00 08 h 30 10 h 30 Immunologie TEC2 4/04/2016 1.00 9h-10h Eval d'immuno

Immunité Ensemble des réactions tendant à éliminer des substances étrangères immunis : dispensé de, exempté de 3 fonctions fondamentales du système immunitaire Définition de l individu (système HLA) Reconnaissance de signaux étrangers (non soi) Organisation de la défense du soi

Survol historique 430 av JC Thucydide (historien de la guerre du Péloponnèse): ceux qui étaient guéris de la «peste» pouvaient prendre soin des malades 1798 Edward Jenner utilisation du virus de la vaccine pour vacciner contre la variole => vaccination 1883 Elie Metchnikoff la phagocytose => immunité innée cellulaire 1885 Louis Pasteur vaccination humaine contre la rage 1890 Emil Von Behring et Shibasaburo Kitasato les antitoxines antidiphtérique dans le sérum => immunoglobulines

Survol historique 1895 Jules Bordet le complément => mécanisme de la réponse innée 1958 Mac Farlane Burnet et Niels Jerne théorie de la sélection clonale => réponse spécifique de l Ag 1958 Jean Dausset le système HLA => chaque individu est immunologiquement unique

Les propriétés cardinales de l immunologie Le système immunitaire distingue entre «soi» et «non soi» - rejet du «non-soi» (antigènes) - tolérance du «soi» (absence de réponse vis à vis du «soi»)

Le système immunitaire se compose de 2 axes L immunité innée Mécanisme de défense ancestral (chez tous les organismes multicellulaires) Sentinelles contre les microorganismes L immunité adaptative Mécanisme de défense très spécifique apparu plus tardivement dans l évolution Cellules Macrophages, Cellules dendritiques Neutrophiles Composés solubles Complément, Cytokines et chimiokines Cellules Lymphocytes T et B Composés solubles Anticorps Cytokines et chimiokines NK, (NKT, LTγδ) 2 fonctions essentielles Eliminer le pathogène Activer le système adaptatif 2 fonctions essentielles Induire une réponse spécifique Activer une mémoire

Pourquoi de l immunologie Développement important des immunothérapies Traitement par anticorps polyclonaux, monoclonaux (immunopharmacologie) Thérapie cellulaire (basée sur les cellules dendritiques, ) Thérapie génique Nouvelles stratégies vaccinales Les techniques immunologiques sont la base des méthodes diagnostiques Sérodiagnostic par ELISA, agglutination, précipitation Analyse cellulaire par cytométrie en flux

Les techniques d Immuno-analyse Ingrid Marcq 31/01/2017 Ingrid.marcq@u-picardie.fr

TECHNIQUES D IMMUNO-ANALYSE L étude du système immunitaire nécessite l utilisation d un grand nombre de techniques et procédés dont certains sont empruntés à d autres disciplines telles la biochimie, la génétique moléculaire par exemple Toutefois, l immunologie a aussi développé ses propres techniques et outils, basés en particulier sur les anticorps, dont les applications sont très importantes en biologie.

TECHNIQUES D IMMUNO-ANALYSE La spécificité de la réaction Ag-Ac permet : - la recherche, l'identification ou le dosage de toute molécule capable d'induire la production d'anticorps - la recherche, l'identification ou le dosage d'anticorps grâce à l'antigène correspondant Liaison Ag-Ac ---> réaction équilibrée réaction réversible

TECHNIQUES D IMMUNO-ANALYSE Lors de la réaction Ag-Ac, deux cas peuvent se présenter : Observer la survenue de phénomènes secondaires, physiques ou biologiques, inconstants mais visibles d où différents types de technique: - Précipitation - Agglutination immunologique - Techniques du complément - Neutralisation L'union des molécules d'ag au Fab des anticorps, est un phénomène constant mais invisible Cette union peut être mise en évidence par le marquage de l Ag ou de l Ac ce sont les techniques dites de marquage : - Immunofluorescence - Radio-immunologie - Immuno-enzymologie

TECHNIQUES D IMMUNO-ANALYSE Techniques d immuno-analyse (exples) But: - Mise en évidence des antigènes - Mise en évidence des anticorps

TECHNIQUES D IMMUNO-ANALYSE Mise en évidence des antigènes (Ag) - Où: - dans les cellules - dans les tissus - dans les liquides biologiques (sérum, LCR, urine, ) - Comment : au moyen d anticorps - Polyclonaux - Monoclonaux

TECHNIQUES D IMMUNO-ANALYSE Mise en évidence des anticorps (Ac) - Où: - essentiellement dans le sérum - plus rarement dans les autres liquides biologiques (sérum, LCR, urines, ) - Comment : au moyen d antigènes - le germe lui même - les tissus

Les réactions antigènes anticorps et ses applications Ingrid Marcq Ingrid.marcq@u-picardie.fr

Les réactions antigènes anticorps La réaction antigène - anticorps (Ag-Ac) est due à l'interaction entre les épitopes de l' antigène et les paratopes de l'anticorps Elle fait intervenir quatre types de liaisons non covalentes (des liaisons hydrogènes, des liaisons électrostatiques, des liaisons hydrophobes et les forces de Van der Waals) Les Ac constituent des sondes moléculaires spécifiques vis à vis de n'importe quelle substance antigénique La réaction Ag-Ac a deux grands types d'applications : -La détection et le dosage des antigènes (par des méthodes dont il faut vérifier la spécificité, la reproductibilité et la sensibilité). -La détection et le titrage des anticorps (vis-à-vis d'un Ag ou d'un mélange d'ag).

DEFINITIONS Paratope :partie de l anticorps qui assure la fonction de reconnaissance de l antigène Chaque paratope reconnait de façon spécifique une partie de l épitope d'un antigène C'est le site de reconnaissance de l'anticorps. Le paratope se trouve aux extrémités des chaines lourdes (heavy) et légères (light) d'un anticorps dans sa partie variable

LES ANTICORPS (Ac) Site de fixation à l antigène ou PARATOPE Partie variable Chaînes lourdes (H) Chaîne légère (L) Chaîne légère (L) Partie constante Fc séquence en aa identique pour chaque famille d Ac Ponts disulfures

LES ANTICORPS (Ac)

LES ANTICORPS (Ac) isotypes = définissent les classes et sous classes : - IgG (1, II, III, IV) - Ig A (I, II) - Ig M, Ig D, Ig E - Ig kappa, Ig lamda structure : différents domaines d'environ 110 AA Les 2 chaînes L et H sont identiques 2 à 2 domaines constants : propriétés effectrices de l'anticorps : - fixation du complément (IgG et IgM) - passage transplacentaire (IgG : immunisation passive du nouveau-né)

LES ANTICORPS (Ac) Les IgG représentent 80% des Ac circulants. IgM qui sont une association de 5 Ig IgA qui sont fabriquées au niveau des muqueuses. IgE sont impliquées dans les manifestations allergiques.

Forces interactions Ag/Ac Nature des liaisons - faible énergie - dépendent de la complémentarité entre le paratope et l'épitope - non covalentes 1- forces électrostatiques = liaisons ioniques : - entre 2 groupements ioniques - 2 à 5 kcal/mol 2- liaison hydrogène : - entre atomes électropositifs et électronégatifs - faibles

3- forces de van der Walls : - les plus faibles - dues au mouvement des électron dans la molécule : formation de dipôles SS 4- liaisons hydrophobes : - entre groupements polaires ou hydrophobes - faibles

Interactions Ag/Ac Concept clé/serrure Le site de liaison de l anticorps est situé dans la partie Fab de la molécule et formé par la mise en commun des régions hypervariables (CDR) des chaînes lourdes et légères. Le concept des réactions antigène-anticorps peut donc être assimilé à celui d une clé (l antigène) qui s insère dans une serrure (le site anticorps). Liaisons non-covalentes Les liaisons qui maintiennent l antigène fixé dans le site anticorps sont de nature non-covalentes. Cela inclue des liaisons hydrogènes, des liaisons électrostatiques, des forces de Van der Waals et des liaisons hydrophobes. De multiples liaisons entre l antigène et l anticorps assurent une interaction stable entre ces deux molécules. Réversibilité Comme les réactions antigène-anticorps se produisent par l intermédiaire de liaisons non-covalentes, elles sont par nature réversibles.

Les réactions antigènes anticorps Fondées sur la spécificité de la liaison épitope-paratope Globules rouges de mouton (GRM) 3 semaines

Les réactions antigènes anticorps Fondées sur la spécificité de la liaison épitope-paratope GRM 3 semaines Sérum+GRM Sérum+GRB GRH

Les réactions antigènes anticorps Fondées sur la spécificité de la liaison épitope-paratope Sérum+GRM: Agglutination GRM 3 semaines

Les réactions antigènes anticorps Fondées sur la spécificité de la liaison épitope-paratope Sérum+GRM: Agglutination GRM 3 semaines Sérum+GRB: RAS GRH: RAS

Définitions Antigène = toute substance capable de se lier spécifiquement à un anticorps (Ig, BCR) ou TCR Immunogène = substance qui provoque une réponse immunitaire spécifique quand elle est introduite dans un organisme Tous les immunogènes sont des antigènes mais pas l'inverse (ex : haptènes) Un haptène est une molécule de faible poids moléculaire antigénique, c'est-à-dire capable d'être reconnue par le système immunitaire (notamment à travers les anticorps mais non immunogène; incapable de l'induire seule, sauf s'il est couplé à une molécule porteuse ("carrier"), ce qui confère l'immunogénicité de l'haptène. Pour rendre un haptène immunogène, il faut le fixer sur une protéine porteuse. Epitope = structure reconnue, qui se lie au paratope de l'anticorps. Une protéine peut contenir plusieurs dizaines d'épitopes identiques, ou le plus souvent différents. Les épitopes peuvent être séquentiels (ils possèdent des AA se suivent la structure primaire), ou conformationnels (les AA ne se suivent pas dans la structure primaire mais sont proches dans l'espace). Paratope = structure qui se lie à l'épitope de l'antigène

LA NOTION D ANTIGENE Il existe deux grands types d antigène (Ag) Les antigènes particulaires Les antigènes solubles Présents dans l organisme, ils induisent la production d anticorps (Ac)

LA NOTION D ANTIGENE Il existe deux grands types d antigène (Ag) Les antigènes particulaires Les antigènes solubles Nature physique de l antigène La nature physique de l'antigène influence la façon de mesurer sa réaction avec l anticorps. Si l'antigène est de nature particulaire, on recherche généralement une agglutination de l'antigène par l'anticorps. Si l'antigène est soluble, on privilégie la recherche d une précipitation de l'antigène après la production de larges complexes antigène-anticorps insolubles.

Les différents types d antigènes Certains antigènes correspondent à des éléments cellulaires étrangers ou non à l organisme : on parle d antigènes particulaires Bacille Coque Bactéries Virus Cellules cancéreuses Les antigènes particulaires sont bien souvent des particules infectieuses pathogènes responsables de maladies bactériennes, virales, parasitaires

Les différents types d antigènes Certains antigènes correspondent à des éléments moléculaires étrangers à l organisme : on parle d antigènes solubles Effets pathogènes Bacille Toxine microbienne Un antigène soluble peut être une simple molécule toxique, appelée TOXINE, fabriquée par une bactérie pathogène Quelques toxines connues : toxine tétanique, toxine botulique, toxine cholérique, toxine diphtérique

La capacité d un Ag à induire la fabrication d Ac par les plasmocytes est due à l existence de petites zones précises, localisées sur l antigène, appelées DETERMINANTS ANTIGENIQUES ou EPITOPES Déterminant antigénique 1 Déterminant antigénique 2 Ag particulaire Déterminant antigénique 2 Déterminant antigénique 1 Un antigène, qu il soit particulaire ou soluble, peut comporter un ou plusieurs déterminants antigéniques ou épitopes

Affinité-avidité - Il y a donc des forces d'attraction et de répulsion entre le paratope et l'épitope. L'énergie de liaison est élevée entre le paratope et l'épitope car toutes ces liaisons sont de faible énergie mais sont très nombreuses. - L'avidité est l'intensité de l'ensemble des forces des interactions non covalentes entre une macromolécule biologique et un ligand qui se fixe sur plusieurs sites à sa surface. Elle se distingue ainsi de l'affinité qui est la force d'une seule interaction non covalente. - L avidité décrit l affinité de plusieurs paratopes sur la même molécule: 2 paratopes sur la molécule d IgG Par effet coopératif: la fixation du premier paratope facilite la fixation du second 10 paratopes sur la molécule d IgM : les IgM sont beaucoup plus avides que les IgG

Réaction Ag-Ac et affinité Ag + Ac K 1 Ag-Ac K -1 K 1 (L/mol/s) constante de vitesse aller (association) K -1 (s -1 ) constante de vitesse retour (dissociation) Ka = K 1 /K -1 constante d association = affinité Rem: le modèle concerne la liaison d un site de liaison Ac avec un Ag monovalent

Affinité-avidité L'avidité est une mesure de la force globale de la liaison d'un antigène possédant des déterminants antigéniques multiples avec des anticorps polyvalents L avidité est influencée à la fois par la valence de l'anticorps et la valence de l'antigène. L affinité fait donc référence à la force de liaison entre un déterminant antigénique unique et un site anticorps individuel alors que l'avidité fait référence à la force globale de la liaison entre les antigènes et les anticorps multivalents.

Cross réactivité La cross-réactivité (encore appelée réaction croisée) fait référence à la capacité d un site anticorps donné à réagir avec plus d un déterminant antigénique ou encore à la capacité d une population polyclonale d anticorps à réagir avec plus d un antigène Elles peuvent résulter de l existence d un épitope en commun entre l antigène donnant lieu à la réaction croisée et celui ayant servi à l immunisation ou encore de la reconnaissance d un épitope possédant une structure similaire dans l antigène cross-réactif et l antigène immunisant (multispécificité)

Applications Recherche d un Ag ou d un Ac (aspect qualitatif) Dosage d un Ag ou d un Ac (aspect quantitatif) Implique de posséder l un des réactifs et d être sûr de sa qualité (spécificité et titre) Recherche et dosage d un Ac qui est le témoin: -d un contact entre le SI et une molécule étrangère -ou d un dérèglement du SI (autoag dans les MAI) Exemples: sérodiagnostic des maladies infectieuses: rubéole, toxoplasmose, typhoïde Intérêt de la détermination de l isotype (IgM si infection récente) Recherche et dosage d une molécule à spécificité antigénique dans un mélange (ne nécessite pas son extraction pour le dosage) Nécessite un Ac de haute spécificité qui est utilisé comme réactif

Techniques immunologiques Attention: un Ac peut lui aussi être un Ag vis à vis d un Ac anti-ac Un couple Ac:Ac peut être utilisé pour la mise en évidence Ag ou Ac

Réaction Ag/Ac: complexe immun

Différence entre sérum polyclonal et Ac polyclonal

Réaction Ag/Ac: complexe immun sérum polyclonal (= sérum et humain =immum serum = anticorps polyclonal) : - c'est un sérum qui contient un mélange d'anticorps provenant de LB différents - obtention : on injecte un antigène avec 3 épitopes à un lapin; il produit 3 LB différents reconnaissant les 3 épitopes ; différenciation en 3 plasmocytes différents et donc sécrétion de 3 anticorps. Ces anticorps reconnaissent le même antigène mais avec des spécificités, des affinités différentes selon les épitopes; ils peuvent aussi avoir des isotypes différents.

Production des Ac polyclonaux Choix de l animal: lapin, chèvre, singe, âne, cheval, poule, dindon Critères essentiels: quantité de sérum, distance génétique Rarement la souris Pour les immunodosages (dosage d une protéine à l aide d un anticorps), l anticorps ne doit reconnaître que la protéine à doser La pureté de l antigène utilisée pour l immunisation de l animal doit être la plus parfaite possible L immunisation se fait par voie intradermique en présence d adjuvant Des rappels permettent d augmenter l affinité des anticorps Ils sont ensuite purifiés par chromatographie d affinité à partir du sérum

Anticorps polyclonaux GRM Ac anti GRM Le globule rouge est une mosaïque d épitopes Anticorps polyclonaux

Production d un anticorps monoclonal Primo immunisation 1-3 mois Rappel Saignée Tests 2 semaines 10 jours Développer et tester la méthode de criblage

Production d un des anticorps monoclonaux monoclonal Facteurs à vérifier pour produire des mab: L'immunisation Les sources d'antigènes degré de pureté: élimination des contaminants Nature de l Ag: haptènes, protéines porteuses L'immunisation de l'animal dose et forme de l antigène adjuvants voie et nombre d injection

Adjuvant Augmentation de l intensité de la réponse immunitaire Accroissement de l effet mémoire Stimulants non spécifiques de la réponse immunitaire 3 composantes principales: huile minérale/eau: protection de l antigène, transport de l antigène particules: agrégation de l antigène, dépôt antigénique parois de bactéries: réaction inflammatoire (Innée, danger)

Technique d hybridation cellulaire ou hybridome Les partenaires de fusion cellules B extraites d organes lymphoïdes secondaires (rate, ganglions) cellules myélomateuses : cellules MOPC de souris Balb/c HGPRT- Méthode de fusion Chimique Physique Sélection, clonage Expansion

Technique d hybridation cellulaire ou hybridome Fusion chimique: Poly Ethylène Glycol (PEG) fusion des membranes cytoplasmiques Bon rendement de fusion DMSO renforce la viabilité cellulaire utilisation de facteurs de «rencontre» Fusion physique : Electrofusion Ouverture de pores dans la cellule par des pulses électriques technique onéreuse moins destructrice

Technique d hybridation cellulaire ou hybridome

Préparation des anticorps monoclonaux IMMUNISATION contre un antigène A Lymphocytes (splénocytes) FUSION Plasmocytes (lignée immortalisée-myélome) polyéthylène glycol (PEG) Cellules cancéreuses: - pouvoir de se mul@plier ex-vivo - Absence de l enzyme: hypoxanthine-guanine phosphorybosyltranferase HGPRT è enzyme impliquée dans la synthèse des nucléo@des: voie de sauvetage (par opposi@on à la voie de novo) - La sélecaon des cellules fusionnées se fait avec les composés chimiques: è Hypoxanthine, aminoptérine et la thymidine (milieu HTA) - L'aminoptérine, en bloquant la synthèse de novo des nucléo@des, oblige les cellules à u@liser la voie de sauvetage - L'hypoxanthine et la thymidine = substrats de la voie de sauvetage è Sélec@on des cellules ayant le gène HGPRT: hybridomes è Les splénocytes et cellules cancéreuses non fusionnées: apoptose è Développement de colonies dans les puits de culture

Préparation des anticorps monoclonaux IMMUNISATION contre un antigène A Lymphocytes (splénocytes) FUSION Plasmocytes (lignée immortalisée-myélome) polyéthylène glycol (PEG) CLONAGE Culture en milieu HAT Hypoxanthine Aminopterine Thymidine IDENTIFICATION des clones anti-a Culture in vitro 10 µg Ig/ml Multiplication in vivo (ascite) 5-20 mg Ig/ml MULTIPLICATION des hybridomes

Méthode de criblage «screening» Reproductible Fiable Rapide Bon marché Automatisable

Réaction Ag/Ac: complexe immun anticorps monoclonal : c'est un anticorps provenant d'un seule clone de LB stimulé obtention : technique in-vitro d'hybridation lymphocytaire : immunisation d'une souris avec un antigène donc production de LB qui se différencient en plasmocytes On récupère la rate de cette souris On immortalise les cellules par fusion avec des cellules myélomateuses (cellule tumorale provenant de la moelle osseuse) = hybridomes On sépare ces cellules L'anticorps monoclonal produit est homogène : il est de même isotype, même allotype, même idiotype (spécificité)

Production d un anticorps monoclonal Les plus souvent l animal est la souris (plus rarement le rat, rarement le lapin) Principe: Les plasmocytes normaux secrètent des anticorps mais sont incapables de proliférer On provoque la fusion d un plasmocyte producteur d anticorps avec une cellule myélomateuse, incapable de produire des immunoglobulines afin de l immortaliser Les hybridomes ainsi constitués peuvent proliférer à l infini L animal est immunisé comme précédemment Il n est pas nécessaire que l antigène soit pur Les lymphocytes de la rate sont prélevés, mélangés aux cellules myélomateuses, un produit de fusion est ajouté Par la suite les hybrides sont isolés par dilution limite sur milieu sélectif Une méthode de criblage permettra de sélectionner que les hybridomes sécréteurs

Production d un anticorps monoclonal

Critères de qualité Spécificité Reconnaissance d un seul motif épitopique Réactions croisées, non-spécifiques Maintient de l activité après modification chimique L'affinité Élevée Constante et contrôlée Avantages de ce type de production Constante reproductible Utilisation de la souris

Ac monocloanux utilisés en thérapies anti-tumorales

Exemples d anticorps monoclonaux thérapeutiques Anticorps Cible Mécanisme Indication omalizumab IgE Blocage de la liaison au Fc RI des mastocytes et des basophiles éculizumab C5 Blocage de la formation du complexe d attaque membranaire du complément canakinumab IL-1 Neutralisation de l IL- 1 ustékinumab IL-12, IL-23 Neutralisation de l IL- 12 et de l IL-23 par reconnaissance de la portion p40 commune Asthme allergique Hémoglobinurie nocturne paroxystique, Syndromes hémolytiques et urémiques atypiques syndrome de Muckle-Wells (maladie autoinflammatoire) Psoriasis

Limites de ce type de production La souris ne reconnaît pas tous les motifs antigéniques Répertoire immunologique limité Manifestations secondaires Inflammation Nécrose tissulaire Difficulté pour obtenir des anticorps monoclonaux humains Immortalisation des cellules B humaines très difficile Volet éthique de la manipulation de cellules humaines Qualité des plasmocytes humains très variable 10 9 cellules B par immunisation

Anticorps monoclonaux-polyclonaux Polyclonaux: -avantages: haute affinité, précipitants -inconvénients: risques de réactions croisées fréquents, bruit de fond élevé, différents avec chaque animal Monoclonaux: -avantages: grande spécificité, quantité illimitée -inconvénients: non précipitants. Si réaction croisée, elle est totale

Production in vitro Avantages Pas d utilisation d animal Production de grandes quantité d anticorps Pas de contraintes légales à l utilisation d animaux Pas de personnel d animalerie Pas de contaminant Inconvénients Tous les hybridomes ne prolifèrent pas en réacteur Nécessite l utilisation de sérum de veau fœtal Problèmes lorsque les glycosylations sont nécessaires Productions moins concentrées. Contamination par les hybridomes morts Mab de plus faible affinité Plus chère pour de petites production

Production in vivo Avantages Concentration élevée en Mab Pas d intermédiaire industriels Inconvénients Utilisation de l animal Présence de protéines murines Contaminants Stress de la souris

Les différentes formes d anticorps recombinants

Anticorps recombinants Anticorps monoclonaux (EpCAM-CD3) (CD3) (CD20*) (Agg- Plq) (CD20) (TNF-α) (CD25) (EGFR) (HER2) (CD25) (VRS) (CD52) (CD33) (CD11a) (VEGF) (IgE) (α4β1) (VEGF) (C5-C ) (TNF-α) (IL-6) (TNF-α) (EGFR) (p40 IL12/23) (TNF-α) (IL-1/6) (CD20) (R-TNF-α) (CD2) (CTLA-4) (IL-1) (TPO) (purpura thrombo. idio)

Terminologies des mabs Anticorps monoclonaux: mabs - omab: Ac murin - ximab: Ac chimérique - zumab: Ac humanisé - (m) umab: Ac humain Ibrutimomab anti-cd20 Rituximab anti-cd20 Trastuzumab anti-her2 Ofatumumab anti-cd20