Cours du 02/12/2008 Professeur : P. Soussan Ronéotypeur : Catherine MILLOT Ronéocorrecteur : Marion PAKEY Le Virus de l hépatite B : VHB Note du prof : Etant donné l heure tardive et je sais que vous êtes fatigués, je vous remercie d avoir fait l effort de venir au cours! On va faire un cours interactif où chacun participe. Introduction Tropisme du VHB : le foie Question : où est le foie? Il est situé au niveau de l hypochondre droit. Utilité du foie? -détoxification -métabolisme des glucides, des protides et des lipides (cholestérol) (le foie c est Renault et Peugeot mélangé avec Hyundai!) -synthèse de la bile -rôle hématopoïétique au cours de l embryogenèse. Le foie est organisé en travées d hépatocytes.il y a plusieurs lobes, dans le lobe il y a les lobules qui sont définis par un espace porte et une veine centro- lobulaire. Les travées d hépatocytes sont vascularisées par un système capillaire sanguin qui permet les échanges entre le foie et le sang pour exporter ce que le foie a synthétisé. Le foie est constitué a 70% d hépatocytes mais on y trouve également des cellules de Kupffer (macrophages), des cellules de Ito (= myofibroblastes importants dans la fibrogenèse), des duct biliaires, des cellules endothéliales. Une des caractéristique essentielle du foie, que l on connaît depuis la mythologie (mythe de Prométhée), c est sa capacité de régénération car il possède des cellules progénitrices (ou cellules souches ou cellules ovales). Tous les hépatocytes sont capables d entrer en mitose car le foie est un organe quiescent.même si on enlève les 2/3 du foie (=hépatectomie au 2/3), il y a une régénération complète, poids et taille identiques. 1
Le VHB est un virus présent en quantité très importante dans le sang. Il synthétise une quantité de protéines virales très importante. Si on regarde le sérum d un patient porteur du VHB, on observe : -des particules de forme sphérique ou en bâtonnet : ce sont les protéines d enveloppe du VHB= Ag HBs (à l intérieur il n y a rien) - des particules infectieuses= particules de Dane enveloppées, de 42 nm de diamètre mais il y en a beaucoup moins que les particules vides. Question : quelle est la différence entre un virus et une bactérie? Rappel : taille globule rouge=7µm=7000 nm VHB= 42nm (c est un des plus petit virus humain) 200 fois plus petit qu un globule rouge. La différence entre un virus et une bactérie et entre une bactérie d un parasite? La taille! Un virus est invisible en microscopie optique Une bactérie est visible en microscopie optique par coloration de Gram Un parasite est visible à la loupe binoculaire. Le virus est ultrafiltrable : les filtres considérés comme stériles (220 nm) laissent passer les virus alors que les bactéries ne passent pas. De plus, le virus est un parasite absolu c'est-à-dire qu il ne peut pas vivre sans sa cellule hôte, il est incapable de se répliquer alors qu une bactérie peut se répliquer en dehors du milieu intra- cellulaire. Le VHB est un virus enveloppé donc fragile car il possède une membrane et si on détruit cette enveloppe, le virus n est plus du tout infectieux. L enveloppe est sensible à l eau et aux solvants. Pourquoi un virus dans l eau est sensible? A cause du choc hypotonique : l eau rentre dans la cellule, celle-ci gonfle et l enveloppe finit par éclater le virus n est plus infectieux. Transmission inter- humaine directe : Sang- sexe- sa mère (=materno-fœtale) (se rappeler des 3 S dixit le prof) Les particules de Dane : L enveloppe est une bicouche phospholipidique qui provient du réticulum endoplasmique. Sur l enveloppe, on a 3 types de boules : - les boules vertes=ag HBs (hépatite B surface) - les petites boules bleu qu on peut retrouver sur les boules vertes= protéines moyennes du VHB composées de l Ag HBs et du domaine Pré-S2. C est la protéine moyenne - une grosse boule bleue sur la petite boule bleue (mais on les voit plus rarement)= grande protéine d enveloppe avec domaines HBs, Pré-S2, Pré-S1, et qui peut être dirigée soit vers l intérieur où elle interagit avec la nucléocapside icosaédrique soit vers l extérieur et permet ainsi la reconnaissance du récepteur. Dans l enveloppe, on retrouve la nucléocapside icosaédrique très résistante et qui protège le génome viral qui est un ADN circulaire partiellement bicaténaire. 2
Epidémiologie 350-400 millions de porteurs chroniques de ce virus dans le monde (pas beaucoup en France mais surtout en Chine). Pour en arriver à ce chiffre, on considère que 2 milliards de la population mondiale a été en contact avec ce virus (sur 6 milliards d habitants!) Pour le VIH : environ 40 millions de personnes infectées dans le monde Pour le VHC : 170 millions dans le monde Le VHB est une infection virale qui confère un facteur de risque plus important de développer un hépatocarcinome (facteur 100 pour le VHB, facteur 250 pour le HPV de déclencher un cancer du col de l utérus). 1 million de décès par an dans le monde. Traitement -interféron mais ne fonctionne que dans 30% des cas -analogues nucléosidiques mais ils peuvent entraîner une émergence de résistancs aux traitements. Vaccin recombinant mais toute vaccination va activer le système immunitaire et risque de déclencher une poussée de pathologie auto-immune. Chez les patients ayant des antécédents de pathologie auto-immune, le vaccin peut induire une poussée de sclérose en plaque donc évaluation bénéfice/risque. Prévalence du VHB dans le monde 3 régions - Afrique Subsaharienne - Asie du sud est (Chine+++) - Groenland Histoire naturelle de l infection VHB Les 3 S : Sang- Sexe- Sa mère (materno-fœtal) 3
Période d incubation : 4 à 24 semaines (elle est plus ou moins longue) Il y a contact avec le VHB puis arrive l infection aigue. Dans 80% des cas, elle est totalement asymptomatique. Dans 20% des cas, elle est associée à une hépatite aigue qui peut être fulminante dans 0.1% des cas. Traitement de l hépatite fulminante (quand 90 % des hépatocytes sont touchés): transplantation sinon décès très rapide. Manifestations de l hépatite aigue : - douleur à l hypochondre droit - ictère avec bilirubine conjuguée - urines foncées - selles décolorées - ASAT/ALAT (cytolyse hépatique) Evolution vers la guérison dans 95% des cas Dans 5% des cas, persistance VHB et passage à la chronicité (=présence de l Ag HBs sur au moins 6 mois). L infection chronique peut évoluer sur 2 modes - soit portage asymptomatique - soit associé à une hépatite chronique (cycles permanents de cytolyse/ régénération) qui va évoluer vers la cirrhose. Cirrhose = tissu cellulaire qui est remplacé par du tissu fibreux, sécrété par les cellules d Ito. On a des nodules de régénération entourés par fibrose annulaire ce qui entraîne une diminution de la vascularisation du nodule de régénération donc la cirrhose est un facteur de risque majeur à l hépatocarcinome. Ceci est vrai dans les pays où ça n évolue pas de manière endémique (où l infection se fait à l age adulte) Europe du Nord, Etats-Unis En Asie du sud-est et Afrique Subsaharienne, la transmission se fait au stade périnatal passage à la chronicité dans 80% des cas (20% évoluent vers la cirrhose et 50% vers le cancer du foie) Au niveau de l hépatocyte au cours de l infection aigue, le VHB infecte l hépatocyte production de virus réponse immunitaire humorale (Ac anti-hbs) et cellulaire sécrétion de cytokines TNFα et IFNγ qui sont à l origine de nécrose et apoptose hépatocytaire donc c est en fait la réponse immunitaire qui détruit le foie et non directement le virus. Dans 5% des cas, dû au niveau de réplication viral, à la variabilité génétique et au système immunitaire de l hôte, on a un phénomène de tolérisation (on tolère le virus) installation infection chronique. Chez le nouveau-né, la tolérisation est plus facile car son système immunitaire n est pas encore mature donc on passe à 80% d infection chronique. Si on compare le sérum d un patient qui a fait une infection aigue et qui a guéri avec le sérum d un patient qui a fait une infection aigue qui a évolué vers la chronicité : - chez le patient qui a guéri de l infection aigue : très forte réponse immunitaire humorale (avec production Ac anti-hbs) et cellulaire (avec CD8 qui expriment plein de cytokines de type Th1) élimination du virus. - Chez le porteur chronique : il n y a quasiment plus de lymphocytes B qui expriment les Ac anti-hbs et au niveau cellulaire, il y a très peu de CD8 cytotoxiques et les quelques CD4 qui restent ont un switch de Th1 Th0 => Tolérisation et persistance du VHB 4
Evolution des infections chroniques liées au VHB 1)Phase de tolérance immunitaire Production importante de virus, quantités phénoménales de protéines d enveloppe qui réussissent à bloquer les Ac par formation de complexes Ac/protéine virale. Tolérance => pas de signes cliniques et de lésions hépatiques. 2)Phase de clairance immunitaire Apparition de lésions inflammatoires Hépatite chronique 3)Phase de rémission On peut guérir spontanément de l infection ou émergence de mutants. Apparition possible d hépatocarcinome 4)Clairance de l Ag HBs Guérison clinique Certains patients peuvent développer une hépatite occulte (présence du génome viral mais absence de marqueurs sérologiques). En résumé : Phase de tolérance puis diminution de la réplication virale associée avec cycle de cytolyse (cytolyse-régénération-cytolyse-régénération ), diminution de la charge virale avec possibilité de guérison ou évolution vers carcinome hépato-cellulaire. De temps en temps, chez les patients qui ont guéri, on peut voir une réactivation virale notamment chez les patients qui ont fait une hépatite occulte. Cancer du foie Quand on superpose les prévalences de l AgHBs et les incidences du cancer hépatique, on remarque une concordance moyenne (Afrique subsaharienne et Asie du sud-est +++). Quand on est infecté par le VHB, il y a un risque de cancer du foie mais il existe aussi des facteurs épi-génétiques qui font que le foie sera plus ou moins protégé (cf anecdote au Groenland où on constate une faible incidence du cancer par rapport à la prévalence du VHB => existence de facteurs épi-génétiques.) De plus, si la corrélation n est pas parfaite, c est qu il existe un autre agent viral important qui est le VHC qui est aussi lié au cancer du foie. Hépatite chronique B ou C => cirrhose par hypertension portale, insuffisance hépatocellulaire, varices oesophagiennes, angiomes stellaires Lors d une cirrhose : apparition de fibres fibronectine-collagène au cours de la fibrose par les cellules d Ito. La synthèse de ces fibres est un processus cicatrisant en attendant la régénération hépatocytaire sauf qu à force de faire des cycles cytolyse-régénérationcytolyse on finit par faire des cycles de cytolyse-cicatrisation-régénération et au fur et à mesure que ça se produit, il y a de plus en plus de tissu cicatriciel de la fibrose et cette fibrose 5
est associée à une diminution de la pénétration des cellules endothéliales => diminution de la vascularisation des hépatocytes => cirrhose (facteur de risque au déclenchement de l hépato-carcinome). Dans le nodule de régénération, la vascularisation est moins bonne et si, dans ce nodule, il y a une mutation cellulaire cela peut conduire à un cancer du foie. Le cancer du foie lié au VHB est oligoclonal ou monoclonal (= 1 cellule-mére va donner toutes les cellules filles du cancer. C est une cellule dans laquelle le génome de l hépatite B peut ne pas être intégré dans le génome cellulaire) Donc on a vu que le génome du VHB peut s intégrer dans le génome cellulaire mais ce n est pas essentiel à sa réplication virale et cette intégration se fait au hasard (elle peut se faire sur tous les chromosomes même les chromosomes germinaux) en revanche pour le VIH, l intégration est essentielle à la réplication. Dans 90% des cas de cancer lié au VHB, il faut qu il y ait un environnement inflammatoire (cycle cytolyse-régénération) et la réponse immunitaire est un mécanisme essentiel à l évolution chronique vers le cancer du foie mais le VHB peut jouer un rôle direct par l intégration au hasard du génome viral dans le génome cellulaire et cette intégration peut être à l origine d une mutagenèse (mutation d oncogènes par exemple) et également certaines protéines virales peuvent avoir une activité trans-activatrice (moduler l expression d oncogènes ou d anti-oncogènes). Biologie moléculaire - petit génome de 3200 pb avec peu de gènes - ADN circulaire partiellement bicaténaire - Famille des Hepadnaviridae - essentiellement 4 gènes Capside (boule jaune) Enveloppe (boules roses, boules rose+ bleu, et boules bleues) Gène codant la protéine HBX (qui sert à activer l expression d oncogènes et la réplication virale) Gène de la polymérase - gènes chevauchants par différents cadres de lecture partiellement chevauchants - le gène de la polymérase virale chevauche la quasi-totalité du génome Au niveau hépatocytaire : Reconnaissance du virus sur le récepteur de l hépatocyte (qu on ne connaît pas encore), le virus rentre par endocytose, fusion de l enveloppe virale avec la membrane de la vésicule d endocytose => libération de la nucléocapside dans le cytoplasme qui migre jusqu au pore nucléaire où il y a libération du génome viral. Le génome viral est un ADN circulaire partiellement bi caténaire et il va être complété en ADN circulaire complètement bi caténaire qui va former l ADNccc ou ADN super enroulé (équivalent d un mini chromosome) donc chez l hépatocyte, on a un nouveau chromosome, en plus des 23 paires, c est un tout petit chromosome qui correspond au génome du VHB et c est cette forme qui sert de matrice à la transcription du VHB. 6
L ADN super enroulé sert de matrice à la transcription pour former des transcrits viraux qui codent pour les protéines du VHB. Ce transcrit viral= ARN pré- génomique fait 3500 bases alors que la structure de l ADN superenroulé fait 3200 bases donc comment faire un ARN de 3500 bases avec une copie d ADN qui fait 3200 bases? En faisant 1,1 fois le tour du génome viral! L ARN polymérase fait le tour complet du génome et rajoute 1/10 e de tour (impossible à faire sur une séquence intégrée du VHB car quand c est intégré c est linéarisé dans les chromosomes donc on ne peut plus faire 1,1 fois le tour). L ARN pré-génomique est essentiel car il permet la synthèse de protéines de capside et de la polymérase virale mais peut également s encapsider dans la nucléocapside. L ARN pré-génomique se met avec la polymérase virale dans la nucléocapside où va se produire le reverse transcription qui est possible avec une ADN pol-arn dép (ou transcriptase inverse). On retrouve la transcriptase inverse pour le VIH et le VHB. A partir de l ARN prégénomique, on fait de l ADN circulaire du génome du VHB. Pourquoi est-il partiellement bi caténaire? Car la nucléocapside va jusqu au réticulum endoplasmique où il y a des glycoprotéines d enveloppe (la glycosylation se fait dans le RE), la nucléocapside reconnaît les glycoprotéines d enveloppe et s enveloppe pour former la particule virale et quand elle rentre dans le RE, la reverse transcription s arrête car il n y a plus de nucléotide dans le RE. Donc le brin complet est le brin de polarité négative car on a utilisé l ARN qui est de polarité positive. Le 1 er brin= brin d ADN de polarité négative et celui qui s arrête est le 2 e brin= brin de polarité positive donc on a un ADN partiellement bi caténaire avec un brin de polarité positive qui est incomplet. Ensuite la particule virale migre et est excrétée par vésicule d exocytose libération dans l espace extracellulaire puis détectée dans le sang. On produit plus de particules vides constituées uniquement de protéines d enveloppe que de particules pleines. Diagnostic On couche avec quelqu un 4 à 24 semaines après : symptomatologie. Mais avant la symptomatologie, dès la 2 e semaine, on peut retrouver Ag HBs et le génome du VHB dans le sang. Pourquoi les symptômes apparaissent tardivement? Car activation de la réponse immunitaire! Il faut attendre que l Ag HBs commence à décroître car les Ac anti HBs commencent à être synthétisés donc la réponse immunitaire est activée cytolyse du foie et là, le patient n est pas bien (on sait qu il a été en contact depuis au moins 6 semaines avec le VHB). Ag HBs diminue, apparition IgM anti HBc dirigés contre la protéine de capside et apparition Ac anti HBc (type IgG anti HBc). IgM anti HBc, qui reste positif jusqu à environ 30 semaines après le contact, est le signe d une infection aigue et dans ce cas, pas de traitement car 95% de chance de guérir.ces IgM anti HBc permettent de différencier une infection aigue d une infection chronique et peuvent réapparaître lors d une réactivation virale. 7
Puis guérison : Ag HBs disparaissent, Ac anti HBs apparaissent.l infection guérie aura comme marqueur : - Ac anti HBc positif - Ac anti HB s positif - Une personne vaccinée: - Ac anti Hbs positif - Ac anti Hbc négatif Chez un porteur chronique du VHB : - Ag HBs positif - Ac anti HBc positif - Les Ac anti HBs sont complexés sous forme de complexe immun car il y a plus d Ag HBs produits que d Ac anti HBs produits (donc Ac anti HBs sont indétectables) Les Ac anti HBc ne sont pas complexés avec les protéines de capside car eux-mêmes sont cachés par l enveloppe du VHB. Réplication du VHB Pas traité en cours Juste quelques mots. Ce n est pas simple de passer d un ARN linéaire à un ADN circulaire partiellement bi caténaire. Une amorce se met sur une structure qui sert à encapsider 1 er saut réplicatif => formation du 1 er brin de polarité négative puis 2 e saut réplicatif => circularisation => forme Rc DNA (relâchée circulaire) => ccc DNA (polymérases virale et cellulaire interviennent) Variabilité génétique du VHB Cette variabilité est extrêmement importante Pour le VHB : 1 mutation à chaque fois qu on fait 100 génomes Pour le VIH : 1 mutation par génome. Ces mutations sont à l origine de la quasi-espèce. Si on démarre sur un codon quelconque, au départ on a UGG puis la reverse transcriptase fait des erreurs dues à un manque d activité de correction (ne possède pas d activité de correction) donc au lieu de prendre un C, elle prend un G et le met en face de l autre G. Une polymérase «normale» voit cette erreur et la corrige mais la reverse transcriptase ne la voit pas et continue. Donc on a un G en face d un G et il n y a donc pas de liaison hydrogène qui se forme et au contraire, ça s écarte au lieu de s associer. Elle peut donc tout à fait changer les codons. Si on part d un virus qui a Ag HBs de couleur rosâtre, violet ; elle fait une 1ere erreur Ag HBs passe à l orangé et l orangé va passer à l orange marqué bronzé rosé violet mais ce violet est associé à une mutation sur la polymérase virale et cette mutation est létale le 8
virus est infectieux mais pas réplicatif il ne redonne pas de virus rosé qui ne redonne pas de virus bronzé Chez les patients infectés, on retrouve plein de différentes espèces virales qui circulent en même temps. Quand on fait une charge virale, on détecte quasiment un seul virus : celui qui se réplique le plus.puis le système immunitaire réagit et le plus fort est détruit mais il y en a un autre qui est moins bien reconnu car il a une couleur d Ag HBs qui est orangé et pas du tout violet il va pouvoir émerger et devient le plus fort mais en se multipliant, il a acquiert de nouvelles mutations qui améliorent sa puissance il devient le plus fort et noie les autres mais les autres sont là en attendant qu une nouvelle pression de sélection (soit par traitement, soit par réponse immunitaire) fasse disparaître le 2 e plus fort pour que les autres puissent émerger. C est ce qui se passe lors d un traitement, on a une pression de sélection thérapeutique jusqu à qu un virus résiste de plus en plus fort et reparte de plus belle. Variabilité génétique Tous les gènes du VHB sont soumis à une variabilité génétique et ils peuvent avoir un impact sur l échappement à la réponse immunitaire, la capacité à tumériser, l échappement aux traitements 2 types d infections virales différentes : - transmission entérale, oro-fécale (VHA, VHE) infections qui sont toujours aigues, jamais chroniques Vaccin pour le VHA - transmission parentérale infection chronique Comparaison VIH, VHB, VHC Les 3 sont enveloppés, à transmission directe VHC : sang+++ Les 2 autres : sang sexe -sa mère Voilà fin de cette ronéo Bon courage à tous 9