Anticorps anti-cytoplasme des neutrophiles (ANCA) : changement de méthode ELISA->Chemiluminescence Isabelle Graf Pisler
Introduction Description de l automate Bioflash Comparaison ELISA vs CLIA Conclusion
Dépistage des ANCA Le dépistage se fait par immunofluorescence sur neutrophiles humains fixés à l éthanol. On peut observer 2 aspects: Fluorescence cytoplasmique : c-anca diffuse granulaire fine Fluorescence périnucléaire : p-anca condensé autour du noyau homogène
Aspect p-anca : artéfact de fixation à l éthanol éthanol permet migration vers le noyau chargé de protéines chargées + formaldéhyde prévient ce déplacement (aspect c-anca) Hoffman G. S. et. al. Arthritis and Rheumatism 1998
Stratégie de dépistage En présence d aspects c ou p une recherche de la spécificité anti-pr3 et anti- MPO est systématiquement réalisée. En cas de demande urgente la recherche d anticorps anti-pr3 et d anti-mpo est directement effectuée. Ce sont des analyses qui doivent être disponibles tous les jours. Le nombre d échantillons testés en même temps est petit. La technique Elisa utilisée auparavant n était pas adaptée à ces conditions.
Désavantages de la technique ELISA Analyse par série uniquement. 2 contrôles négatifs, 1 contrôle positif,2 calibrateurs et 1 contrôle interne doivent être utilisés par série Automatisé sur l appareil DSX.Système ouvert permettant d adapter des coffrets de différentes marques. Nécessite le transfert des réactifs dans des flacons calibrés pour le DSX. Source d erreurs potentielles. Résultats après 2 h-2h30. Sensibilité moins bonne que l immunofluorescence : quelques cas positifs en IFI sont négatifs en ELISA avec clinique significative.
BIO-FLASH Rapid response chemiluminescent Analyser
30 échantillons peuvent être chargés en même temps, le premier résultat est obtenu après 30 minutes puis toutes les minutes. Le chargement peut se faire en continu. Il offre la possibilité théorique de livrer 450 résultats en 8 h. 20 cartouches réactifs peuvent être stockées à bord dans une unité réfrigérée.
Avantages : premiers marqueurs d autoimmunité développés : anti-gbm, anti-pr3,anti-mpo Rapidité des résultats (30 minutes contre 2h30 pour le DSX) Chargement en continu (par série sur le DSX) Meilleures stabilités des réactifs Meilleure sensibilité Qualité (moins de risques d erreurs de manipulations liés au transfert de nombreux réactifs) Désavantages : Système fermé (on est lié au fournisseur de réactifs) Paramètres manquants Réactifs ouverts stable au maximum 70 jours Taille des cartouches 50 ou 100 tests.
Main Reaction Components
Comparaison ELISA -CLIA Rétrospectif Anti-PR3 Anti-MPO ELISA ELISA négatif positif négatif positif CLIA 22 1 23 8 10 18 négatif positif CLIA 20 1 21 5 11 16 négatif positif 30 11 41 25 12 37
Résultats divergents PR3 pour les 2 méthodes la valeur seuil est à 20 LID CLIA ( CU) ELISA (U) IFI (<1/20) Remarques IA 1141 203 18.8 négatif 30 positif c-anca 1/40 Pas d'argument IA 1124 073 383 positif 17 négatif c-anca 1/640 Patiente connue PR3 pos en 2006 et à nouveau pos 2 mois après. IA 1049 542 192 positif 19 négatif c-anca 1/320 Wegener IA 1115 178 154 positif 9 négatif c-anca 1/320 suivi Wegener IA 1142 542 130 positif 12 négatif c-anca 1/320 suivi Wegener IA 1111 495 206 positif 19 négatif c-anca 1/80 suivi Wegener IA 1036 004 103 positif 15 négatif c-anca 1/80 Adénome du colon IA 1014 252 26 positif MPO positif à 36 15 négatif c-anca 1/40 Maladie à IgG4 IA 1011 252 21 positif 3 négatif p-anca 1/40 Susp. Vasculite 140 CU 24.09.13
Résultats divergents MPO pour les 2 méthodes la valeur seuil est à 20 LID CLIA ( CU) ELISA (U) IFI (<1/20) Remarques IA 1014 252 36 positif PR3 positif à 26 17 négatif c-anca 1/40 Maladie à IgG4 IA 1017 203 51 positif 18 négatif p-anca 1/320 PR,vasculite IA 0931 313 143 positif 18 négatif p-anca 1/160 LLC,vasculite IA 0919 267 102 positif 15 négatif p-anca 1/160? pas d'autre prélèvement IA 0923 405 38 positif 5 négatif p-anca 1/80 PR séronégative Pas d argument IA 1004 502 58 positif 10 négatif p-anca 1/80 Wegener cancer pulmonaire
Comparaison prospective de février à avril 2012 Anti-PR3 Anti-MPO ELISA ELISA négatif positif négatif positif CLIA 50 0 50 7 15 22 négatif positif CLIA 47 0 47 6 11 17 négatif positif 57 15 72 53 11 64
Résultats divergents PR3 pour les 2 méthodes la valeur seuil est à 20 LID CLIA ( CU) ELISA (U) IFI (<1/20) Remarques IA 1213 012 32 positif MPO positif à 21 12 0430 3499 59 positif MPO positif à 38 5 négatif c-anca 1/2560 19 négatif MPO positif à 27 C-ANCA 1/40 Maladie à IgG4 cf IA 1014 252 12 0426 1698 32 positif 15 négatif p-anca 1 /40?(pas d autre prélèvement) IA 1212 536 40 positif 14 négatif Pas fait Suivi IA 1212 473 38 positif 8 négatif Pas fait Suivi Wegener IA 1209 128 27 positif 15 négatif Pas fait Suivi Wegener 12 0504 1263 25 positif 6 négatif Pas fait Suivi Wegener
Résultats divergents MPO pour les 2 méthodes la valeur seuil est à 20 LID CLIA ( CU) ELISA (U) IFI (<1/20) Remarques IA 1213 012 21 positif PR3 positif à 32 IA 1215 320 26 PR3 positif à 444 5 négatif c-anca 1/2560? 3 PR3 positif à 100 c-anca 1/160 CQ externe IA 1209 446 67 10 p-anca 1/320 Pas d autre prélèvement Demande externe IA 1212 537 28 5 p-anca 1/80 Résultat à 9 CU et 1/40 3 mois après. Demande externe IA 1207 353 103 16 Negatif sur formol Pas d argument IA 1207 151 23 3 Negatif sur formol
Valeur CLIA 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 PR3 (n=72 prospectif) 0 20 40 60 80 100120140160180200 Valeur ELISA y = 2.9483x - 8.1535 R² = 0.8466
Anti-PR3 ( Patient AM1948) 300 275 250 225 200 175 150 125 100 75 50 25 0 1 2 3 4 5 ELISA CLIA IFI 09.12.2010 17.03.2011 16.06.2011 09.12.2011 08.02.2012
Anti-PR3 (patient LBS 1945 ) 200 Suivi du 19.04.10 au 23.02.12 150 100 ELISA CLIA 50 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
conclusion Test plus dynamique Résultats plus élevés ne veut pas dire activité pathologique plus forte Pas de faux négatif Meilleure confirmation de l IFI Valeur seuil à 20?