CENTRE HOSPITALIER UNIVERSITAIRE LYON-SUD Laboratoire d Immunologie Pr J. BIENVENU Hôpitaux de Lyon TEST D ACTIVATION DES BASOPHILES DANS L ALLERGIE AUX MEDICAMENTS - - - INTERETS ET LIMITES Paul ROUZAIRE, Laure DENIS, Marie-Claude GUTOWSKI, Danièle GAUJAC, Françoise BIENVENU, Grégoire COZON, Jacques BIENVENU 18 février 2010 1
Plan Pourquoi étudier le basophile? Principe du test Identification des basophiles en cytométrie en flux Marqueurs d activation du basophile Protocole au laboratoire Exemples de tests : β-lactamines Curares Etude «Quinolones» Conclusions / Perspectives 2
Pourquoi étudier le basophile? Activation des mastocytes et des basophiles à l origine des réactions d hypersensibilité immédiate Accessibilité : Les basophiles sont présents dans le sang circulant contrairement aux mastocytes dont ils présentent la majorité des propriétés en particulier pour détecter une sensibilisation Les basophiles présentent à leur surface des récepteurs de forte affinité pour les IgE (FcεRI). Après «pontage» de ces récepteurs par l allergène, les médiateurs libérés déclenchent les phénomènes allergiques 3
Principe du test d activation des basophiles (1) Reproduire in vitro les conditions ayant conduit aux phénomènes allergiques cliniques observés chez le patient : Incubation des basophiles sensibilisés avec l allergène ayant provoqué la réaction Pontage des récepteurs RcεRI par l allergène Libération des médiateurs et modification du phénotype du basophile Allergène : Récepteur FcεRI : IgE 4
Principe du test d activation des basophiles (2) Les récepteurs FcεRI sont de type ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Module) Ils doivent être agrégés pour induire le signal d activation L allergène doit donc posséder au moins deux épitopes distincts pour créer un pontage entre deux molécules d IgE fixées sur les FcεRI. NB : Les médicaments sont assimilés à des haptènes monovalents : on suppose donc qu ils se couplent à des protéines porteuses pour pouvoir activer le basophile. 5
Identification des basophiles en cytométrie en flux Anti-IgE : Première stratégie décrite Peu spécifique (monocytes, éosinophiles, cellules dendritiques) Variation inter et intra individuelle de la densité réceptorielle CD203c et anti-ige : CD203c présent uniquement sur les basophiles au niveau du sang CD123 et HLA-DR : CD123+ : IL3-R HLA-DR- : exclusion des monocytes CCR3 et faible SSC : CCR3 présent sur les basophiles, éosinophiles, détectable sur les lymphocytes Th1 et Th2 CRTH2 et CD3 : CRTH2+ : récepteur de la prostaglandine D2 exprimé par les Th2, éosinophiles et basophiles CD3- : exclusion des lymphocytes Th2 6
Exemple 1 : identification des basophiles par le marquage CRTH2/CD3 Whole blood ungated cells Eosinophils Gated cells from A TH2 lymphocytes SSC A CD3 basophils Laboratoire d Immunologie CHLS CRTH2 CD203c 7
Exemple 2 : identification des basophiles par le marquage CCR3 basophils Laboratoires Bühlmann 8
Marqueurs de l activation des basophiles : Libération de médiateurs préformés : histamine, protéases, TNFα Libération de médiateurs néo-formés : leucotriènes, prostaglandines, IL-4, IL-13 Expression du CD63, CD107a Sur expression du CD203c, CD13, CD164 9
Principaux marqueurs d activation Nom Exprimé par Basophiles quiescents Basophiles activés Cinétique Effet de l IL3 Ectonucleotide Pyrophosphatase Phospho-diesterase (E-NPP3) Sur-expression Rapide (5-15 min) CD203c Basophiles, mastocytes Expression constitutive faible Non induit par l IL-3 (ou processus lent, >90min) Lyosyme Associated Membrane Protein (LAMP-3) PBMCs, plaquettes Plus lente (10-25 min) Induction par l IL-3 CD63 - Non exprimé à la surface cellulaire - Exprimé à la surface des granules intracytoplasmiques Expression à la surface cellulaire Magnitude de variation Fonction Inconnue Données contradictoires dans la littérature Associée à la libération des médiateurs 10
Ebo DG, Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and futures perspectives, Allergy, 2006 11
Protocole de routine du laboratoire (CD 203c) Témoin négatif Témoin positif Tubes tests PBS 20 µl Anti-IgE 20 µl Allergène dilué 20 µl CRTH2-FITC 10 µl 10 µl 10 µl CD203c-PE 10 µl 10 µl 10 µl CD3-PC5 10 µl 10 µl 10 µl Solution d activation 100 µl 100 µl 100 µl Sang (EDTA) 100 µl 100 µl 100 µl Vortexer et incuber 15 minutes à 37 C. Ajouter 2mL de solution de lyse Vortexer et incuber 10 minutes à température ambiante Centrifugation 5 minutes à 200g - Laver en PBS Reprendre avec du PBS / 0,1% PFA Vortexer 5 secondes et analyser au cytomètre 12
Mise en évidence d une activation en présence d un antibiotique : Contrôle négatif Contrôle positif (anti-ige) Allergène (Clamoxyl ) 13
Mise en évidence d une activation en présence d un curare : Contrôle négatif Contrôle positif (anti-ige) Allergène 1 (Célocurine ) Allergène 2 (Esmeron ) 14
Utilité des TAB chez des patients ayant présenté une réaction de type immédiate aux quinolones : Population étudiée : 28 patients ayant présenté une réaction de type immédiate moins d une heure après la prise d une quinolone 15 patients dont le TAB est négatif pour la quinolone impliquée 15
Utilité des TAB chez des patients ayant présenté une réaction de type immédiate aux quinolones : Population étudiée : 28 patients ayant présenté une réaction de type immédiate moins d une heure après la prise d une quinolone 15 patients dont le TAB est négatif pour la quinolone impliquée Parmi ces 15 patients, 3 ont des tests cutanés positifs (les 12 autres sont négatifs) 16
Utilité des TAB chez des patients ayant présenté une réaction de type immédiate aux quinolones : Population étudiée : 28 patients ayant présenté une réaction de type immédiate moins d une heure après la prise d une quinolone 15 patients dont le TAB est négatif pour la quinolone impliquée 14 patients sur les 15 ont été réintroduits, avec 100% de succès : HSNA Excellente valeur prédictive négative des TAB aux quinolones 17
Utilité des TAB chez des patients ayant présenté une réaction de type immédiate aux quinolones : Population étudiée : 28 patients ayant présenté une réaction de type immédiate moins d une heure après la prise d une quinolone 15 patients dont le TAB est négatif pour la quinolone impliquée 12 patients dont le TAB est positif pour la quinolone impliquée : non ré-introduits 1 test ininterprétable 18
Utilité des TAB chez des patients ayant présenté une réaction de type immédiate aux quinolones : Population étudiée : 28 patients ayant présenté une réaction de type immédiate moins d une heure après la prise d une quinolone 15 patients dont le TAB est négatif pour la quinolone impliquée 12 patients dont le TAB est positif pour la quinolone impliquée : 10 patients avec TC positifs 2 patients avec TC - 1 TAB ininterprétable Patients non réintroduits pour la quinolone impliquée 4 patients réintroduits avec une quinolone testée négative en TAB : 3/4 OK (dont un patient ayant des TC+ pour toutes les molécules) 19
Conclusions Mise au point TAB aux médicaments difficile : médicaments = haptènes monovalents le plus souvent Très utile lorsque la détermination des IgE spécifiques n est pas possible Sensibilité faible Spécificité excellente 20
Perspectives (1) Nécessité d une standardisation : Consensus sur le plan du diagnostic clinique Amélioration de la présentation de l haptène médicamenteux au système immunitaire Concentrations du médicament à utiliser Choix de l anticoagulant Sang total ou couche leucocytaire «buffy coat» Utilisation d IL-3 Mode d identification des basophiles (IgE, CRTH2 ) Choix du marqueur d activation CD203c/CD63 ou nouveaux marqueurs (CD13, CD164, CD107 ) Mode d expression des résultats (MFI, pourcentage de basophiles dépassant un seuil) 21
Perspectives (2) Mise en place d études multicentriques au niveau européen : EUROBAT Curares Bétalactamines Validation d un test en combinant les deux principaux marqueurs d activation : CD63 et CD203c Mise en place d un test «indirect» 22