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1 UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES ECOLE POLYTECHNIQUE DE BRUXELLES THÈSE présentée en vue de l'obtention du Grade de Docteur en Sciences de l'ingénieur Présentée et soutenue par Ahmed EL MALLAHI Automated 3D Object Analysis by Digital Holographic Microscopy Thèse dirigée par Prof. Frank Dubois Année académique :

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3 Committee : Director : Prof. Frank Dubois - Université libre de Bruxelles (ULB) Chair : Prof. André Preumont - Université libre de Bruxelles (ULB) Members : Prof. Olivier Debeir - Université libre de Bruxelles (ULB) Prof. Christine Decaestecker - Université libre de Bruxelles (ULB) Prof. Hugues Bersini - Université libre de Bruxelles (ULB) Prof. Christine De Mol - Université libre de Bruxelles (ULB) Dr. Marc Georges - Université de Liège (CSL) Prof. Denis Lebrun - Université de Rouen (CORIA)

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5 Automated 3D Object Analysis by Digital Holographic Microscopy Abstract: The main objective of this thesis is the development of new processing techniques for digital holograms. The present work is part of the HoloFlow project that intends to integrate the DHM technology for the monitoring of water quality. Dierent tools for an automated analysis of digital holograms have been developed to detect,refocus and classify particles in continuous uid ows. A detailed study of the refocusing criterion permits to determine its dependencies and to quantify its robustness. An automated detection procedure has been developed to determine automatically the 3D positions of organisms owing in the experiment volume. Two detection techniques are proposed: a usual method based on a global threshold and a new robust and generic method based on propagation matrices,allowing to considerably increase the amount of detected organisms (up to 95 %) and the reliability of the detection. To handle the case of aggregates of particles commonly encountered when working with large concentrations,a new separation procedure,based on a complete analysis of the evolution of the focus planes,has been proposed. This method allows the separation aggregates up to an overlapping area of around 80 %. These processing tools have been used to classify organisms where the use of the full interferometric information of species enables high classier performances to be reached (higher than 93 %). Keywords: Digital holographic microscopy, 3D hologram processing, automated detection, aggregates separation, holographic classication

6 Analyse 3D automatisée d'objets par microscopie holographique digitale Résumé : L'objectif principal de cette thèse est de développer de nouvelles techniques de traitement d'hologrammes digitaux. Ce travail s'inscrit dans le cadre du projet HoloFlow dont le but est d'intégrer la technologie DHM pour le contrôle de qualité de l'eau. Diérente techniques pour l'analyse automatisée d'hologrammes digitaux ont été développées pour détecter, remettre nette et classier des organismes dans un uide en ux continu. Une étude détaillée du critère de netteté a permis de déterminer ses dépendances et de quantier sa robustesse. Une procédure de détection automatisée a été développée pour déterminer automatiquement la position tri-dimensionnelle des organismes au sein du volume expérimental. Deux méthodes de détection sont proposées : une méthode classique basée sur un seuillage global et une nouvelle méthode, robuste et générique, basée sur des matrices de propagation ce qui permet d'augmenter considérablement la quantité d'organismes détectés (jusqu'à 95 %), ainsi que la abilité de la détection. Le cas des agrégats que l'on rencontre couramment dans les ux concentrés a été investigué. Une nouvelle méthode de séparation, basée sur une analyse complète de l'évolution des plans de netteté, a été développée. Celle-ci permet la séparation d'agrégats ayant une aire de recouvrement pouvant aller jusqu'à 80 %. Ces outils ont été appliqués pour la classication d'organismes où l'utilisation de toute l'information interférométrique a permis d'atteindre de très hautes performances (supérieur à 93 %). Mots clés : Microscopie holographique digitale, traitement 3D des hologrammes, détection automatisée, séparation d'agrégats, classication holographique

7 Remerciements J'aimerais tout d'abord remercier vivement le Professeur Frank Dubois, promoteur de cette thèse, pour m'avoir accueilli dans son laboratoire et pour m'avoir soutenu par ses conseils et ses idées. Il m'a très vite témoigné sa conance en me laissant une grande liberté indispensable àtoute recherche scientique. Je le remercie également pour m'avoir coné la responsabilité de la partie Image Processing au sein du projet HoloFlow. Sa bonne humeur et son humour au quotidien ont permis d'avoir une très bonne ambiance et de travailler dans les meilleures conditions. Ensuite, j'aimerais remercier le Docteur Christophe Minetti pour m'avoir encadré durant ces années de thèse. Je le remercie pour sa disponibilité et ses nombreux conseils en traitement d'image. Merci sincèrement de m'avoir permis d'améliorer mes connaissances en programmation et d'avoir toujours répondu àmes questions. Je lui suis aussi reconnaissant pour m'avoir fait découvrir les sensations de la microgravité au sein de son projet spatial. Merci encore pour toutes les corrections et suggestions du présent manuscrit, et pour m'avoir motivé an de terminer àtemps la rédaction. Je tiens également àexprimer mes remerciements aux membres du jury qui ont accepté d'évaluer mon travail. J'aimerais tout particulièrement remercier le Professeur Christine De Mol qui m'a proposé d'entamer une thèse de doctorat en n de cursus de Master en Sciences Physiques. Etant attiré par la physique appliquée plutôt que la physique purement théorique, elle me proposa de m'orienter vers les Sciences de l'ingénieur en me mettant en relation avec le Professeur Frank Dubois, promoteur de cette thèse. J'aimerais ici aussi remercier le Professeur Léon Brénig, promoteur de mon mémoire de n d'étude en Sciences Physiques, pour m'avoir initié àla recherche scientique. J'aimerais également remercier la presque Docteur Claire Perfetti, pour sa sympathie, sa gentillesse et son enthousiasme, le Docteur Catherine Yourrassowsky avec qui j'ai collaboré au sein du projet HoloFlow et le Docteur Carlo Iorio pour sa bonne humeur au quotidien. J'aimerais remercier également le Docteur Eva-Maria Zetsche, collaboratrice de projet, pour ses nombreux échantillons d'algues et pour les corrections apportées au présent manuscrit. Mes remerciements vont aussi à tous mes autres collègues du MRC pour la bonne ambiance, plus particulièrement àjean-charles, Rachid, Patrick, Mohamed, Nicolas, Naïm et Marcel. Enn, je remercie sincèrement mes très chers parents, qui m'ont assuré l'accès au savoir en me permettant de faire des études. Je remercie également toute ma famille et ma belle-famille pour leur soutien et leur motivation. Pour conclure, je souhaite bien évidemment remercier mon épouse, Hassnâa, avec qui j'ai la chance de partager ma vie.

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9 A mes très chers parents

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11 Contents 1 General Introduction 1 2 Principles of Holography Introduction Light waves Interference Coherence Temporal coherence Spatial coherence Diraction Holography Hologram recording and reconstruction Optical reconstruction of a wave eld Digital Holography Introduction Numerical reconstruction of digital holograms Operator formalism Discretization of the Kirchho-Fresnel integral Digital holographic microscopy Description of DHM Extraction of the full interferometric information Intensity and phase Phase map compensation The Refocusing Criterion:Dependency and Robustness Introduction Refocusing criterion based on amplitude analysis The refocusing criterion Focus criterion for pure amplitude objects Focus criterion for pure phase objects Dependencies of the refocusing criterion Mathematical development Simulation and experimental results The ε 2 dependency The NA 6 dependency Robustness of the refocusing criterion Salt and Pepper noise Speckle noise Conclusion

12 ii Contents Automated 3D Detection of Objects Introduction Experiments Optical setup Microuidic setup Description of the samples Automated particle detection and 3D position determination Classical thresholding method on the intensity or on the phase image Description of the technique Results Computation of propagating matrices for the intensity and the phase Description of the technique Results Conclusion Separation of Overlapped Objects Introduction Separation procedure based on a complete focus plane analysis Principle of the developed technique Determination of the orientation of the generated ROIs Results Simulations Experiments Conclusion Classication of Organisms using Holographic Information Introduction Description of the applications Monitoring of Drinking Water Resources (Application 1) Description of the samples Classication of Nanoplanktonic Organisms (Application 2) Description of the samples Feature Extraction Morphological Features Textural Features Three-Classes Classication Visualization by Box Plots Visualization of Feature Spaces Robust Support Vector Machines Conclusion General Conclusions 123

13 Contents iii A Publications 127 Bibliography 137

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