LA FECONDATION IN VITRO

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1 LA FECONDATION IN VITRO I/ INDICATIONS DE LA FECONDATION IN VITRO 1. Infertilité tubaire La fécondation in vitro réalise en dehors de l organisme ce qui se fait normalement dans la trompe de la femme : captation de l ovocyte mature par le pavillon tubaire, transport des spermatozoïdes jusqu à l endroit où doit avoir lieu le fécondation, fécondation, transport de l œuf jusqu à la cavité utérine où doit avoir lieu son implantation. il est donc logique que la première application thérapeutique de la fécondation in vitro soit de palier une anomalie des trompes, qu elles soient absentes, obstruées, ou simplement insuffisantes sur le plan fonctionnel 2. Infertilité masculine La fécondation in vitro est indiquée dans le traitement de certaines stérilités masculines puisque le nombre de spermatozoïdes nécessaire pour obtenir une fécondation est moindre qu in vivo et un seul spermatozoïde par ovocyte peut suffire à obtenir une fécondation ; en effet l injection intra-cytoplasmique (ICSI) a révolutionné la prise en charge des oligospermies sévères et des azoospermies. Des hommes considérés auparavant comme définitivement stériles peuvent aujourd hui avoir des enfants 3. Infertilité inexpliquée Une stérilité qui demeure inexpliquée malgré un bilan étiologique complet et une exposition à la grossesse pendant un temps suffisamment long ( au moins 2 ans ) peut bénéficier d une fécondation in vitro après l échec de 3 tentatives d insémination intra utérine 4. Infertilité avec endométriose Si l endométriose s accompagne de lésions tubaires sévères inaccessibles à la chirurgie endoscopique, la FIV peut être proposée ; en cas de kystes ovariens endométriosiques, ceux-ci doivent être traités chirurgicalement et médicalement avant de commencer la stimulation ovarienne pour FIV. En effet les kystes peuvent augmenter de volume lors de la stimulation, gêner l examen échographique de l ovaire lors du monitorage, perturber la ponction par aspiration de leur contenu épais et diminuer le nombre d ovocytes recueillis.lorsque la patiente a déjà été opérée, il faut se contenter de la simple ponctioaspiration sous antibiotiques du contenu kystique avant stimulation II/ BILAN AVANT FECONDATION IN VITRO 1. Etude de la cavité utérine L hystérographie est suffisante pour étudier la cavité utérine si l indication de la FIV est une infertilité masculine

2 L hystéroscopie est indispensable si l indication de la FIV est une stérilité tubaire ou une stérilité inexpliquée ou en cas d échec d une première tentative de FIV ; elle permet de rechercher une endométrite chronique 2. Etude des trompes de Fallope L hystérosalpingographie est le principal moyen de diagnostic des anomalies tubaires ; l échographie permet de dépister les images d hydrosalpinx. En cas d hydrosalpinx, il est conseillé de procéder à sa cure chirurgicale par coelioscopie avant le cycle de FIV, car il diminue fortement les pourcentages de réussite da la FIV 3. Bilan endocrinien 1) Un bilan hormonal et une échographie pelvienne endovaginale au 3 ème jour du cycle permettent d évaluer la fonction et la réserve ovarienne - Dosages sanguins au 3 ème jour du cycle de FSH, LH, Prolactine, oestradiol et AMH ; des taux de FSH élevés sont péjoratifs, le taux de LH permet de déterminer la nature dystrophique ou non des ovaires - L échographie précoce permet de porter un diagnostic et un pronostic quant à la réponse à la stimulation : un chiffre inférieur à 5 follicules antraux sur les 2 ovaires est de mauvais pronostic et en dessous de 3 follicules toute stimulation est vouée à l échec 2) Classification des patientes : ce bilan permettra de sélectionner 3 groupes de patientes : Les normo-répondeuses : FSH inférieure à 5 UI/l, LH inférieure à 6UI/l oestradiol inférieur à 30pg/ml et AMH supérieure à 2 ng/ml. L échographie montre des ovaires de taille normale avec 5 à 7 follicules antraux de chaque côté Les hyper-répondeuses :ce sont les femmes avec une dystrophie ovarienne ou des ovaires micropolykystiques : FSH normale, LH supérieure à 6UI/l, oestradiol élevé supérieur à 30pg/ml, AMH largement supérieure à la normale. L échographie retrouve sur chaque ovaire plus de 10 follicules répartis à la périphérie ; le taux de prolactine est normal ou un peu élevé Les mauvaises répondeuses : la FSH est un peu élevée entre 5 et 12 UI /l, l oestradiol est un peu élevé entre 45 et 70 pg/ml, l AMH es inférieure à la normale 4. Bilan général : on complètera le bilan par des sérologies( VIH, hépatite B et C, rubéole, toxoplasmose) un frottis cervico-vaginal,un examen récent des seins 5.Bilan masculin 1) Test d aptitude à la procréation médicalement assistée (TAMP) : le sperme va devoir subir une préparation biologique dont la technique doit être adaptée en fonction des qualités du sperme.

3 C est pourquoi il est important d avoir un spermogramme, une spermoculture et une tentative de préparation à blanc avant la FIV ( test de migration survie) 2) Bilan sérologique : VIH, hépatite Bet C 3) FSH et inhibine B ainsi qu un bilan de la coagulation sanguine seront demandés en cas d azoospermie avant la biopsie testiculaire pour ICSI III/ PROTOCOLES DE STIMULATION EN VUE D UNE FIV Le but de la stimulation ovarienne pour fécondation in vitro est d obtenir un bon nombre d ovocytes matures pour multiplier les chances d obtenir des embryons.la stimulation permet en fait de sauver de l atrésie les follicules de la cohorte folliculaire.du fait du risque d ovulation prématurée, les protocoles de stimulation en FIV associent le plus souvent aux gonadotrophines les agonistes du GnRH ou plus récemment les antagonistes du GnRH, destinés à prévenir l ovulation prématurée.plusieurs protocoles existent : protocoles avec agonistes du GnRH, longs ou courts, et protocoles avec antagonistes du GnRH à dose unique ou multiple 1. Monitorage de l ovulation Le monitorage de l ovulation correspond à la surveillance du développement folliculaire lors d une stimulation ovarienne afin de repérer le moment adéquat du déclenchement et de cerner les situations à risque comme l hyperstimulation ovarienne ou les réponses insuffisantes 1) Echographie pelvienne : réalisée par voie endo-vaginale, elle permet de comptabiliser tous les follicules recrutés et de noter leur diamètre ; dans le même temps elle visualise l aspect de la muqueuse endométriale et mesure son épaisseur.une épaisseur inférieure à 8 mm le jour de l administration de l HCG est de mauvais pronostic 2) Taux d oestradiol plasmatique : il est d autant plus élevé que le nombre de follicules recrutés est important et que leur volume est augmenté. l évolution oestrogénique la plus favorable est une augmentation progressive et constante. Une courbe d oetradiolémie doit être réalisée 2. Protocoles avec agonistes du GnRH 1) Protocole long : Le principe est d obtenir une désensibilisation hypophysaire par agoniste de la GnRH avant de débuter la stimulation ovarienne par gonadotrophines ; cette désensibilisation peut être obtenue par administration d une injection unique de produit retard ou par l administration quotidienne d un produit à durée d action rapide. Le démarrage de l agoniste se fait dans les 4 premiers jours du cycle pour les produits retard et en phase lutéale ( 20 ème ou 21 ème jour du cycle ) pour les produits rapides

4 2) Protocole court : Après administration d un agoniste du GnRH il se produit une première phase de libération de LH et FSH ( effet flare-up) suivied une phase de désensibilisation correspondant à l effondrement de la LH et FSH entraînant une baisse d oestradiol et progestérone.le principe du protocole court est d utiliser cet effet de stimulation initiale de la GnRH ; l administration de l agoniste se fait en début de cycle et on prend le relais par les gonadotrophines tout en continuant l agoniste de la GnRH 3. Protocole avec antagoniste de la GnRH Le principe est d inhiber la survenue d un éventuel pic prématuré de LH par l administration d un antagoniste de la GnRH 1) Protocole à doses multiples : La stimulation ovarienne par gonadotrophines est débutée dès le 2 ème jour du cycle, l antagoniste est administré à doses faibles dès le 7 ème jour du cycle ( 6 ème jour de la stimulation ) jusqu à l obtention des critères de déclenchement 2) Protocole à dose unique : Une dose plus forte d antagoniste est injectée au 8 ème jour du cycle et elle donne une protection de 4 jours contre un pic prématuré de LH 4. Critères de déclenchement La précision de la décision de déclenchement par HCG est un des facteurs les plus importants du pronostic. Administré trop tôt l HCG induit une atrésie ovocytaire. Les critères les plus communément admis sont de déclencher dès que au moins trois follicules atteignent mm avec un taux d oestradiol sanguin supérieur à 1000 pg/ml Quel que soit le protocole utilisé pour la fécondation in vitro, toutes les équipes signalent un taux d annulation des cycles de 15% environ ; le cycle peut être annulé, c'est-à-dire qu on n administrera pas l HCG et qu on ne fera pas la ponction, en cas de réponse insuffisante à la stimulation ou en cas de réponse excessive faisant craindre une hyperstimulation ovarienne IV/ PONCTION FOLLICULAIRE La ponction doit être réalisée 34 à 38 heures après le déclenchement pour éviter que la patiente n ovule prématurément. La ponction est réalisée sous contrôle de l échographie vaginale. La sonde endovaginale est munie d un guide qui permet de venir aspirer, grâce à une aiguille, un à un les follicules de plus de 14 mm Le liquide folliculaire est transmis au laboratoire dans une enceinte isolée et chauffante à une température de 37 C. Cette ponction est réalisée dans un bloc opératoire comme une intervention chirurgicale pour éliminer tout risque infectieux. Elle peut se faire sous anesthésie générale, sous neuroleptanalgésie ou sous anesthésie locale

5 V/ TECHNIQUES BIOLOGIQUES DE FECONDATION IN VITRO 1. Fécondation in vitro par simple rapprochement des gamètes 1) Préparation du sperme Le but est de sélectionner les spermatozoïdes mobiles à morphologie normale apte à féconder les ovocytes et d éliminer le plasma séminal, les débris cellulaires et les agents infectieux. Le recueil du sperme se fait au laboratoire par masturbation après une abstinence sexuelle de 2 à 5 jours. Pour éviter une contamination du sperme le patient doit uriner avant le recueil, puis se laver les mains et le gland avec un savon puis rincer avec un soluté stérile Plusieurs techniques de préparation du sperme existent mais la plus utilisée actuellement est la migration sur gradient de densité ( Pure Sperm) 2) Insémination des ovocytes in vitro : L insémination des ovocytes a lieu dans les heures qui suivent la fin du processus de maturation nucléaire et l émission du globule polaire. chaque ovocyte est mis dans une concentration de à spermatozoïdes par ml 3) Fécondation Le zygote est examiné 15 à 20 heures après l insémination ; si 2 pronucléi sont visibles, l ovocyte doit être considéré comme normalement fécondé. 48 heures plus tard le zygote est réexaminé au stade de 4 cellules ; les embryons sont analysés et évalués en grades selon des paramètres morphologiques indiquant leur qualité (nombre de cellules, égalité et régularité des blastomères, présence ou absence de fragments) La qualité des embryons est un facteur pronostic important de leur chance d implantation.les embryons de meilleur pronostic sont de grade 1 et n ont pas de fragments ; les embryons de grade 2 ont des fragments qui occupent 20% du volume embryonnaire total. Les embryons de grade 3 ont entre 20 et 50% de leur volume occupé par des fragments.les embryons de grade 4 ont plus de 50% de fragments 2. Injection intracytoplasmique du spermatozoïde Le but est de faciliter le franchissement par le spermatozoïde des enveloppes naturelles entourant l ovocyte.l ICSI ou intra cytoplasmic sperm injection mise au point en 1992 est la meilleure technique actuellemnt d assistance à la fécondation 1) Préparation des ovocytes : les ovocytes sont mis en milieu de culture et doivent subir une décoronisation pour les débarrasser de toutes les cellules péri-ovocytaires ( cumulus oophorus et corona radiata) grâce à une solution contenant une enzyme, la hyaluronidase.l observation au microscope permet ensuite de noter le stade de maturité ovocytaire.seuls les ovocytes matures ( métaphase II) ayant émis leur premier globule polaire seront micro-injectés ) 2) Préparation des spermatozoïdes :

6 Les spermatozoïdes utilisés pour l ICSI peuvent provenir soit d un éjaculat, soit du prélèvement du fluide épididymaire, soit d une biopsie testiculaire. la sélection des spermatozoïdes normaux et mobiles se fait sur le gradient de Pure Sperm pour les spermatozoïdes éjaculés ou d origine épididymaire, au microscope inversé pour les spermatozoïdes testiculaires 3) Technique de micro injection intracytoplasmique : On utilise un équipement spécialisé fixé sur un microscope inversé. Deux micropipettes sont nécessaires : une pour tenir l ovocyte et une pour prélever le spermatozoïde et l injecter dans le cytoplasme de l ovocyte. les spermatozoïdes sont placés dans une goutte de milieu de culture. chaque ovocyte est déposé dans une goutte de 5 microlitre de milieu de culture autour de la goutte de spermatozoïdes ; le tout est recouvert d huile de paraffine pour éviter la déssication ; la boite de Pétri est placée sur la platine chauffante du microscope Au moment de l injection l ovocyte est par une pipette de contention de telle sorte que le globule polaire soit situé à <<midi>> ou à <<6 heures>> pour éviter que la pipette ne touche le fuseau de métaphase II.Un spermatozoïde est aspiré dans la pipette d injection et injecté dans le cytoplasme de l ovocyte Après le micro-injection, les ovocytes sont incubés à 37 C sous atmosphère humide à 5% de CO2 4) Fécondation : les pronucléi témoins de la fécondation sont observés 16 à 18 heures après la microinjection. Le transfert intra-utérin des embryons a lieu 48 heures après la micro-injection 5) Indications de l ICSI L ICSI est la seule technique qui permet à des hommes ayant une stérilité sévère d avoir des enfants.les couples candidats à l ICSI sont classées en fonction de la qualité du sperme : Olig-asthéno-tératozoospermies sévères ne permettant pas de tenter une FIV conventionnelle ( nombre inférieur à 1000spz/ml) Oligo-asthéno-tératozoospermies inexpliquées avec échec total de fécondation in vitro Anomalies spermatiques : microcéphales, syndrome des flagelles courts, dyskinésies flagellaires Auto-immunisations antispermatozoïdes à tausx élevé d anticorps Auto-conservation de spermes pour maladies dont les traitements sont toxiques pour la spermatogénèse : chimiothérapie, radiothéraoie Spermes normaus avec échec total de FIV Azoospermies : dans ce cas l ICSI nécessite un prélèvement chirurgical de spermatozoïdes testiculaires L IMSI ( high magnified sperm micro-injection) permet d observer le spermatozoïde avec un microscope 4 fois plus puissant que dans l ICSI conventionnelle.ainsi seuls les spermatozoïdes normaux seront injectés.cette technique s adresse aux tératospermies majeures avec échec inexpliqué d ICSI ainsi qu aux spermes à forte fragmentation d ADN 6) Résultats L ICSI a bouleversé le traitement de l infertilité masculine en permettant à des hommes n ayant que quelques rares spermatozoïdes dans leur éjaculat ou n en ayant aucun d assurer leur descendance. Les taux de fécondation en ICSI sont de 70 à 80% et les taux de grossesses sont de 40%

7 VI/ Congélation d embryons Les embryons non transférés peuvent être congelés à -196 C dans de l azote liquide. Il existe 2 protocoles de congélation : 1 La congélation classique lente : Elle associe l utilisation d un cryoprotecteur, d une descente thermique lente réalisée de manière automatique et d un << seeding>> afin d éviter la formation de cristaux lors de la congélation de l eau 2. La vitrification : Elle consiste à plonger les embryons directement dans l azote liquide avec un cryoprotecteur La congélation d embryons permet aussi de différer le transfert en cas de risque d hyperstimulation ovarienne VII/ Transfert embryonnaire 1. Transfert à J2 1) Technique de transfert Le transfert des embryons in utéro a lieu habituellement à 48 heures post ponction folliculaire et insémination.on utilise un cathéter souple muni ou non d un mandrin et fixé sur une seringue de 1 ml remplie de milieu de culture avec lequel le cathéter est rincé. Le ou les embryons sont ensuite placés à l extrémité du cathéter dans une goutte. Une fois l extrémité du cathéter placée dans l utérus,une simple pression sur le piston de la seringue permet de libérer les embryons. Le cathéter est ensuite confié au biologiste qui vérifie que les embryons sont bien dans la cavité utérine et ne sont pas restés collés à l intérieur du cathéter Dans des cas extrêmement difficile de passage du col, le transfert peut être effectué sous anesthésie générale. L exposition des embryons à des températures inférieures à 37 C au cours du transfert doit être évitée 2) Critères de choix pour le nombre d embryons à transférer Il n y à pas de règle absolue pour déterminer le nombre optimum d embryons à transférerafin d obtenir une grossesse en évitant la gémellité ou les grossesses triples. On doit tenir compte du désir du couple, de l âge de la patiente, des critères de qualité des embryons ( nombre de blastomères à J2 ; taux de fragments), du taux de fécondation ( nombre d ovocytes fécondés par rapport au nombre d ovocytes obtenus) Dans notre équipe nous transférons 2 à 3 embryons de grade 1 avant 35 ans et 4 embryons de grade 1 après 35 ans

8 2. Transfert d embryons à J5 au stade de blastocyste Lorsqu on transfert les embryons au 2 ème jour post insémination,on place les embryons dans l utérus à une période inappropriée car à ce stade, in vivo, les embryons sont dans la trompe ;ils sont donc soumis à une hypermotricité utérine ce qui peut expliquer le faible taux d implantation.la culture prolongée jusqu au 5 ème jour au stade de blastocyste permet d identifier et d éliminer les œufs dont la segmentation s arrête après quelques divisions et de réaliser un transfert approprié plus physiologique On utilise des milieux de cultures séquentiels adaptés aux besoins des embryons du 3 ème au 6 ème jours. Dans notre centre de fécondation in vitro nous utilisons les milieux de cultures prolongées pour toutes les patientes. Lorsque le nombre d embryons ayant atteint le stade de 8 cellules à J3 est supérieur à 3 on continue la culture jusqu à J5 ; si à J3 il y a moins de 3 embryons qui ont atteint le stade de 8 cellules nous transférons à J3 Le taux de grossesses ainsi obtenu est de 35 à 40%