«Biotechnologies et nouvelles stratégies diagnostiques du retard mental.» Colloque médical du Jeudi 26 Avril 2012 COUTTON Charles
Etude du Génome Cytogénétique Cytogénétique moléculaire Biologie moléculaire ADN
Evolution des techniques Cytogénétique 1600 1930 1959 1970 1990 Biologie moléculaire Ere de la génomique 1865 1953 1970-1990 1985 1990-2010
Evolution des techniques Séquençage haut-débit Biologie moléculaire Faible Globale Approche Résolution Forte Ciblée Cytogénétique ACPA (CGH-array)
Enjeux Variations structurales du génome Variations de séquence du génome 10 8 pb M U T A T I O N S 1 pb Remaniements chromosomiques Micro-remaniements génomiques Comment détecter toutes ces mutations? Cytogénétique Biologie moléculaire
Choix des techniques ATGCACTGATGAATGCATGCAAT Séquençage ADN MLPA CGH-array FISH Caryotype
Choix des techniques Approche globale Approche ciblée Caryotype ACPA (CGH-array) Séquençage haut débit FISH MLPA
Investigation du retard mental: Stratégie Générale Patient avec retard mental +/- dysmorphie +/-malformations Clinique non évocatrice d une pathologie ou syndrome Clinique évocatrice d une pathologie ou syndrome X fragile Screening large Génique Chromosomique Caryotype MLPA? CGH-array? Biologie moléculaire Séquençage haut-débit? Caryotype +/- FISH MLPA?
MLPA CGH-array Techniques de quantification relative: mise en évidence de pertes ou de gains de matériel chromosomique. Techniques d hybridation comparative (par rapport à une référence) 2 copies 1 copie 3 copies délétion hétérozygote duplication
CNV et polymorphismes Cohorte d individus «apparemment» sains Redon et al. 2006 60 000 CNVs polymorphes connus Représenteraient jusqu'à 15-20% de notre génome Principalement dans des régions pauvres en gènes
CNVs et pathologies A l origine (seuls ou associés) RM syndromiques: Prader-Willi / Angelman Di George Smith Magenis Williams Beuren Wolf-Hirschhorn Miller Diecker Autisme Schizophrénie Maladies neuro-dégénératives
Denaturation Hybridation MLPA
Ligation MLPA
Ligation MLPA
MLPA Amplification 1 2 3 45
MLPA Séparation - Normalisation - Interprétation Control Patient Une différence relative de la hauteur ou surface d un pic indique une variation du nombre de copie de la séquence cible.
MLPA Approche «semi-globale» Etudier plusieurs régions simultanément Les régions sub-télomériques (46) Les syndromes microdélétionnnels les plus fréquents Approche «ciblée» Etudier de façon exhaustive certaines régions d intérêt Meilleure sensibilité et spécificité que la FISH
Microdélétion 22q11.2 Clinique: Dysmorphie faciale Cardiopathie congénitale Insuffisance vélaire Hypocalcémie néonatale Aplasie ou hypoplasie du thymus et des parathyroïdes Troubles de l'apprentissage et/ou retard psychomoteur FISH normale
MLPA et 22q11 Région 22q11 Témoin Délétion 22q11 Comparaison Patient
MLPA et 22q11 Non détectées par FISH La MLPA détecte 100% des anomalies impliquées LA FISH ne détecte «que» 95% des anomalies Stachon et al. 2007. AJMG
Investigation du retard mental: Stratégie Générale Patient avec retard mental +/- dysmorphie +/-malformations Clinique non évocatrice d une pathologie ou syndrome Clinique évocatrice d une pathologie ou syndrome X fragile Screening large Génique Chromosomique Caryotype MLPA? CGH-array? Biologie moléculaire Séquençage haut-débit? Caryotype +/- FISH MLPA?
CGH-array Analyses chromosomiques sur puces à ADN (CGH-array) Technique quantitative pan-génomique basée sur l hybridation comparative sur micro-réseau. ADN de référence + ADN du patient Co-hybridation sur puce à ADN Lecture Interprétation
CGH-array ADN de référence + ADN du patient
CGH-array ADN de référence + ADN du patient Exemple d une délétion (1 copie)
CGH-array ADN de référence + ADN du patient
CGH-array 2 Dysmorphie importante Retard global développement Hypotonie néonatale Epilepsie Délétion 2q11.3 2,11 Mb
CGH-array 7 Retard langage +++ Difficulté d apprentissage Dysmorphie discrète Duplication 7q11.23 1,394 Mb
CGH-array Détection facilité des anomalies complexes délétion Délétion Inv dup del (8p) Retard développement Retard de langage Agénésie du corps calleux duplication Duplication
CGH-array et RM Patients avec RM + dysmorphie: Caryotype seul: 3 à 5% de diagnostic Caryotype + FISH: 8 à 10% de diagnostic CGH-array : 12 à 18% de diagnostic ACPA?
CGH-array: limites Ne détecte pas les remaniements équilibrés Les anomalies équilibrées représentent moins de 1% des anomalies détectées chez les patients avec RM + dysmorphie dont 0.5% sont familiales
CGH-array: limites Ne détecte pas les remaniements équilibrés et les anomalies de la ploïdie Coût Evaluation médico-économique bénéfice / coût favorable
CGH-array: limites Ne détecte pas les remaniements équilibrés et les anomalies de la ploïdie Coût Interprétation complexe
Interprétation pas toujours facile! Pathogénes? Polymorphes Manolio et al. 2009 Expertise médicale indispensable à l interprétation correcte des variations observées
Détection de CNV «prédisposant à»
Variants polymorphes finalement pathogènes
CGH-array: limites Ne détecte pas les remaniements équilibrés et les anomalies de la ploïdie Coût Interprétation complexe Ethique
Ethique Perte d un gène suppresseur de tumeur (TP53) Impliqué dans le syndrome de Li-Fraumeni => attitude?
CGH-array et RM Mefford et al 2012 ACPA en première intention dans la stratégie de l investigation du RM
Investigation du retard mental: Stratégie Générale Patient avec retard mental +/- dysmorphie +/-malformations Clinique non évocatrice d une pathologie ou syndrome Clinique évocatrice d une pathologie ou syndrome X fragile Screening large Génique Chromosomique Caryotype MLPA? CGH-array? Biologie moléculaire Séquençage haut-débit? Caryotype +/- FISH MLPA?
Séquençage haut-débit
Séquençage haut-débit Phimister et al. 2012
Séquençage haut-débit Différentes approches Petits génomes (bactériens, viraux ) 10 4 pb Groupes de gènes (ex par pathologie, neuromusclaires, etc ) Exomes Génome humain 3.10 9 pb Uniquement la partie codante des gènes (les exons) soit 1.5% du génome (>180 000 exons)
Séquençage haut-débit
Séquençage haut-débit
Séquençage haut-débit Fragmentation ADN Ligation d adaptateur Enrichissement PCR ou capture Amplification (PCR en émulsion) Séquençage Analyse
Séquençage haut-débit Détection photonique Détection protonique
Séquençage haut-débit Fragmentation ADN Ligation d adaptateur Enrichissement PCR ou capture Amplification (PCR en émulsion) Séquençage Analyse Segments de lecture Alignements Détection de variants
Alignement - Détection de variants Génome de référence ATCAGATCGATCTATTAGCTATCGATCTAGATCTAGATCTAGCTA CGATATAGATC TATCGATATAGATC AGCTATCGATATA ATCTAGATATAGATCTAG ATCTATTAGCTATCGATAT Présence d une substitution C>A Polymorphisme? Pathogène?
Séquençage haut-débit Fragmentation ADN Ligation d adaptateur Enrichissement PCR ou capture Amplification (PCR en émulsion) Séquençage Analyse Segments de lecture Alignements Détection de variants Interprétation
Séquençage haut-débit Interprétation complexe: nécessité d une expertise médicale +++ (biologique, clinique, bioinformatique)
Séquençage haut-débit Séquençage Sanger 1990-2003: 13 ans pour un génome (HGP) 2012: Séquençage haut-débit 1 Génome complet en 7 jours Adapté de T. Frebourd ANPGM 2012
Nouvelle approche efficace Séquençage haut-débit
Séquençage haut-débit Dysmorphie faciale caractéristique Pb cardiaques, rénaux, squelettiques RM modéré Mefford et al 2012
Investigation du retard mental: Stratégie Générale Patient avec retard mental +/- dysmorphie +/-malformations Clinique non évocatrice d une pathologie ou syndrome Clinique évocatrice d une pathologie ou syndrome X fragile Screening large Génique Chromosomique Caryotype MLPA? CGH-array? Biologie moléculaire Séquençage haut-débit? Caryotype +/- FISH MLPA?
Parle pour toi! C est vrai que c est pratique!
Caryotype / FISH Carotype Résolution entre 3 et 5 Mb Inconvénients: long ; faible résolution; cout Avantages: mécanismes remaniements FISH Résolution: 150Kb Inconvénients: petite duplication, cout, culture, banque de clones Avantages: mécanismes remaniements
Indications D. Sanlaville; Bilan réseau ACPA 2012
Approches ciblées Richard Holt, Anthony P. Monaco
Approches ciblées