MODE OPERATOIRE Code : SSG / 003 UMR 1229 MGS Microbiologie et Géochimie des Sols 17 rue Sully BP86510 21065 Dijon Cedex Rédigé par : D. Bru / S. Hallet. Procédure d utilisation du Beckman CEQ 2000 XL pour la réalisation de programmes de séquençage ou de génotypage. Revu par : L. Philippot Date d'émission : 25/10/04 Version : 1 Date de révision : Date de retrait : Nombre de pages : 8 Approuvé par : L. Philippot Diffusion : Service de Séquençage et de Génotypage- Service Commun de Biologie (SERCOBIO) Réservation : L utilisation du Beckman CEQ 2000XL est soumise à la réservation par les utilisateurs. A ce titre, un planning est disponible sur le site du SERCOBIO mais également dans la salle du SSG près du séquenceur. 1- Mise en service du CEQ 2000 XL Si l appareil n est pas sous tension lors de votre arrivée, voici la procédure à suivre pour le mettre en service : - Mettre le séquenceur sous tension (interrupteur sur la face avant) puis l ordinateur si celui-ci est hors tension. - Ouvrir le logiciel CEQ 2000 (icône sur le bureau) - Dans la barre d outils (CEQ Main Menu) ouvrir le répertoire CEQ Run et laisser l appareil s initialiser : Sequence Analysis Fragment Analysis Help CEQ Sample Setup CEQ Run Data Manager Exit CEQ MAIN MENU : (Permet l accès aux différents modules du logiciel CEQ 2000) - Sample Setup : Préparation de plans de plaques. - CEQ Run : Lancement d un run, et contrôle des instruments. - Sequence Analysis : Visualisation et modification des résultats d analyse de séquences. - Fragment Analysis : Visualisation et modification des résultats d analyse de fragments. - Data Manager : Accès et modification de la base de données de résultats. - Help : Menu d aide contextuelle. - Exit : Pour quitter le logiciel. 1
2- Chargement des plaques : Après avoir réalisé et purifié* les réactions de séquençage, ajouter le tampon de charge (Sample Loading Solution, Beckman Quick start kit) sous une sorbonne et déposer ces réactions dans une plaque de chargement Beckman au format standard (96 well plate, cone 25PKG réf.# 609801). (* Les informations ci-dessus sont présentées de manière plus détaillée dans les procédures SSG / 001 - chap7 et SSG / 002 - chap5.) Vous devez utiliser une plaque de chargement en cours d utilisation (localisée dans le réfrigérateur de la salle), ou prendre une nouvelle plaque* «commune» si la plaque précédente est entièrement utilisée. (*Lorsque vous entamez une nouvelle plaque, prenez soin de la référencer, en notant la date de début d utilisation. Cette référence sera reportée lors de l élaboration du plan de plaque, voir plus loin.) Pour déposer la plaque de chargement, accédez, dans le module CEQ Run, à la fonction Unload Plate via l onglet Direct Control. Lorsque le message «you may now open sample access cover» s affiche, vous pouvez ouvrir le capot et retirer les plaques du séquenceur. Lorsque le capot est ouvert : - Rincez la station de lavage (wetting tray, bac blanc) et remplissez la avec de l eau ultra pure. - Chargez la plaque contenant vos échantillons - Chargez le tampon de migration (CEQ Separation Buffer, réf.# 608012, stocké à 4 C) dans la plaque de micro-titration au format standard (réf.# 609844), les puits à remplir de tampon sur cette plaque correspondent aux puits que vous utilisez sur la plaque d échantillons. - Refermez le capot et cliquez sur Load pour initialiser le passeur d échantillons Si l étape de chargement des plaques ne doit pas s effectuer rapidement, veillez à refermer à refermer le capot (après avoir rempli la station de lavage), ceci afin que les capillaires ne restent pas trop longtemps à l air libre. Dans ce cas, répétez la procédure d ouverture et de fermeture du capot pour le chargement des plaques. 2
3- Réalisation du plan de plaque / identification des échantillons. La réalisation du plan de plaque se fait à partir du module CEQ Sample Setup. RUN, Start pour le lancement du run Sélection de la méthode Paramètres du module d analyse. Paramètres de la méthode utilisée Ci-dessus : plan de plaque à compléter. Voici les différentes étapes à suivre pour préparer le plan de plaque: - Remplir le plan de la plaque (créer nouvelle plaque ou remplir une plaque déjà existante et incomplète), en nommant vos échantillons dans les puits correspondants. - Sélectionner la méthode* employée. - Enregistrer l ensemble des paramètres. Attention! : Si le nombre d échantillons analysés n est pas un multiple de 8, compléter la (les) ligne(s) avec du SLS (1 run = 1 ligne = 8 échantillons) et ne pas oublier de compléter la microplaque plaque avec du tampon de migration (ceci afin d éviter que certains capillaires ne se détériorent à l air libre), de plus les factures sont éditées au nombre de runs. *Méthodes : Il existe différentes méthodes adaptées au type d analyse effectuée. Chacune de celles-ci peut être éditée et paramétrée (Temps d injection, durée de migration, voltage, intensité ) NB : Chaque utilisateur peut créer et enregistrer ses propres méthodes. 3
Exemples de méthodes : - LFR : méthodes utilisées pour le séquençage LFR 1 : migration de 85 min (La durée du run peut être modifiée en LFR 100 : migration de 100 min fonction de la longueur du fragment à séquencer.) - Frag : méthodes utilisées pour l analyse de fragments. (T-RFLP, Microsatellites.) Il existe plusieurs méthodes préenregistrées. frag 1, 2, 3, 4 (Méthodes qui diffèrent par les temps d injection et de migration) frag 4.45 (= frag 4 avec un temps d injection de 45 sec au lieu de 30) Analysis : Paramétrage de l analyse à appliquer aux données. - Analyse automatique (paramètres par défaut) ou manuelle (paramètres personnalisés) - Paramètres : Ex : paramétrage du Threshold. Réglage de la hauteur de la ligne de base, en fonction des parasites. Augmenter cette valeur permet de relever la ligne de base d analyse et donc de diminuer le «bruit de fond». - Exportation des résultats vers un répertoire. 4- Lancement du run. Lorsque vous avez rempli votre plan de plaque vous pouvez lancer le run. Vérifier tout d abord s il reste assez de polymère dans la cartouche (Environ 2ml par run. Si le volume est insuffisant, l appareil émet un message d alerte et se met en attente. Dans ce cas, contactez la personne responsable.) Démarrage du (des) run(s) : Dans le module CEQ Sample Set Up, onglet Run sélectionnez Start. Ceci a pour effet d activer le module CEQ Run. Vous devez sélectionner les runs que vous lancez (en désélectionnant les runs enregistrés sur le plan de plaque, dans le cas ou vous complétez un plan de plaque déjà utilisé). Lorsque cette action est réalisée, vous pouvez lancer l analyse (Start). Exemple : Cliquez sur les lignes 1 à 4. Lancer le run : Start Cliquez sur les lignes à désélectionner, sur la plaque de doite. (exemple : lignes 1 à 4) 4
Il est possible de suivre le déroulement d un run en temps réel dans le sous menu Data Monitor du module CEQ Run. Statut du système Evolution du temps de migration Volume de polymère restant dans la cartouche Informations sur le laser et le capillaire Visualisation de la migration sur les 8 capillaires Signaux d alerte La fenêtre de gauche présente quatre onglets renseignant sur le run et différents paramètres actifs du CEQ 2000 XL : - Sample : Information sur le run en cours (Nom de la plaque et des échantillons, base de données (database), méthode utilisée ) - µamp : Intensité et tension du courant dans les capillaires - Device: Informations sur l appareil (position des plaques, température du capillaire, présence de la cartouche, des capillaires, voltage et ampérage) - Life : Informations concernant les éléments «consommables» (polymère, capillaires, laser : volume restant, durée de vie, nombre de runs ) 5
Les 3 autres sous menus du CEQ Run : (présentés à titre d information pour les utilisateurs). - Direct Control : Ce sous-menu présente de nombreux raccourcis vers les fonctions de paramétrage, de contrôle et de maintenance de l appareil et des manips réalisées. - Unload Plates - Plate position - Capillary temperature - Denature samples - Optical alignement - Injection - Separate - Fill capillary - Manifold purge Filling gel capillary Optical alignment Wetting tray Release gel cartrige Plate position Load/ Unload Plates. Injection / Separate (voltage, duration) - Log : - Instrument Data : Historique des évènements. Visualisation de la tension et de l ampérage. Ampérage de chaque capillaire Tension 6
5- Les modules d analyse. CEQ Sequence Analysis et CEQ Fragment Analysis. 5.1- Ouverture des fichiers de données stockés dans la database active (Working Database). 5.2- L analyse des données. L analyse se fait de manière automatique lors de l ouverture (paramètres par défaut), il est cependant possible de réanalyser les données en changeant certains paramètres (Hauteur du «Threshold», couleur, nomination et espacement des «dyes» ) Electrophorégramme Séquence au format fasta Données brutes 7
Attention! : La base de données est régulièrement sauvegardée sur CD-Rom et remplacée (espace limité sur le disque C). Il est possible de réinstaller des databases antérieures afin de réanalyser des résultats (dans ce cas contacter la personne responsable). 5.3- L exportation des résultats. - Effectuez l exportation et la sauvegarde de vos fichiers d analyse dans votre répertoire (dossier «utilisateur» que vous viderez régulièrement) ou sur un autre support : Formats de fichiers : pour les fichiers texte : *.fasta, *.doc, *.seq pour les électrophorégrammes : *.scf (version 3.0 ou 2.1) NB : Les fichiers (tels que les fichiers «fragments») nécessitant d être ouverts avec le logiciel CEQ Fragment Analysis ne peuvent être enregistrés indépendamment de la database. Remarques à l attention des utilisateurs : Les utilisateurs n ont pas à leur charge d assurer l entretien et la maintenance du CEQ 2000. Il est nécessaire de remplir le cahier de suivi de l appareil avant et après chaque utilisation. Une partie «observations» est prévue pour recueillir les remarques des utilisateurs. En cas de problème, les utilisateurs sont invités à prendre contact avec une personne responsable. 8