ECL RevelBlOt Plus OZYB001-5000 pur 5000 cm 2 de membrane (500 ml) Stckage et stabilité : un an à +4 C MANUEL D UTILISATION P.1
SOMMAIRE Descriptif... P.3 Précautins... P.3 Liste des cmpsants P.3 Slutins de travail. P.4 Matériels nécessaires. P.4 Prtcle abrégé de Western blt.. P.4 Prtcle cmplet de Western blt. P.5 Prtcle de déshybridatin/réhybridatin.. P.6 Réslutin des prblèmes.. P.6 Réslutin des prblèmes (suite)... P.7 Prduits assciés P.8 Avertissement.. P.9 P.2
DESCRIPTIF ECL RevelBlOt Plus est un substrat chimiluminescent de l'hrp utilisé pur la détectin d antigènes immbilisés sur membrane (Western blt). L intensité du signal permet d'btenir un seuil de sensibilité de l rdre du picgramme. PRÉCAUTIONS Afin d btenir le meilleur rapprt signal/bruit de fnd, il est recmmandé : D ptimiser les cncentratins d anticrps primaire et secndaire. De tester plusieurs blquants et de déterminer empiriquement celui qui cnvient le mieux. D ajuter du Tween -20 dans les tampns de blcage et de dilutin des anticrps afin de réduire les signaux nn spécifiques. Tut au lng du prtcle, la membrane ne dit jamais sécher. Assurez-vus, pur cela, d utiliser la quantité idine de tampns, qu il s agisse du tampn de blcage, du tampn de lavage, de l anticrps dilué u de la slutin active ECL RevelBlOt Plus. Il est recmmandé de prcéder aux incubatins sur une platefrme d agitatin u un système équivalent. Lrs de la manipulatin des films u des réactifs de détectin prter des gants exempts de pudre u utiliser des pinces. Ne pas utiliser d azide de sdium (sdium azide) cmme agent de cnservatin des tampns car c est un inhibiteur de l HRP. Utiliser des ustensiles prpres. Les traces de ruille sur les ciseaux, pinces peuvent prvquer un bruit de fnd élevé. La slutin active ECL RevelBlOt Plus est stable 8 heures à température ambiante. Si elle n est pas utilisée extempranément, cnserver la dans une buteille paque. LISTE DES COMPOSANTS Slutin A - Buteille marrn Slutin B - Buteille claire OZYB001-5000 Pur 5000 cm 2 de membrane 250 ml Luminl/Enhancer 250 ml de tampn Pérxide P.3
SOLUTIONS DE TRAVAIL Tampn de dilutin : Tris-Buffered Saline (TBS) Tampn de lavage : TBS-Tween 0,1% Tampn de blcage : dissudre l agent blquant (lait en pudre nn gras, BSA, etc..) dans du TBS-Tween 0,1% Anticrps primaire : préparer une slutin mère à 1 mg/ml de l anticrps spécifique de l antigène à détecter dans le tampn de dilutin. Pur btenir la slutin prête à l empli, diluer cette slutin mère dans le tampn de blcage seln les recmmandatins de dilutin du fabricant. En cnditin standard, la dilutin est entre 1:1000 et 1:5000 u 0,2-1 µg/ml. Anticrps secndaire cnjugué HRP : pur btenir la slutin prête à l empli, diluer celui-ci dans le tampn de blcage. Suivre les recmmandatins du fabricant pur ptimiser la dilutin. En cnditin standard, pur un anticrps cnjugué HRP à 1 mg/ml, la dilutin est entre 1:10 000 et 1:50 000 u 20 à 100 ng/ml. Slutin active ECL RevelBlOt Plus : elle est btenue en mélangeant à quantité égale (50/50) la slutin A (Luminl/Enhancer, cntenue dans la buteille marrn) et la slutin B (tampn Pérxide, cntenue dans la buteille claire). MATÉRIELS NÉCESSAIRES Cuves d électrphrèse de prtéines, appareil pur transfert sur membrane de Western blt. Membrane de nitrcellulse (u PVDF) pur applicatin Western blt. Platefrme d agitatin u système équivalent. Détectin : Imageur dté d une caméra CCD cmpatible avec la détectin de signaux faibles et cnfiguré pur le Western blt. u Film sensible aux rayns X, cassette et réactifs de fixatin et de dévelppement dédiés à l autradigraphie. PROTOCOLE ABRÉGÉ DE WESTERN BLOT ÉTAPE 1 ÉTAPE 2 ÉTAPE 3 Séparatin des prtéines par éléctrphrèse Transfert sur membrane Blcage des sites nn spécifiques ÉTAPE 4 ÉTAPE 5 ÉTAPE 6 Incubatin avec l anticrps primaire spécifique de l antigène à détecter Premier lavage de la membrane Incubatin de la membrane avec l anticrps secndaire cnjugué à l HRP ÉTAPE 7 ÉTAPE 8 ÉTAPE 9 Deuxième lavage de la membrane Incubatin 5 minutes avec la slutin active ECL RevelBlOt Plus (50/50 slutin A et slutin B) Expsitin de la membrane à un film sensible aux rayns X u utilisatin d un imageur cnfiguré pur le Western blt P.4
PROTOCOLE COMPLET DE WESTERN BLOT Étape 1 Séparer la prtéine prtant l antigène d intérêt par électrphrèse. Étape 2 Transférer les prtéines sur une membrane de nitrcellulse (une membrane PVDF u d autre nature peut être utilisée ; le cas échéant, des ptimisatins peuvent être requises). Étape 3 Incuber la membrane dans le tampn de blcage pendant 1 heure à température ambiante sur une platefrme d agitatin u système équivalent. Alternativement, la membrane peut être incubée tujurs dans le tampn de blcage sur la nuit, entre +2 C et +8 C. Étape 4 Éliminer le tampn de blcage. Incuber la membrane avec l anticrps dilué pendant 1 heure sur une platefrme d agitatin u système équivalent. Suivre les dilutins recmmandées dans la sectin «Slutins de travail». Étape 5 Laver la membrane dans le tampn de lavage sur une platefrme d agitatin u système équivalent en faisant au mins 4 à 6 lavages de 5 minutes u plus chacun. Chaque lavage est effectué à température ambiante avec du tampn de lavage frais. L augmentatin du vlume de tampn et du nmbre de lavage réduit le niveau de bruit de fnd. Étape 6 Rincer la membrane et incuber sur une platefrme d agitatin u système équivalent pendant une heure avec l anticrps secndaire cnjugué HRP dilué. Suivre les dilutins recmmandées dans la sectin «Slutins de travail». Étape 7 Laver la membrane (vir étape 5). Étape 8 Incuber la membrane dans la slutin active ECL RevelBlOt Plus (vir sectin «Slutins de travail») pendant 5 minutes. Le vlume ttal dit cuvrir la membrane ; en cnditin standard, utiliser 0,1 ml de slutin active ECL RevelBlOt Plus par cm 2 de membrane. La slutin active ECL RevelBlOt Plus est stable 8 heures à température ambiante. L incubatin peut être réalisée à la lumière du jur u dans une pièce nrmalement éclairée, mais pas à prximité d une lumière intense. Si la slutin active ECL RevelBlOt Plus n est pas utilisée extempranément, prtéger-la de la lumière en la cnservant dans une buteille paque. Étape 9 Retirer la membrane de la slutin active ECL RevelBlOt Plus Évacuer l excès de réactif de détectin en tenant la membrane verticalement et en mettant un des brd de celle-ci en cntact avec un papier absrbant. Envelpper la membrane dans du film plastique extra-fin transparent, type «Saran Wrap» u équivalent. Prendre garde à éliminer l excès de liquide et les bulles d air. Rappel : la membrane ne dit jamais sécher (vir sectin Précautins ). Révélatin par autradigraphie sur film : Placer la membrane ainsi prtégée dans une cassette pur film sensible aux rayns X, côté prtéines vers le haut. Le film sensible aux rayns X dit rester sec pendant l expsitin. Assurez-vus que la membrane humide ne sit jamais en cntact avec le film. Éteindre la lumière, placer le film sur le dessus de la membrane, fermer la cassette. Ne pas buger le film durant le temps de l expsitin pur éviter tut artefact. Expser une minute. Le temps d expsitin peut varier pur ptimiser les résultats. P.5
Retirer le film et placer immédiatement un nuveau film nn expsé. Refermer la cassette. L émissin lumineuse dure plusieurs heures avec une intensité maximale entre 5 et 30 minutes après l incubatin du ECL RevelBlOt Plus, puis décrit ensuite au fil du temps. Il est dnc pssible, si besin, de refaire une u plusieurs autres expsitins avec de nuveaux films. Cependant, la demi-vie de l enzyme HRP est telle que des temps d expsitin plus lngs peuvent être nécessaires. Dévelpper le film avec les réactifs de fixatin et dévelppement adéquats. Révélatin à l aide d un imageur : l appareil dté d une caméra CCD dit être cnfiguré pur le Western blt. Le temps d expsitin varie d une machine à l autre et peut être plus lng qu avec un film autradigraphique. Nte : en fin de prtcle, vus puvez stcker la membrane envelppée dans le film transparent type Saran Wrap à une température de +2 C à +8 C. La membrane peut être déshybridée et réhybridée plusieurs fis. PROTOCOLE DE DÉSHYBRIDATION/RÉHYBRIDATION Étape 1 Plnger la membrane dans le tampn de déshybridatin (2-Mercaptéthanl 100 mm, SDS 2%, Tris-HCl 62,5 mm, ph 6,7) et incuber 30 minutes à 50 C. Si vus vulez travailler dans des cnditins plus stringentes, l incubatin peut se faire à 70 C sur une durée supérieure à 30 min. Étape 2 Incuber la membrane 2 x 10 minutes à température ambiante dans du tampn PBS- Tween u TBS-T. Remarque : à la suite de cette étape, la membrane peut être incubée avec la slutin active ECL RevelBlOt Plus et ensuite expsée sur un film u dans un imageur CCD pur vérifier l absence de tut signal. Étape 3 Incuber la membrane dans le tampn de blcage (vir sectin «Slutins de travail») pendant 1 heure à température ambiante. Étape 4 Reprendre le prtcle de Western blt à l étape 4. RÉSOLUTION DES PROBLÈMES 1.Bruit de fnd élevé Causes pssibles Remarques / Slutins Cncentratins d anticrps trp élevées Diluer les cncentratins d anticrps primaires et/u secndaires Agent blquant Vérifier que le tampn de blcage a été préparé crrectement inpérant Assurez-vus que l agent blquant est bien présent dans les slutins diluées d anticrps primaires et secndaires Changer l agent blquant : 1 à 10% de BSA en TBS-Tween u PBS- Tween (préparé extempranément) ; 0,5% à 3% de gélatine en TBS-T u PBS-Tween (préparé extempranément) Lavage inefficace Augmenter le temps de lavage et le vlume de tampn de lavage Ajuter du Tween (si ce n est pas déjà fait) Augmenter la cncentratin de Tween dans le tampn de lavage Tampns cntaminés Assurez-vus que tus les tampns sient préparés extempranément et filtrés P.6
Cntaminatin du matériel (cuves / appareil de transfert). Prblèmes de membrane Slutin de détectin ECL RevelBlOt Plus Surexpsitin (film u imageur ) Nettyer u remplacer les appareils Vérifier que la membrane est cmplètement immergée et reste bien humidifiée dans tutes les slutins Utiliser des membranes de nitrcellulse (u PVDF) de bnne qualité Une membrane abîmée peut prvquer une fixatin nn spécifique des anticrps. Manipuler la membrane avec précautin à l aide de gants exempts de pudre (vir sectin «Précautins») Utiliser des pinces prpres pur manipuler la membrane après lavage Excès de Slutin Active ECL RevelBlOt Plus. Éliminer bien l excès avec un papier absrbant avant de placer la membrane dans la cassette Expser le film pendant un temps plus curt (15 secndes peuvent suffire). Si la durée d expsitin est trp curte pur une manipulatin aisée, réduire la cncentratin en anticrps Laisser la membrane à l bscurité avant d expser de nuveau. Avec un imageur cnfiguré pur le Western blt, il est pssible d utiliser un temps d expsitin curt, puis d accumuler le signal en série 2. Signal faible, aucun signal Causes pssibles Prtéines nn transférées durant le Western blt Quantité trp faible d antigènes u d anticrps Remarques / Slutins Clrer les prtéines pur vérifier l efficacité du transfert Optimiser la cncentratin d acrylamide dans le gel, le temps de transfert, le vltage à l aide de marqueurs cuvrant le pids mléculaire attendu (le pids mléculaire et le rayn de Stke de la prtéine affectent le transfert). Vus puvez aussi utiliser une prtéine cnnue cmme cntrôle psitif Augmenter la quantité de prtéines prtant l antigène d intérêt Augmenter la cncentratin et le temps d incubatin de l anticrps primaire. Une ptimisatin peut être nécessaire Fixatin faible de l anticrps primaire Assurez-vus que l antigénicité de la prtéine n a pas été affectée par les traitements inhérents à l électrphrèse (SDS, urée, dénaturatin, etc.. ). Vérifier la capacité de fixatin de l anticrps à l antigène par Dt blt HRP en excès Une quantité excessive d HRP peut prvquer la déplétin du substrat ECL RevelBlOt Plus et l extinctin rapide du signal. Diluer l anticrps cnjugué à l HRP au mins 10 fis Diminutin d activité de l HRP u du substrat ECL RevelBlOt Plus Vérifier que la slutin active ECL RevelBlOt Plus et les slutins A (Luminl/Enhancer) et B (tampn Pérxide) nt été stckées et utilisées dans de bnnes cnditins Tester l activité de l HRP : préparer un petit vlume (1 ml) de slutin active ECL RevelBlOt Plus. Dans le nir, y ajuter 1 µl d anticrps cnjugué HRP nn dilué. Une lumière bleue dit être visible à l eil nu P.7
3. Bandes nn spécifiques Cause pssible Remarques / slutins HRP en excès Diluer l anticrps cnjugué à l HRP au mins 10 fis 4. Répartitin inégale des signaux Causes pssibles Transfert de prtéines inefficace Membrane nn immergée d une manière hmgène Cntaminatin par des empreintes de digts et/u de la kératine Présence de bulles entre le film et la membrane Vir ci-dessus (aucun signal) Remarques / slutins Recmmencer avec une nuvelle membrane Assurez-vus que la membrane sit en permanence entièrement recuverte durant les incubatins Eviter de tucher la membrane. Utiliser des gants et des pinces Eliminer les bulles. Expser à nuveau 5. Bandes blanches (négatives) sur le film Cause pssible Remarques / Slutins Excès d HRP Diluer l anticrps cnjugué à l HRP au mins 10 fis PRODUITS ASSOCIÉS Ozyme recmmande les prduits suivants Anticrps secndaires Western Blt Anti-Lapin 7074S Gat Anti-Rabbit IgG, HRP-linked Antibdy 1 ml DKXRB-003DHRPX Dnkey anti-rabbit IgG (H&L) - Affinity Pure, HRP Cnjugate 1 mg CKXRB-003DHRPX Chicken anti-rabbit IgG (H&L) - Affinity Pure, HRP Cnjugate 1 mg SHXRB-003DHRPX Sheep anti-rabbit IgG (H&L) - Affinity Pure, HRP Cnjugate 1 mg Anti-suris 7076S Hrse Anti-Muse IgG, HRP-linked Antibdy 1 ml RBXMU-003DHRPX Rabbit anti-muse IgG (H&L) - Affinity Pure, HRP Cnjugate 1 mg DKXMU-003DHRPX Dnkey anti-muse IgG (H&L) - Affinity Pure, HRP Cnjugate 1 mg CKXMU-003DHRPX Chicken anti-muse IgG (H&L) - Affinity Pure, HRP Cnjugate 1 mg P.8
Anti-Rat 7077S Gat Anti-Rat IgG, HRP-linked Antibdy 1 ml RBXRT-003DHRPX Rabbit anti-rat IgG (H&L) - Affinity Pure, HRP Cnjugate 1 mg DKXRT-003DHRPX Dnkey anti-rat IgG (H&L) - Affinity Pure, HRP Cnjugate 1 mg CKXRT-003DHRPX Chicken anti-rat IgG (H&L) - Affinity Pure, HRP Cnjugate 1 mg Anti-Bitine 7075S Gat Anti-Bitin IgG, HRP-linked Antibdy 1 ml Western Blt après immunprécipitatin Muse Anti-rabbit IgG (Cnfrmatin Specific) (L27A9) mab (HRP 5127S Cnjugate) 100 µl Marqueurs de Pids mléculaire Nn clré : TAK3450Z Prtein Mlecular Weight Marker (Lw) 50 µl (200 lanes) TAK3451Z Prtein Mlecular Weight Marker (High) 50 µl (200 lanes) TAK3452Z Prtein Mlecular Weight Marker (Brad) 50 µl (200 lanes) Clré 1 culeur : 7720L Prestained Prtein Marker Brad Range (Premixed Frmat) 350 lanes 7720S Prestained Prtein Marker, Brad Range (Premixed Frmat) 70 lanes Clré 4 culeurs : LON00193837 PrSieve QuadClr TM Prtein Marker 500 µl Gels prêts à l empli Gamme PAGEr de gels Tris-Glycine (T-G). Nmbreux frmats et % de T-G en % unique u en gradient. Imageurs Cntactez la divisin instrumentatin d Ozyme au : 01 30 85 92 89 u equipement@zyme.fr AVERTISSEMENT Ce prduit est à usage de recherche uniquement. P.9