abc Ann Biol Clin 2010 ; 68 (2) :

abc Ann Biol Clin 2010 ; 68 (2) : 149-56 Anticorps anti-gliadines déamidées et maladie cœliaque : données actuelles et évaluation des faux positifs de cinq trousses de dosage Anti-deamidated gliadin peptides antibodies and coeliac disease: state of art and analysis of false-positive results from five assays doi: 10.1684/abc.2010.0398 Laurence Lutteri Clémence Sagot Jean-Paul Chapelle Service de chimie médicale, Centre hospitalier universitaire de Liège, Belgique <laurence.lutteri@chu.ulg.ac.be> Article reçu le 14 août 2009, accepté le 30 octobre 2009 Tirés à part : L. Lutteri Résumé. Récemment, les anticorps anti-gliadines déamidées ont supplanté les anti-gliadines natives dans le diagnostic sérologique des patients cœliaques. Cette étude a pour but d évaluer la spécificité des trousses utilisant des peptides de gliadine déamidée et de la comparer à celle des tests basés sur la gliadine native. Les anticorps anti-gliadines natives, anti-gliadines déamidées et anti-transglutaminase néo-épitope ont été dosés par cinq différentes techniques Elisa (IgA et IgG) quantitatives, ainsi que par un Elisa de screening chez 46 patients non cœliaques. Les anticorps anti-gliadines natives IgA et IgG sont trouvés chez 24 et 63 % des patients non cœliaques, respectivement. L utilisation de la gliadine déamidée réduit le nombre de résultats faussement positifs en IgA et particulièrement en IgG : 21 et 24 % respectivement des patients pour la trousse Anti-Gliadin (GAF-3X) Euroimmun, 7 et 26 % pour la trousse Bindazyme Human Anti-Gliadin (MGP) The Binding Site ainsi que 0 et 41 % pour la trousse Celiac G+ Immco. La trousse anti-transglutaminase néo-épitope, recherchant simultanément les anticorps anti-transglutaminase, anti-gliadines déamidées et anti-néo-épitope, n apporte pas une réelle aide au diagnostic différentiel de la maladie cœliaque car 30 % des patients présentent un résultat positif en IgG contre 2 % en IgA. La trousse de screening d Inova, recherchant simultanément les anticorps anti-transglutaminase et anti-gliadines déamidées, présente une positivité chez 24 % de la cohorte. En conclusion, le dosage des anticorps anti-gliadines déamidées paraît être la méthode de choix pour sa plus grande spécificité face aux anticorps anti-gliadines natives dans le diagnostic différentiel de la maladie cœliaque. Mots clés : anticorps anti-gliadines déamidées, anticorps anti-transglutaminase, maladie cœliaque, Elisa, spécificité Abstract. Recently, anti-deamidated gliadin antibodies were proposed for the serological diagnosis of celiac disease. We evaluate the specificity of different anti-deamidated gliadin antibodies ELISA in comparison with conventional anti-native gliadin kits. Serum samples from 46 non celiac patients were analyzed by five different quantitative ELISA for anti-native gliadin, antideamidated gliadin and anti-transglutaminase neo-epitope antibodies together with a screening ELISA. Twenty-four percent of the patients demonstrated anti-native gliadin IgA and 63% IgG antibodies. Using anti-deamidated gliadin antibodies, the number of false positive IgA and, particularly, IgG results, markedly decreased in the non celiac patients: 21 and 24% respectively with Ann Biol Clin, vol. 68, n o 2, mars-avril 2010 149

anti-gliadin (GAF-3X) Euroimmun kit, 7 and 26% with Bindazyme Human Anti-Gliadin (MGP) The Binding Site kit and 0 and 41% with Celiac G+ Immco kit. The new assay which makes use of the physiological complex of tissue transglutaminase cross-linked with deamidated gliadin peptides, called neo-epitope, did not improve the differential diagnosis of celiac disease with 30% of false positive results in IgG (2% in IgA). Using the Inova screening kit, a positive result for IgA and/or IgG anti-deamidated gliadin and/or antitissue transglutaminase antibodies was obtained in 24% of the non celiac patients. In conclusion, our study assessed the superiority, in terms of specificity, of anti-deamidated gliadin antibodies, over the conventional anti-gliadin antibodies for the differential diagnosis of celiac disease. Key words: anti-deamidated gliadin peptides antibody, anti-transglutaminase antibody, celiac disease, ELISA, specificity La maladie cœliaque, parfois appelée cœliaquie ou intolérance au gluten, est une entéropathie chronique d origine auto-immune, caractérisée par une atteinte totale ou subtotale des villosités de l intestin grêle. Cette maladie est due à une intolérance au gluten et aux protéines apparentées que l on trouve dans certaines céréales (blé, seigle, orge ). Il en résulte des signes de malabsorption et des carences alimentaires [1]. La maladie cœliaque présente deux pics de fréquence : dans la petite enfance, le plus souvent entre six mois et deux ans ou après introduction du gluten dans le régime alimentaire, et à l âge adulte, entre 20 et 40 ans ; cependant, des formes tardives (après 65 ans) ne sont pas rares. Cette maladie touche surtout les populations d Europe du Nord et les estimations de sa fréquence varient entre 1 sur 300 et 1 sur 500. Elle est deux à trois fois plus fréquente chez la femme que chez l homme. Il existe une nette prédisposition familiale à la maladie cœliaque, dont la prévalence est de l ordre de 10 % chez les parents au premier degré d un patient atteint. La maladie est rencontrée essentiellement chez des patients porteurs du groupe HLA DQ2 et, à un moindre degré, DQ8 [2]. Les signes cliniques les plus fréquents sont : diarrhée avec stéatorrhée, douleurs abdominales, amaigrissement, asthénie, malabsorption se traduisant par une anémie et/ou une ostéoporose. Ces signes cliniques ne sont cependant présents que chez moins de 20 % des malades, ce qui a pour corollaire qu un grand nombre de patients atteints de la maladie cœliaque ne sont pas connus. Toutefois, grâce aux avancées diagnostiques réalisées ces dernières années, bon nombre de patients atteints de formes frustes ainsi que de formes silencieuses ont été dépistés, ce qui a eu pour conséquence d accroître l incidence de la maladie. Si l on veut augmenter encore les chances d identifier d autres patients asymptomatiques porteurs de la maladie, il sera nécessaire de développer de nouveaux outils de diagnostic, ce qui implique de mieux cerner les mécanismes pathogéniques de l affection. L agent responsable de la maladie cœliaque est la gliadine, fraction soluble du gluten dans l éthanol. Riche en glutamine et proline, la gliadine peut être séparée en fractions α,β,γ, ω, d immunogénicités variables ; la fraction la plus immunogène est l α-gliadine. La gliadine est partiellement digérée dans le tube digestif. Chez certains individus, la perméabilité intestinale augmentée par rapport à la normale permet aux peptides de traverser l épithélium intestinal et d atteindre les entérocytes où ils subissent l action de la transglutaminase, enzyme calcium dépendante, qui transforme les résidus d acide aminé glutamine en résidus d acide glutamique. Cette réaction de déamidation, couplée à une transamidation permettant la liaison covalente entre protéines, augmente l antigénicité des peptides de gliadine, facteur crucial dans le mécanisme de toxicité de la maladie cœliaque. Les peptides déamidés sont présentés, en association avec les déterminants HLA DQ2 et/ou DQ8 aux lymphocytes T CD4 par les cellules présentatrices d antigènes. Ceci entraîne une réponse mixte TH1 et TH2. La réponse TH1 consiste en la production de cytokines pro-inflammatoires (TNFα, IL-15 ). Il en résulte une activation non spécifique des lymphocytes intra-épithéliaux CD8+, des polynucléaires et des macrophages qui vont exercer leur action cytotoxique sur les entérocytes intestinaux et provoquer les lésions de la maladie cœliaque. Quant à la réponse TH2, elle induit la production de divers anticorps par les lymphocytes B [3, 4]. 150 Ann Biol Clin, vol. 68, n o 2, mars-avril 2010

Anticorps anti-gliadines déamidées et maladie cœliaque Le traitement habituel de la maladie cœliaque consiste à éliminer tout apport de gluten dans l alimentation. Sous l effet d un régime sans gluten, on assiste à la disparition progressive des signes cliniques, biologiques et histologiques. En 1970, la Société européenne de gastro-entérologie, hépatologie et nutrition pédiatrique (ESPGHAN) a défini comme suit les critères de diagnostic de la maladie cœliaque : un syndrome de malabsorption associé à une atrophie totale de l intestin grêle suite à l ingestion de gluten ; la guérison des troubles cliniques et histologiques après suppression du gluten ; la réapparition des troubles cliniques et/ou seulement des lésions histologiques intestinales lors de la réintroduction du gluten dans l alimentation. Ces critères de diagnostic, révisés en 1990, reposent sur l identification d une seule biopsie positive en présence d au moins 2 ou 3 anticorps [5]. Biopsie duodénale La biopsie duodénale reste à ce jour le «gold standard» du diagnostic de la maladie cœliaque. Elle permet de visualiser les troubles et lésions liés à l affection. La classification de Marsh permet de décrire l évolution des lésions en stades successifs : muqueuse normale, infiltration de l épithélium par les lymphocytes, hyperplasie des cryptes puis perte progressive des cellules épithéliales avec, finalement, atrophie villositaire. Tests sérologiques Les tests sérologiques sont de plus en plus utilisés pour le dépistage des patients chez qui une maladie cœliaque est suspectée ainsi que pour suivre l efficacité d un régime sans gluten. De plus ils contribuent fortement à mettre en évidence les formes frustes et asymptomatiques de la maladie. Au début des années 1970, les anticorps anti-réticuline [6] ont été parmi les premiers décrits dans la maladie cœliaque. Ces anticorps, qui disparaissent sous régime sans gluten et réapparaissent lors de la réintroduction de celui-ci, étaient recherchés par immunofluorescence indirecte sur des coupes de tissus rénaux murins. Ils sont généralement de classe IgA. Plusieurs types ont été décrits, mais seuls les anti-r1 sont rencontrés dans le cadre de la maladie cœliaque. Bien que sa spécificité fût voisine de 100 %, ce test fut assez rapidement abandonné en raison de sa sensibilité insuffisante. C est en 1983 que l équipe de Chorzelski [7] a décrit pour la première fois les anticorps anti-endomysium. Ces anticorps, recherchés par immunofluorescence indirecte, réagissent avec la substance intermyofibrillaire du muscle lisse. Dans la maladie cœliaque, les anticorps de classe IgA montrent une sensibilité variant de 85 à 100 % en fonction des études tout en conservant une spécificité proche de 100 %. Ils peuvent être recherchés sur différents substrats : l œsophage de singe où une fluorescence en «nid d abeille» de la muscularis mucosae est observée dans le tiers inférieur de la coupe (figure 1) ou encore le cordon ombilical humain - utilisé dans le but de sauvegarder les singes - où l on peut observer un marquage de type «rayon de miel» des couches musculaires des veines du cordon. La sensibilité et spécificité de ces coupes sont similaires. Les anticorps anti-endomysium disparaissent en 3 à 12 mois si le régime sans gluten est bien suivi. Un conjugué de type IgG peut être utilisé en cas de déficience en IgA chez le patient. En 1997, Dietrich et al. [8] ont démontré que la transglutaminase tissulaire (ttg) correspondait à un antigène cible majeur reconnu par les anticorps anti-endomysium et ont ainsi permis la mise au point de tests sérologiques par technique Elisa (Enzyme-linked immonosorbent assay). Les premiers tests, utilisant de la transglutaminase tissulaire purifiée extraite de foie de cobaye et présentés d abord comme performants, furent ensuite critiqués pour leur manque de spécificité [9]. Par la suite, des essais utilisant la transglutaminase recombinante comme antigène, démontrèrent une spécificité proche de 100 %. Des trousses utilisant de la transglutaminase purifiée provenant de globules rouges humains existent également. Citons, parmi ceux-ci, les tests rapides utilisables au cabinet du médecin. Les anticorps anti-ttg montrent en définitive une sensibilité et une spécificité comparables à celles des anticorps anti-endomysium. La recherche des anti-ttg est recommandée par certains du fait qu elle n est pas dépendante d une interprétation de l immunofluorescence Figure 1. Anticorps anti-endomysium sur coupe d œsophage de singe. Ann Biol Clin, vol. 68, n o 2, mars-avril 2010 151

comme c est le cas lors de la recherche des anticorps antiendomysium. Il importe toutefois de ne pas remplacer trop rapidement le test anti-endomysium en immunofluorescence par le test Elisa anti-ttg, car certains patients cœliaques montrent une positivité en immunofluorescence alors qu ils sont négatifs en Elisa. Notons cependant que l inverse peut être observé : quelques cas de faux positifs en Elisa ont été répertoriés. La meilleure solution serait donc de faire les deux tests en parallèle. Depuis plus de 25 ans, les anticorps anti-gliadines ont été utilisés dans le dépistage de la maladie cœliaque, d abord en immunofluorescence [10]. Rapidement, cependant, un Elisa utilisant de la gliadine purifiée a permis une recherche plus simple et surtout quantitative de ces anticorps de classe IgA et IgG. La spécificité de ce dosage, et tout particulièrement des IgG, est cependant faible par rapport à celle des anticorps anti-endomysium car on retrouve ce type d anticorps dans d autres pathologies, telles que la polyarthrite rhumatoïde, les hépatopathies Ce test n a donc eu d intérêt que dans le suivi quantitatif du régime sans gluten ou encore dans le diagnostic de la maladie cœliaque chez les enfants chez lesquels l apparition d auto-anticorps tels que les anticorps anti-transglutaminase est moins précoce. En 2001, les travaux d Aleanzi [11] concernant la déamidation des peptides de gliadine puis, en 2004, la découverte des propriétés fortement immunogènes des nonapeptides déamidés PLQPEQPFP et PEQLPQFEE [12] ont permis la mise au point de tests Elisa très spécifiques de la maladie cœliaque, remettant les anticorps anti-gliadines en première ligne. Matériels et méthodes Échantillons biologiques Cette étude, approuvée par le Comité d éthique Hospitalo- Facultaire Universitaire de Liège, a porté sur une cohorte de 46 patients âgés de 2 à 74 ans ayant consulté aux services de gastroentérologie ou de pédiatrie du CHU de Liège (Belgique) pour divers symptômes allant de diarrhées accompagnées de douleurs abdominales à la malabsorption. Sur la base des résultats de l examen clinique, d examens histologiques (par biopsie) et/ou de la sérologie (anti-ttg et/ou anti-endomysium), le diagnostic final était autre que celui de la maladie cœliaque. En routine, le dosage des anticorps anti-ttg IgA a été réalisé avec la trousse Bindazyme Human Anti-tissue transglutaminase (The Binding Site, Birmingham, Royaume-Uni) et la recherche des anticorps anti-endomysium effectuée par immunofluorescence sur des coupes d œsophage de singe (The Binding Site, Birmingham, Royaume-Uni) avec un conjugué FITC de mouton anti-iga humaines pour coupe de singe. L ensemble des patients a présenté des résultats d anticorps anti-ttg IgA et/ou d anticorps anti-endomysium IgA négatifs. Pour réaliser cette étude, nous avons utilisé des échantillons de sérum conservés à - 80 C et analysés immédiatement après décongélation. Réactifs Parmi les trousses Elisa disponibles sur le marché pour lasérologiedelamaladiecœliaque, certaines permettent une approche semi-quantitative, d autres une détermination quantitative des anticorps recherchés. En screening, nous avons évalué les trousses Quanta Lite h-ttg/dgp Screen (Inova Diagnostics, San Diego, Etats-Unis) pour la recherche semi-quantitative des anticorps anti-ttg et anti-gliadines déamidées IgA et IgG, ainsi que les trousses Aeskulisa ttg New generation (Neo-epitopes) IgA et IgG (Aesku Diagnostics, Wendelsheim, Allemagne) utilisant comme source antigénique le complexe gliadines déamidées-ttg ; cette trousse permet de mettre en évidence les anticorps anti-ttg, les anticorps anti-gliadines déamidées et les anticorps contre le néoépitope formé par le complexe gliadines déamidées-ttg (figure 2) [13, 14]. Pour le dosage des anticorps anti-gliadines déamidées IgA et IgG, les trousses Bindazyme Human Anti-Gliadin (MGP) IgA et IgG (The Binding Site, Birmingham, Royaume-Uni), Anti-Gliadin (GAF-3X) Elisa IgA et IgG (Euroimmun, Lübeck, Allemagne), ainsi que les trousses Celiac G+ IgA et IgG (IMMCO Diagnostics, Buffalo, États-Unis) ont été utilisées. Pour le dosage des anticorps anti-gliadines natives IgA et IgG, nous avons employé les trousses Autoimmune EIA Anti-Gliadin IgA et IgG (Bio-Rad, États-Unis). Les tests Elisa ont été utilisés selon les instructions des fournisseurs. Les détails techniques des différents kits sont résumés dans le tableau 1. Ac anti-ttg Figure 2. ttg néo-épitope. ttg Ac antinéo-épitope Gliadine déamidée Ac anti-gliadine déamidée 152 Ann Biol Clin, vol. 68, n o 2, mars-avril 2010

Anticorps anti-gliadines déamidées et maladie cœliaque Tableau 1. Détails techniques des différents réactifs utilisés dans l étude. Fabricant et nom de la trousse Antigène Incubation (sérum ; conjugué ; substrat), min Biorad Autoimmune EIA Anti-Gliadin Euroimmun Anti-Gliadin (GAF-3X) The Binding Site Bindazyme Human Anti-Gliadin (MGP) Immco Celiac G+ Inova Quanta Lite h-ttg/dgp Screen Aesku. Diagnostics Aeskulisa ttg New generation (Néo-épitopes) Nombre de calibrants Conjugué Substrat Valeur seuil proposée Range de mesure α-gliadine purifiée 30 ; 30 ; 30 6 Peroxydase (HRP) IgG TMB 15 U/mL 0-300 U/mL α-gliadine purifiée 30 ; 30 ; 30 6 Peroxydase (HRP) IgA TMB 15 U/mL 0-300 U/mL Gliadine déamidée (GAF-3X) Gliadine déamidée (GAF-3X) 30 ; 30 ; 15 3 Peroxydase (HRP) IgG (lapin) 30 ; 30 ; 15 3 Peroxydase (HRP) IgA (lapin) TMB 25 U/mL 2-200 U/mL TMB 25 U/mL 2-200 U/mL Gliadine déamidée 30 ; 30 ; 30 5 Peroxydase (HRP) IgG TMB 10 U/mL 1,23-100 U/mL Gliadine déamidée 30 ; 30 ; 30 5 Peroxydase (HRP) IgA TMB 10 U/mL 1,23-100 U/mL Gliadine déamidée 30 ; 30 ; 30 5 Peroxydase (HRP) IgG (chèvre) Gliadine déamidée 30 ; 30 ; 30 5 Peroxydase (HRP) IgA (chèvre) h-ttg native et gliadine déamidée ttg recombinante liéeà des peptides de gliadine ttg recombinante liéeà des peptides de gliadine HRP = Horseradish peroxidase ; TMB = 3,3, 5,5 tétra-méthylbenzidine. TMB 20/25 U/mL 1-160 U/mL TMB 20/25 U/mL 1-320 U/mL 30 ; 30 ; 30 1 Peroxydase (HRP) IgA/ TMB / / IgG (chèvre) 30 ; 30 ; 30 6 Peroxydase (HRP) IgG TMB 12/18 U/mL 0-300 U/mL 30 ; 30 ; 30 6 Peroxydase (HRP) IgA TMB 12/18 U/mL 0-300 U/mL Résultats Comparaison des trousses utilisant comme antigène de la gliadine native et celles utilisant des gliadines déamidées Les anticorps anti-gliadines natives de type IgA sont retrouvés positifs chez 11 des 46 patients (24 %) et ceux de type IgG chez 29 d entre eux (63 %). Étant donné qu aucun patient ne souffre de pathologie cœliaque, l ensemble de ces résultats peut être considéré comme faussement positif. L utilisation de gliadines déamidées permet de réduire le nombre de réponses faussement positives. En effet, 10 patients (21 %) ont présenté des résultats supérieurs à 25 U/mL (valeur seuil proposée dans la trousse) lors du dosage des anticorps anti-gliadines déamidées de type IgA avec la trousse Euroimmun et 3 patients (7 %) (résultat supérieur à 10 U/mL) avec la trousse The Binding Site. Avec la trousse Immco, aucun patient ne présentait de résultat supérieur à 25 U/mL ; cependant, 4 sujets (9 %) présentaient des résultats compris entre 20 et 25 U/mL, considérés par le fabricant comme douteux. L amélioration des résultats est encore plus marquée avec l isotype IgG : seuls 24 % des patients présentent encore un dosage positif (résultat supérieur à 25 U/mL) avec la trousse Euroimmun et 26 % avec la trousse The Binding Site (résultat supérieur à 10 U/mL). Le nombre de réponses positives (résultat supérieur à 25 U/mL) s élève cependant à 41 % avec la trousse Immco. Notons qu un patient supplémentaire présente un résultat compris entre 20 et 25 U/mL, considéré par le fabricant comme douteux, ce qui porte à 43 % le pourcentage de patients positifs parmi la cohorte. Pour l isotype IgA, aucune différence significative n est observée entre le nombre de patients faussement positifs observé avec la trousse utilisant de la gliadine native comme antigène et la trousse Euroimmun, tandis qu une faible différence est remarquée avec la trousse The Binding Site (p = 0,05). Par contre, une différence hautement significative est observée avec la trousse Immco (p = 0,001). De même, aucune différence significative n est observée entre les trousses de dosage des anticorps anti-gliadines déamidées Euroimmun et The Binding Site. Ceci est également le cas entre la trousse Binding Site et Immco. En revanche, une différence significative (p = 0,03) est observée entre le nombre de faux positifs obtenus avec les trousses Euroimmun et Immco. En ce qui concerne l isotype IgG, la différence de patients faussement positifs est hautement significative entre les trousses utilisant de la gliadine native et celles utilisant de la gliadine déamidée (p < 0,0001), à l exception de la trousse Immco (p = 0,06). Notons qu aucune différence n est observée entre les résultats donnés par les différentes trousses utilisant la gliadine déamidée. Ann Biol Clin, vol. 68, n o 2, mars-avril 2010 153

Bien que le nombre de résultats faussement positifs ne soit pas négligeable, les taux d anticorps anti-gliadines natives observés restent cependant relativement bas (tableau 2). En effet, les valeurs maximales enregistrées sont de 33 U/mL pour l isotype IgA et de 34 U/mL pour l isotype IgG, tandis que les médianes sont de 20 U/mL et 21 U/mL respectivement. Ceci est également observé avec la plupart des trousses utilisant de la gliadine déamidée comme source antigénique : les valeurs maximales observées sont de 16 U/mL pour la trousse The Binding Site en IgA et 53 U/mL en IgG, avec des médianes respectives de 16 U/mL et 15 U/mL. Les valeurs maximales observées sont de 24 U/mL pour la trousse Immco en IgA et de 150 U/mL en IgG (médianes de 21 U/mL et 53 U/mL). La trousse Euroimmun présente par contre des valeurs maximales élevées : 200 U/mL pour la trousse en IgA et 73 U/mL en IgG (médianes : 48 U/mL et 36 U/mL). Étude de la trousse de screening Inova : recherche concomitante des anticorps anti-ttg et des anticorps anti-gliadines déamidées d isotype IgG et IgA Onze patients de la cohorte (24 %) ont présenté des résultats positifs avec la trousse de screening Inova. Neuf patients montrent un dosage supérieur à la valeur seuil dans l une et/ou l autre trousse d anticorps anti-gliadines déamidées (les anticorps anti-ttg IgA étant tous négatifs comme défini au départ). Les deux patients n ayant pas donné de résultat positif ont été testés pour la recherche des anticorps anti-ttg IgG : aucun n était positif. Il s agit donc chez eux de résultats faussement positifs en screening, que nous expliquons par de possibles réactions croisées entre les antigènes. Nous avons également pu observer 18 résultats de screening négatif, corrélés à la clinique, pour lesquels un résultat d anticorps anti-gliadines déamidées était positif. Dans 9 cas, seule une des 3 trousses suivantes rendait un résultat positif : 5 résultats étaient uniquement positifs avec la trousse Immco IgG, 1 résultat avec la trousse Immco IgA, 1 résultat avec la trousse Binding Site IgG et 2 résultats uniquement positifs en IgA avec la trousse Euroimmun. Nous avons également observé 3 patients présentant des résultats positifs pour les 3 trousses en IgG. Les 6 autres patients montrent des résultats positifs pour 2 des 3 trousses. Étude de la trousse de screening ttg Néo-épitope : recherche concomitante des anticorps anti-ttg, des anticorps anti-gliadines déamidées et des anticorps contre le complexe gliadines déamidées-ttg Selon la valeur seuil définie pour les IgA, 15 % des patients présentent un résultat supérieur à 12 U/mL, considéré comme équivoque et 2 % un résultat supérieur à 18 U/mL, considéré comme positif. En ce qui concerne les IgG, un résultat supérieur à 12 U/mL est retrouvé chez 50 % des patients et un résultat supérieur à 18 U/mL chez 30 % d entre eux. Chez les patients présentant des résultats faussement positifs, les concentrations d anticorps anti-ttg néo-épitopes observées sont majoritairement relativement bas : la valeur maximum observée est de 200 U/mL pour l isotype IgA et 169 U/mL pour l isotype IgG (médianes : 17 U/mL et 25 U/mL). Discussion La sérologie classique pour le diagnostic de la maladie cœliaque passe par la recherche des anticorps anti-endomysium en immunofluorescence ou anti-transglutaminase en Elisa ainsi par le dosage des anticorps anti-gliadines IgA et IgG. Cependant, la recherche des anticorps anti-gliadine a été discréditée par le manque de sensibilité et de spécificité des techniques mises en œuvre. Récemment, diverses études ont révélé que les anticorps anti-gliadines des patients souffrant de pathologie cœliaque se liaient à un nombre très limité d épitopes spécifiques du peptide de gliadine [11, 12]. La déamidation du peptide de gliadine par la Tableau 2. Valeurs maximales et médianes observées parmi les patients de la cohorte (n = 46) présentant des résultats faussement positifs pour les différentes trousses de dosage des anticorps anti-gliadines. Valeur seuil (U/mL) Nombre de patients faussement positifs Valeur maximale (U/mL) Gliadines natives Biorad IgA 15 11 33 20 IgG 15 29 34 21 Gliadines déamidées Euroimmun IgA 25 10 200 48 IgG 25 11 73 36 Gliadines déamidées Binding Site IgA 10 3 16 16 IgG 10 12 53 15 Gliadines déamidées Immco IgA 20 (25) 0 24 21 IgG 20 (25) 19 150 53 Valeur médiane (U/mL) 154 Ann Biol Clin, vol. 68, n o 2, mars-avril 2010

Anticorps anti-gliadines déamidées et maladie cœliaque transglutaminase tissulaire, enzyme associée à la maladie coeliaque, a pour conséquence d accroître le pouvoir immunogène de la gliadine. De nombreuses études prouvent que les techniques permettant la recherche des anticorps anti-gliadines natives ne devraient plus être utilisées et devraient être systématiquement remplacées par un dosage des anticorps antigliadines déamidées présentant une meilleure spécificité mais également sensibilité. Volta [15] montre que 9,7 % de sa population non cœliaque présente des résultats positifs pour la recherche des anticorps anti-gliadines déamidées IgA et 1,5 % en IgG contre 13,4 % avec les anticorps anti-gliadines natives IgA et 23,1 % en IgG. Prince [16] rapporte une sensibilité de 91 % des tests conventionnels contre 98 % pour les tests utilisant de la gliadine déamidée. Il précise également que sur 56 patients non cœliaques présentant des résultats faussement positifs avec la technique des gliadines natives, 96 % sont négatifs lors du dosage des anticorps anti-gliadines déamidées. Notre travail confirme sans équivoque une meilleure spécificité des trousses utilisant comme antigène de la gliadine déamidée. En effet, alors que 24 % de nos patients non cœliaques présentent des anticorps anti-gliadines natives IgA et 63 % en IgG, les trousses utilisant de la gliadine déamidée ne montrent plus des résultats faussement positifs en IgA que chez 21 % des patients pour la trousse Anti-Gliadin (GAF-3X) (Euroimmun), 7 % pour la trousse Bindazyme Human Anti-Gliadin (MGP) (The Binding Site) et aucun patient avec la trousse Celiac G+ (Immco). Une nette diminution des faux positifs est également observée en IgG : 24 % des patients seulement présentent encore des résultats positifs avec le kit Anti-Gliadin (GAF-3X) (Euroimmun), 26 % avec la trousse Bindazyme Human Anti-Gliadin (MGP) The Binding Site et 41 % avec le kit Celiac G+ (Immco). Les trousses utilisant comme source antigénique de la gliadine déamidée ont également démontré une meilleure sensibilité en comparaison à ceux basés sur la gliadine native. Nous avons pu observer parmi les patients souffrant de pathologie cœliaque provenant de notre routine quotidienne (résultats non montrés), des cas ne présentant pas d anticorps anti-gliadines natives IgA et/ou IgG mais pour lesquels des résultats positifs étaient observés avec toutes les trousses utilisant de la gliadine déamidée. Depuis peu, de nouvelles trousses ont été développées. Elles utilisent le complexe transglutaminase-gliadines déamidées comme source antigénique. Il s agit de trousses permettant à la fois le dosage du néo-épitope de ce complexe, le dosage des anticorps anti-ttg et celui des antigliadines déamidées. Reeves et al. [17] ont montré que de tels kits présentent une très bonne sensibilité (92,1 %), mais une spécificité n atteignant que 82,9 %. En tenant compte de la population étudiée, notre travail montre la très bonne spécificité de ce kit en IgA : 15 % des patients présentent un résultat supérieur à 12 U/mL en IgA, considéré comme équivoque et seuls 2 % montrent un résultat supérieur à 18 U/mL, considéré comme positif. Par contre, des résultats en IgG supérieurs à 12 et 18 U/mL sont retrouvés chez 50 et 30 % des patients respectivement. Les patients chez lesquels nous n avons pu mettre en évidence ni anticorps anti-ttg ni anticorps anti-gliadines déamidées pourraient donc être soit des patients présentant des anticorps anti-néo-épitopes, soit des faux positifs, ce qui correspondrait à nos patients non cœliaques pour lesquels une biopsie duodénale ne présente aucune anomalie histologique. Le test de screening présenté par la firme Inova se différencie de celui d Aesku Diagnostics par le fait qu aucune liaison entre les antigènes ttg et gliadines déamidées n est formée. Il s agit donc uniquement d un mélange d antigènes : ttg et gliadines déamidées. Notre étude a pu démontrer que lors de l utilisation de ce test de screening, tout résultat positif doit être suivi de la réalisation d Elisa permettant de mettre en évidence la présence d anticorps anti-gliadines déamidées et celle d anticorps anti-ttg. En effet, un certain nombre de faux positifs sont observés avec ce test. Plusieurs études, dont celle de Rashtak [18], montrent que, pour un diagnostic optimal de la maladie cœliaque, les anticorps dirigés contre la ttg IgA et contre la gliadine déamidée IgG devraient être recherchés en parallèle. Cette combinaison présente en effet trois avantages : confirmation des résultats positifs en anticorps anti-ttg IgA par un test spécifique, augmentation du taux de détection, certains patients ne développant pas d anticorps antittg et augmentation de la sensibilité de détection chez les patients déficients en IgA, les anticorps anti-ttg IgG présentant une plus faible sensibilité et surtout une médiocre spécificité [19]. Conclusion Cinquante ans après la découverte de Dicke montrant que le gluten est responsable des lésions digestives et de beaucoup de manifestations associées, l étendue des connaissances de la maladie cœliaque a largement progressé. L émergence de trousses Elisa basées sur la compréhension de la physiopathologie de cette maladie a permis des progrès considérables au cours des dernières années. La recherche des anticorps anti-gliadines natives a été discréditée par le manque de sensibilité et de spécificité des techniques. La mise au point de trousses basées sur la gliadine déamidée, qui présente une meilleure spécificité, offre de nouvelles perspectivesdanslediagnosticdelamaladie. Ann Biol Clin, vol. 68, n o 2, mars-avril 2010 155

Remerciements. Nous remercions les techniciennes du laboratoire d auto-immunité, Mesdames Pesser et Watrin, pour leur aide dans la réalisation des dosages ainsi que les sociétés Biorad et Imtec pour les réactifs fournis gracieusement. Références 1. Green PH, Cellier C. Celiac disease. N Engl J Med 2007 ; 357 : 1731-43. 2. SollidLM,MarkussenG,EkJ,GjerdeH,VartdalF,ThorsbyE. Evidence for a primary association of celiac disease to a particular HLA-DQ α/β heterodimer. JExpMed1989 ; 169 : 345-50. 3. van Heel DA, West J. Recent advances in coeliac disease. Gut 2006 ; 55 : 1037-46. 4. Dewar D, Pereira SP, Ciclitira PJ. The pathogenesis of coeliac disease. Int J Biochem Cell Biol 2004 ; 36 : 17-24. 5. Revised criteria for diagnosis of coeliac disease. Report of Working Group of European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition. Arch Dis Child 1990 ; 65 : 909-11. 6. Seah PP, Fry L, Rossiter MA, Hoffbrand AV, Holborow EJ. Antireticulin antibodies in childhood coeliac disease. Lancet 1971 ; 2 : 681-2. 7. Chorzelski TP, Sulej J, Tchorzewska H, Jablonska S, Beutner EH, Kumar V. IgA class endomysium antibodies in dermatitis herpetiformis and coeliac disease. Ann NY Acad Sci 1983 ; 420 : 325-34. 8. Dieterich W, Ehnis T, Bauer M, Donner P, Volta U, Riecken EO, et al. Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of celiac disease. Nat Med 1997 ; 3 : 797-801. 9. Carroccio A, Vitale G, Di Prima L, Chifari N, Napoli S, La Russa C, et al. Comparison of anti-transglutaminase ELISA and an antiendomysial antibody assay in the diagnosis of celiac disease : a prospective study. Clin Chem 2002 ; 48 : 1546-50. 10. Unsworth DJ, Manuel PD, Walker-Smith JA, Campbell CA, Johnson GD, Holborow EJ. New immunofluorescent blood test for gluten sensitivity. Arch Dis Child 1981 ; 56 : 864-8. 11. Aleanzi M, Demonte AM, Esper C, Garcialazo S, Waggener M. Celiac disease : antibody recognition against native and selectively deamidated gliadin peptides. Clin Chem 2001 ; 47 : 2023-8. 12. Schwertz E, Kahlenberg F, Sack U, Richter T, Stern M, Conrad K, et al. Serologic assay based on gliadin-related nonapeptides as a highly sensitive and specific diagnostic aid in celiac disease. Clin Chem 2004 ; 50 : 2370-5. 13. Skovbjerg H, Koch C, Anthonsen D, Sjöström H. Deamidation and cross-linking of gliadin peptides by transglutaminases and the relation to celiac disease. Biochim Biophys Acta 2004 ; 1690 : 220-30. 14. Fleckenstein B, Qiao SW, Larsen MR, Jung G, Roepstorff P, Sollid LM. Molecular characterization of covalent complexes between tissue transglutaminase and gliadin peptides. J Biol Chem 2004 ; 279 : 17607-16. 15. Volta U, Granito A, Fiorini E, Parisi C, Piscaglia M, Pappas G, et al. Usefulness of antibodies to deamidated gliadin peptides in celiac disease diagnosis and follow-up. Dig Dis Sci 2008 ; 53 : 1582-8. 16. Prince HE. Evaluation of the INOVA diagnostics enzyme-linked immunosorbent assay kits for measuring serum immunoglobulin G (IgG) and IgA to deamidated gliadin peptides. Clin Vaccine Immunol 2006 ; 13 : 150-1. 17. Reeves GE, Squance ML, Duggan AE, Murugasu RR, Wilson RJ, Wong RC, et al. Diagnostic accuracy of coeliac serological tests : a prospective study. Eur J Gastroenterol Hepatol 2006 ; 18 : 493-501. 18. Rashtak S, Ettore MW, Homburger HA, Murray JA. Combination testing for antibodies in the diagnosis of coeliac disease : comparison of multiplex immunoassay and ELISA methods. Aliment Pharmacol Ther 2008 ; 28 : 805-13. 19. Villalta D, Alessio MG, Tampoia M, Tonutti E, Brusca I, Bagnasco M, et al. Testing for IgG class antibodies in celiac disease patients with selective IgA deficiency. A comparison of the diagnostic accuracy of 9 IgG anti-tissue transglutaminase, 1 IgG anti-gliadin and 1 IgG anti-deaminated gliadin peptide antibody assays. Clin Chim Acta 2007 ; 382 : 95-9. 156 Ann Biol Clin, vol. 68, n o 2, mars-avril 2010