AB7-INDUSTRIES. Protocole d utilisation de l olfactomètre. Introduction... 1 Description des protocoles... 1

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1 AB7-INDUSTRIES Protocole de test DR 540 CONFIDENTIEL Date de création : 03/03/2010 Rédacteur : Xavier MARTINI Date de la 1 er modification : Rédacteur : Protocole d utilisation de l olfactomètre Introduction... 1 Description des protocoles... 1 Introduction... 1 L olfactomètre... 2 Matériel nécessaire... 2 Procédure... 2 Analyse des résultats... 3 Textes à insérer dans les rapports...3 Introduction Le test en olfactomètre vise à étudier l effet répulsif d un produit ou d un mélange, sur mouches, blattes ou puces. Son adaptation pour d autres insectes peut être envisagé. Par ailleurs il est important de rappeler que : - Il permet de tester uniquement des composés volatiles (pas d effet de contact) - Il ne permet pas d effectuer des études de doses limites - Il permet par contre d effectuer une évaluation quantitative de l efficacité d un produit par l établissement d un indice d efficacité facilement calculable. Description des protocoles Introduction L olfactomètre a été fabriqué à partir de la publication de Vet et al.(1983) 1. Toutefois quelques modifications y ont été apportées : - Les témoins sont constitué uniquement d un flacon d eau et non pas d un flacon d eau relié à un flacon vide. - L effet répulsif est étudié en ne comparant les temps moyen de résidence dans chaque zone («témoins» ou «produits») et non pas en comptabilisant le nombre d insectes piégés dans chaque zone. 1 Vet, L.E.M; Van Lanteren J.C.V; Heymans, M; Meelis, E. (1983) An airflow olfactometer for measuring olfactory response. Physiological Entomology. 8: Faccoli, M., Anfora, G. & Tasin, M. (2008) Responses of the Mediterranean pine shoot beetle Tomicus destruens (Wollaston) to pine shoot and bark volatiles. Journal of Chemical Ecology, 34,

2 L olfactomètre Il est constitué de 3 plaques carrées de 27 cm de côté de plexiglas d 1 cm d épaisseur. Ces plaques on été découpées avec une scie sauteuse à AB7.Les trois plaques porte des trous pour faire passer les visses nécessaires au montage de l olfactomètre. La plaque du bas porte un trou supplémentaire en son centre pour y brancher le tuyau d aspiration, et quatre pieds réglables y ont été fixés. La plaque du milieu par contre a eu les coins découpés pour pouvoir y faire passer des tuyau ; et à été découper en son milieux en suivant le plan de la figure 1 1 cm 27 cm 7,5 cm Zone produit Zone Témoin Fig 1 : Schéma général de l olfactomètre utilisé pour les tests répulsifs. Matériel nécessaire - L olfactomètre - Un pompe - Au moins 6 flacons avec des bouchons à 3 trous. - Des filtres à air utilisé Merck eurolab de 45 µm Procédure On branche à chaque entrée de l olfactomètre les tuyaux reliés à des flacons, soit témoin (un seul flacon d eau distillé) soit «produit» (deux flacons, le premier avec de l eau distillé, le second contenant le produit à tester). Tous les flacons doivent avoir un tuyau de sorti qui doit être plongé dans le liquide (soit l eau soit le produit à tester). Au dessus de ces tuyaux de sortie on y pose un filtre à air afin de réguler l aspiration. On place les insectes dans l olfactomètre, et lorsque ceux-ci sont au centre la pompe est enclenchée. - A ce moment il faut bien vérifier qu il y a une aspiration dans tout les flacon. - Si rien ne se passe, vérifier qu il n y a pas de fuites.

3 - Si l aspiration est très inégale, il faut faire attention à ce que tous les tuyaux de sortie porte un filtre - Si la mouche ou la blatte ne bouge pas pendant les 2 premières minutes, il faudra en changer. - De même si pendant le test, une mouche reste plus de 2 minutes dans une même zone, il faudra également en changer. - L insecte doit visiter les deux types de zone au moins 3 fois pour être comptabilisé. Analyse des résultats Pour les blattes et mouches Il y a disposition un programme sur Excel (chronometre.xls) qui permet de suivre les déplacement des insectes dans les zones de l olfactomètre. L avantage est un gain de temps, et une meilleure précision. Le gros désavantage de ce programme est qu il ne garde pas en mémoire le temps respectif de chaque visite. Les résultats sont présentés sous forme d un tableau global. Donc si on veut calculer simplement la moyenne des temps passé dans chaque zone ce programme suffit. Par contre pour une analyse plus fine, une prise de note est nécessaire. Pour un test de screening il faut au minimum 6 individus. Si le temps le permet il est préférable de monter jusqu à 8 répétions ou plus. Ne pas dépasser 12 répétitions sauf si l étude est destinée à un dossier de validation par une autorité» indépendante ou pour une publication scientifique. On calcule donc le temps moyen passé par chaque individu dans les zones témoins et les zones produits. Pour évaluer l efficacité répulsive d un produit on peut calculer un indice : (TpsT - TpsP)/TpsT Avec TpsT le temps moyen passé dans les zones témoins, et TpsP le temps moyen passé dans les zones produits. Cet indice est donc borné entre -1 et 1. - Lorsqu il est inférieur à 0,25. On peut considérer qu il n y a pas eu d effet répulsif observable - Lorsqu il est compris entre 0,25 et 0,5 l effet répulsif est moyen - Entre 0,5 et 0,75 l effet répulsif est bon - Au dessus de 0,75 l effet répulsif est très bon On peut également comparer les résultats grâce à un test de Student pour donné liées, et obtenir une analyse statistique fiable, à condition d avoir fait au minimum 10 répétitions Pour les puces Le conditionnement des puces rend difficile leur manipulation. De ce fait il n est pas possible de contrôler le nombre de puces que l on placera dans l olfactomètre. Le tube de puce est entrouvert au dessus de l olfactomètre, légèrement secoué, et refermé rapidement. Là le nombre de puces vivantes est comptabilisé. A chaque minute on note le nombre de puces dans chaque zone. Pour traiter les données on peut soit comparer directement le nombre d observation dans les zones témoins et les zones «produits». Textes à insérer dans les rapports Pour Blatte et Mouche insérer le texte suivant dans le rapport (en Matériel et Méthode) :

4 Les études sont faites dans un olfactomètre à 4 entrées, mis au point par Vet et al.(1983). Ce type de dispositif a l avantage de ne pas créer de turbulences contrairement aux olfactomètres en T ou en Y. De plus l insecte peut entrer et ressortir des zones d odeur, ce qui n est pas possible avec les olfactomètres classiques. Ce test nous permet d évaluer strictement l effet répulsif d un produit, sans interférence avec une toxicité éventuelle. Cette distinction est importante dans le cadre de la directive européenne Biocide qui différencie les produits insecticides (PT18) des produits répulsifs (PT19).. Dans l olfactomètre, 4 chambres d odeur ont été créées, par une aspiration s effectuant au niveau d un trou au centre du sol. Chaque chambre est reliée à un ensemble de deux flacons en verre de 70 ml. L odeur provient du premier flacon qui est soit vide (Témoin) soit qui contient la substance ou le produit à étudier. Le flacon extérieur contient de l eau distillée. Il se créé ainsi un courant d air humide qui passera dans le flacon contenant le produit à étudier. En début d expérience l insecte est placé dans l olfactomètre (pendant le test nous utilisons de façon indifférenciée des individus mâles et femelles). Le chronomètre est enclenché une fois que l olfactomètre est fermé, et que l insecte est au milieu de l arène. On enregistre le nombre de passage dans chaque zone, et le temps passé. L analyse statistique se fera en comparant les temps moyen de résidence dans chaque zone. Si mouche ajouter : Le test s arrête quand la mouche est restée pendant au moins 5 minutes dans les zones, et qu elle est revenue au centre de l arène. L individu est exclu du test, si il n a pas visité au moins 3 fois une zone témoin ou une zone produit. Si blatte ajouter : Le test s arrête quand la blatte est restée pendant au moins 10 minutes dans les zones, et qu elle est revenue au centre de l arène. L individu est exclu du test, si il n a pas visité au moins 3 fois une zone témoin ou une zone produit. Pour les puces insérer le texte suivant dans le rapport (en Matériel et Méthode) : Les études sont faites dans un olfactomètre à 4 entrées, mis au point par Vet et al.(1983). Ce type de dispositif a l avantage de ne pas créer de turbulences contrairement aux olfactomètres en T ou en Y. De plus l insecte peut entrer et ressortir des zones d odeur, ce qui n est pas possible avec les olfactomètres classiques. Ce test nous permet d évaluer strictement l effet répulsif d un produit, sans interférence avec une toxicité éventuelle. Cette distinction est importante dans le cadre de la directive européenne Biocide qui différencie les produits insecticides (PT18) des produits répulsifs (PT19). Ce type de test constitue une originalité d AB7 industrie, car il s agit d un test permettant de tester l effet répulsif d un produit sur des puces, sans utiliser d animaux. Pendant le test nous utilisons de façon indifférenciée des individus mâles et femelles. Dans l olfactomètre, 4 chambres d odeur ont été créées, par une aspiration s effectuant au niveau d un trou au centre du sol. Chaque chambre est reliée à un ensemble de deux flacons en verre de 70 ml. L odeur provient du premier flacon qui est soit vide (Témoin) soit qui contient la substance ou le produit à étudier. Le flacon extérieur contient de l eau distillée. Ie l se créé ainsi un courant d air humide qui passera dans le flacon contenant le produit à étudier. Une feuille de papier filtre est posée sur le sol de l olfactomètre, avec des trous pour permettre l aspiration et le montage de l olfactomètre. Ce papier filtre va faciliter le déplacement des

5 puces dans l olfactomètre, car celles-ci glissent sur les parois en plexiglass. En début d expérience un tube contenant les puces est ouvert dans l olfactomètre, que l on referme rapidement. Un comptage est efféctué, et le nombre de puces vivantes est noté. Le chronomètre est enclenché et chaque minute, pendant 20 minutes on note combien de puces se trouvent dans chaque zone. L analyse des résultats se fait en comptabilisant le nombre de puces dans chaque zone pendant toute la durée du test.