Intérêt du séquençage à haut débit dans le génotypage des leucémies aigües myéloblastiques. O Nibourel; T. Boyer, M Figeac; C Villenet; S Quief; F Leprêtre; C Roumier; S Geffroy ; A Marceau; A Renneville ; P Peyrouze; M Cheok; C Preudhomme
Leucémie Aigue Myéloblastique Pathologie très hétérogène sur le plan moléculaire Nombreux gènes atteint de manière récurrente. NPM1, FLT3, CEBPa, IDH1, IDH2, TET2, AML1,. Recherche étendue des mutations: dépassement des capacités de séquençage par technique classique
Objectifs de l'étude Evaluation des techniques de séquençage à haut débit pour la détection de mutations acquises dans les LAM Evaluation de la méthode sur un ensemble de gènes préalablement étudiés par séquençage direct Validation des variations détectées sur les autres gènes.
Patients et méthode Patients 21 échantillons obtenus au diagnostic de patients atteints de LAM Méthode Gènes étudiés 43 gènes impliqués dans les leucémies aigues Constitution de la librairie par Capture Agilent SureSelect Séquençage: Solid 4 Détection des variations Bfast, Pileup et VarScan. Validation des variations chromosome chr1 chr2 chr4 chr5 chr6 chr7 chr8 chr9 chr11 chr12 chr13 chr15 chr16 chr17 chr19 chr20 chr21 chr22 chrx gènes JAK1, MPL, NRAS IDH1 FBXW7, KIT, PDGFRA, TET2 CSF1R, NPM1, PDGFRB DEK HIPK2, IKZF1 NOV, RUNX1T1 ABL1, CDKN2A, CDKN2B, JAK2, NOTCH1, NUP214, PAX5 CBL, MLL, WT1 ETV6, KRAS, PTPN11 FLT3, RB1 IDH2 MYH11 NF1, RARA, TP53 CDKN2D, CEBPA ASXL1 RUNX1 BCR GATA1 Sequençage direct
Patients et méthode Patients 21 échantillons obtenus au diagnostic de patients atteints de LAM Méthode Gènes étudiés 43 gènes impliqués dans les leucémies aigues Constitution de la librairie par Capture Agilent SureSelect Séquençage: Solid 4 Detection des variations Bfast, Pileup et VarScan. Validation des variations Sequençage direct
Séquençage à haut débit
Séquençage à haut débit
Résultats: couverture et profondeur de séquençage Profondeur de séquençage Nombre de lecture de chaque base Couverture Proportion d une région avec un nombre suffisant de lecture Profondeur Couverture
Résultats: couverture et profondeur de séquençage Profondeur de séquençage 80% des exons avec une profondeur moyenne supérieure à 500 Couverture 95% des exons avec une couverture >98% Profondeur et couverture du gène RUNX1
Résultats: gènes préalablement séquencés NPM FLT3 CEBPa IDH2 WT1 RUNX1 TET2 Gènes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Mutation NPM FLT3-TKD FLT3-ITD C-terminale P29R V218M N338Fs G355D P363L M1701I I1718L I1721W I1762V Mutation: R1354G 21 substitutions et 5 insertions/délétions distinctes Toutes retrouvées sauf 1 insertion dans gène Runx1 (A115LfsX3, 342_343insCTTG) 2 duplications de FLT3 non retrouvées Patients 1 et 2: insertion de 47 et 23 bp
Mutations Patient 14: FLT3 D835Y Patient 15 FLT3 D835H
Résultats: 36 gènes non séquencés au préalable Single nucléotide Polymorphism (SNP): 39 SNP distincts observés dans 16 gènes Base dbsnp 135 Absence d association avec des pathologies connues 162 évènements au total Nombre de patients par SNP 1 à 21 patients Gène SNP browser Position Nombre de Patients rs17127025 chr1 65303647 1 rs12129819 chr1 65303659 1 rs2230588 chr1 65310489 10 JAK1 rs3737139 chr1 65311214 2 rs2230587 chr1 65311262 4 rs17127063 chr1 65312342 2 rs2230586 chr1 65321250 2 PDGFRA rs10028020 chr4 55143577 3 rs7685117 chr4 55161391 21 KIT rs3822214 chr4 55593464 4 TET2 rs12498609 chr4 106155185 1 rs62623390 chr4 106196770 2 CSF1R rs34951517 chr5 149449827 2 PDGFRB rs114435947 chr5 149495360 2 RUNX1T1 rs34991280 chr8 93026810 1 NOV rs11538929 chr8 120431506 3 JAK2 rs113230874 chr9 5080291 18 rs41316003 chr9 5126343 1 ABL1 rs143837301 chr9 133759793 1 rs2296710 chr9 134021630 11 NUP214 rs61751471 chr9 134062733 2 rs61751472 chr9 134073807 2 rs149982504 chr9 134073894 3 rs61751489 chr9 139391338 1 rs61751539 chr9 139399256 1 NOTCH1 rs61751542 chr9 139400219 2 rs11574895 chr9 139405154 1 rs148331061 chr9 139410437 1 rs2229975 chr9 139413908 6 CBL rs2227987 chr11 119142514 1 rs34777499 chr11 119155732 1 PTPN11 rs79068130 chr12 112892407 16 rs112377790 chr16 15818225 1 MYH11 rs113154524 chr16 15820735 1 rs1050113 chr16 15839034 8 rs113363750 chr16 15931819 1 rs143594454 chr20 31022910 1 ASXL1 rs6058694 chr20 31022959 20 rs146141075 chr20 31024260 1
Résultats: 36 gènes non séquencés au préalable Single nucléotide variation (SNV) 20 SNV distincts observés dans 13 gènes Non rapportés dans la Base dbsnp 135 40 évènements au total Nombre de patients par SNV 1 à 7 patients Insertion/délétion 4 insertion délétions détectée Nombre Patients Chrom position Gène variation 1 chr1 115256530 NRAS G/T Q61K 1 chr4 55593458 KIT A/G I539V 1 chr5 149515174 PDGFRB C/T N103S 5 chr7 139281603 HIPK2 A/C W859C 1 chr8 93017517 RUNX1T1 A/C L189F 1 chr9 139395085 NOTCH1 A/G T2382T 1 chr9 139399941 NOTCH1 A/G N1469N 1 chr9 139405111 NOTCH1 A/G R913W 1 chr9 139413119 NOTCH1 A/G S341R 1 chr12 112888199 PTPN11 C/T A72V 1 chr12 112926848 PTPN11 A/G V490I 3 chr15 90631908 IDH2 A/G R149W 1 chr16 15802687 MYH11 A/G P1933L 1 chr17 7578263 TP53 A/G R196* 1 chr17 29663873 NF1 A/G H2123R 1 chr20 31023180 ASXL1 A/G A12T 7 chr22 23653916 BCR A/G R1072H 5 chr22 23653939 BCR C/T R1080C 3 chr22 23655107 BCR C/T M1119T 3 chr22 23655130 BCR A/T T1127S Nombre Patients Chrom Position Gène exon Indel 4 chr9 133760523 ABL1 11 */+C 19 chr9 134039481 NUP214 21 */-A 1 chr17 29703386 NF1 57 */-GTAGT 5 chr22 23653975 BCR 19 */+CCGG
Résultats: 36 gènes non séquencés au préalable Faux positif Ex: Variation R1072H du gène BCR GTGAGAGAGGTCCAAGGTGCCCTACATCGTGCACCAGTGCGTGGAGGAGA Idem pour ABL, BCR, PTPN11
Résultats: 36 gènes non séquencés au préalable Single nucléotide variation (SNV) 20 SNV distincts observés dans 13 gènes Non rapportés dans la Base dbsnp 135 40 évènements au total Nombre de patients par SNV 1 à 7 patients Insertion/délétion 4 insertion délétions détectée Nombre Patients Chrom position Gène variation 1 chr1 115256530 NRAS G/T Q61K 1 chr4 55593458 KIT A/G I539V 1 chr5 149515174 PDGFRB C/T N103S 5 chr7 139281603 HIPK2 A/C W859C 1 chr8 93017517 RUNX1T1 A/C L189F 1 chr9 139395085 NOTCH1 A/G T2382T 1 chr9 139399941 NOTCH1 A/G N1469N 1 chr9 139405111 NOTCH1 A/G R913W 1 chr9 139413119 NOTCH1 A/G S341R 1 chr12 112888199 PTPN11 C/T A72V 1 chr12 112926848 PTPN11 A/G V490I 3 chr15 90631908 IDH2 A/G R149W 1 chr16 15802687 MYH11 A/G P1933L 1 chr17 7578263 TP53 A/G R196* 1 chr17 29663873 NF1 A/G H2123R 1 chr20 31023180 ASXL1 A/G A12T 7 chr22 23653916 BCR A/G R1072H 5 chr22 23653939 BCR C/T R1080C 3 chr22 23655107 BCR C/T M1119T 3 chr22 23655130 BCR A/T T1127S Nombre Patients Chrom Position Gène exon Indel 4 chr9 133760523 ABL1 11 */+C 19 chr9 134039481 NUP214 21 */-A 1 chr17 29703386 NF1 57 */-GTAGT 5 chr22 23653975 BCR 19 */+CCGG
Résultats: 36 gènes non séquencés au préalable Single nucléotide variation (SNV) 20 SNV distincts observés dans 13 gènes Non rapportés dans la Base dbsnp 135 40 évènements au total Nombre de patients par SNV 1 à 7 patients Insertion/délétion 4 insertion délétions détectée Nombre Patients Chrom position Gène variation 1 chr1 115256530 NRAS G/T Q61K 1 chr4 55593458 KIT A/G I539V 1 chr5 149515174 PDGFRB C/T N103S 5 chr7 139281603 HIPK2 A/C W859C 1 chr8 93017517 RUNX1T1 A/C L189F 1 chr9 139395085 NOTCH1 A/G T2382T 1 chr9 139399941 NOTCH1 A/G N1469N 1 chr9 139405111 NOTCH1 A/G R913W 1 chr9 139413119 NOTCH1 A/G S341R 1 chr12 112888199 PTPN11 C/T A72V 1 chr12 112926848 PTPN11 A/G V490I 3 chr15 90631908 IDH2 A/G R149W 1 chr16 15802687 MYH11 A/G P1933L 1 chr17 7578263 TP53 A/G R196* 1 chr17 29663873 NF1 A/G H2123R 1 chr20 31023180 ASXL1 A/G A12T 7 chr22 23653916 BCR A/G R1072H 5 chr22 23653939 BCR C/T R1080C 3 chr22 23655107 BCR C/T M1119T 3 chr22 23655130 BCR A/T T1127S Nombre Patients Chrom Position Gène exon Indel 4 chr9 133760523 ABL1 11 */+C 19 chr9 134039481 NUP214 21 */-A 1 chr17 29703386 NF1 57 */-GTAGT 5 chr22 23653975 BCR 19 */+CCGG
Mutations Patient 16: NRAS Q61K Caryotype: 46,XX,inv(16)(p13;q22)[3] 46,XX,inv(16)(p13;q22),del7(q32;q36)[17]
Mutations Patient 19: PTPN11 A72V
Mutations Patient 7: Caryotype: 43,X,-Y,add(5)(q?15), +13,der(14;15)(q10;q10), -16,-17,-18, -21,+22,+mar1 [12]
Résultats: 36 gènes non séquencés au préalable Single nucléotide variation (SNV) 20 SNV distincts observés dans 13 gènes Non rapportés dans la Base dbsnp 135 40 évènements au total Nombre de patients par SNV 1 à 7 patients Insertion/délétion 4 insertion délétions détectée Nombre Patients Chrom position Gène variation 1 chr1 115256530 NRAS G/T Q61K 1 chr4 55593458 KIT A/G I539V 1 chr5 149515174 PDGFRB C/T N103S 5 chr7 139281603 HIPK2 A/C W859C 1 chr8 93017517 RUNX1T1 A/C L189F 1 chr9 139395085 NOTCH1 A/G T2382T 1 chr9 139399941 NOTCH1 A/G N1469N 1 chr9 139405111 NOTCH1 A/G R913W 1 chr9 139413119 NOTCH1 A/G S341R 1 chr12 112888199 PTPN11 C/T A72V 1 chr12 112926848 PTPN11 A/G V490I 3 chr15 90631908 IDH2 A/G R149W 1 chr16 15802687 MYH11 A/G P1933L 1 chr17 7578263 TP53 A/G R196* 1 chr17 29663873 NF1 A/G H2123R 1 chr20 31023180 ASXL1 A/G A12T 7 chr22 23653916 BCR A/G R1072H 5 chr22 23653939 BCR C/T R1080C 3 chr22 23655107 BCR C/T M1119T 3 chr22 23655130 BCR A/T T1127S Nombre Patients Chrom Position Gène exon Indel 4 chr9 133760523 ABL1 11 */+C 19 chr9 134039481 NUP214 21 */-A 1 chr17 29703386 NF1 57 */-GTAGT 5 chr22 23653975 BCR 19 */+CCGG
SNV Patient 12: KIT I1539V Caryotype: 46,XX,t(3;17)(p13;p13),inv(16)(p13q22)[7] 46,XX,t(3;17)(p13;p13),inv(16)(p13q22)[7] / 46,XX[1]
SNV Patient 12: KIT I1539V Caryotype: 46,XX,t(3;17)(p13;p13),inv(16)(p13q22)[7] 46,XX,t(3;17)(p13;p13),inv(16)(p13q22)[7] / 46,XX[1]
SNV Patient 10: RUNX1T1 (ETO): L189F Caryotype: 46-49,XX,r(21),+(0-3)mar[20cell]
SNV Patient 20: NF1: H2123R Caryotype: 45,XX,-7,del(12)(p11p12),t(17;18)(q24;,q11)[20]
SNV Patient 20: NF1: H2123R Caryotype: 45,XX,-7,del(12)(p11p12),t(17;18)(q24;,q11)[20]
Résultats Parmi les 21 patients: 9 variations Identifiées chez 8 patients 6 mutations sans signification clinique claires 3 mutations déjà rapportées TP53, PTPN11, RAS 3patients distincts: Pas de mutation des gènes préalablement séquencé mutation chez les 3 patients Gènes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 NPM FLT3-TKD FLT3-ITD CEBPa IDH2 WT1 RUNX1 TET2 NRAS PTPN11 KIT TP53 RUNX1T1 NF1 PDGFRB MYH11 ASXL1
Conclusion Obtention d une profondeur et couverture de séquençage permettant l analyse des 43 gènes simultanément Concordance entre le séquençage à haut débit et le séquençage classique sur 96% des mutations préalablement détectées Détection d une mutation avec une signification clinique déjà rapportée chez 3 des 21 patients Le séquençage à haut débit pourrait faciliter un screening étendu des mutations au moment du diagnostic des patients atteints de LAM
Perspectives Augmentation du nombre de gènes Optimisation de la spécificité du séquençage évolution des techniques permettant d obtenir des séquences plus longues Constitution des librairies par des approches plus ciblées: PCR multiplex
Remerciements CHRU Lille T. Boyer R. Dulery C Roumier S Geffroy A Marceau A Renneville C Preudhomme IRCL, Plateforme Génomique M Figeac C Villenet S Quief F Leprêtre C Roumier P Peyrouze M Cheok