Lignée germinale et gamétogenèse

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1 Lignée germinale et gamétogenèse I) Introduction 1) Sexualité et reproduction On va étudier les cellules germinales et la gamétogenèse, mais on n'abordera pas les aspects de sexualité, à savoir la différenciation des organes de la sexualité. La reproduction sexuée s'oppose à la reproduction asexuée, que l'on retrouve notamment chez les bactéries, et au cours de laquelle on a formation de clones ou de paquets de cellules restant associées ou non pour créer un nouvel organisme. A l'opposé, la reproduction sexuée fait intervenir des facteurs particuliers, appelés gamètes, et le gamète mâle vient toujours féconder le gamète femelle. Deux partenaires sont la plupart du temps nécessaires, et le nouvel organisme sera issu de la fusion de 2 cellules. Chez les organismes même les plus simples, on peut retrouver des individus femelles dits F - et des individus mâles dits HFR. Chez les bactéries, la souche HFR injecte un épisome dans le cytoplasme de la souche F -, et par un phénomène de recombinaison, on a inclusion de cet épisome dans le génome femelle. Ce n'est pas le processus normal de la reproduction des bactéries, mais cela apporte une grande variabilité. A partir de là, on peut donner une 1 e ébauche de la définition de la reproduction, à savoir la formation de cellules capables de recombiner leur génome. 1

2 Par rapport à la "re-production" asexuée, la reproduction sexuée présente un grand avantage : il peut arriver qu'une bactérie subisse une mutation favorable, puis produise des clones incluant cette mutation. Si 2 bactéries ont 2 mutations favorables différentes, alors dans la majorité des cas on ne pourra jamais avoir association de ces 2 mutations. La reproduction sexuée favorise le transfert d'une mutation favorable vers un autre organisme, et elle pourra alors s'additionner ou contre-balancer une autre mutation déjà présente dans l'individu receveur. La capacité de déployer des mutations et de recombiner le génome est donc un phénomène essentiel. 2) Sexualité et méiose Ce phénomène central de la reproduction sexuée est basé sur une division cellulaire particulière appelée méiose : cela permet la formation de 2 cellules haploïdes qui pourront alors combiner leur génome pour donner un zygote diploïde. La méiose est une étape où des recombinaisons vont pouvoir s'établir, et notamment au stade diplotène. En effet, c'est lors de cette phase que l'on a formation de structures particulières sur les bivalents, les chiasma, ce qui favorise les crossing-over : à chaque fois que l'on a formation d'un gamète, les phénomènes de recombinaison assurent la formation d'un génome plus ou moins original. La loterie de la division méiotique permet en fait d'obtenir des organismes qui ont toutes les chances d'être différents de leurs parents. A jouté à la ségrégation mendélienne, on aura donc une très grande variabilité dans la formation de nouveaux individus : cela permet également la transmission de mutations favorables. Le processus de méiose se solde aussi par des erreurs : on peut avoir des accidents comme la trisomie (les bivalents 21 ne se séparent pas), les translocations (des morceaux entiers de chromosomes sont délétés ou déplacés) : même si la méiose présente un grand intérêt évolutif, cela mène à un certain nombre d'anomalies chromosomiques. Au stade pachytène, les bivalents s'alignent pour former des complexes synaptonémaux : c'est une étape nécessaire pour que la méiose se fasse, mais dans u nombre restreint d'espèce, elle n'est pas nécessaire. C'est en fait un appariement base à base des 2 chromosomes homologues : si on a 2 génomes différents (de 2 espèces différentes par exemple), alors dans la mesure où la fécondation est possible, on a formation d'organisme qui ne pourront jamais réaliser la méiose, et qui sont donc stériles. Cela permet d'éviter les mélanges entre les espèces, mais il existe des cas où la méiose peut quand même se faire 2

3 3) Sexualité et système reproducteur On a vu que la reproduction sexuée s'accompagne du transfert du génome mâle vers le génome femelle, puis d'un phénomène de conjugaison. Pour en arriver là, plusieurs étapes sont nécessaires et elles vont différencier selon les organismes : en effet, les phases diploïdes et haploïdes vont durer plus ou moins longtemps, et auront des longueurs similaires ou non. La formation des cellules haploïdes va dépendre le plus souvent d'un organe en particulier, alors que le reste de l'organisme restera toujours diploïde. Les cellules qui se divisent par méiose descendent de lignées cellulaires particulières, appelées cellules germinales primordiales : elles apparaissent dans des zones particulières de l'organisme lors de l'embryogenèse, mais leur zone de différenciation sera différente de leur zone d'apparition. On va essayer de comprendre ce qui différencie les précurseurs de la lignées germinale des précurseurs dits somatiques, qui organisent l'ensemble de l'organisme qui va se reproduire. De manière très précoce, on apparition des gonocytes primordiaux qui restent cependant en nombre restreint. Ces cellules vont ensuite migrer vers des organes en cours de développement, qui formeront les futures ovaires et testicules : à ce stade les gonocytes primordiaux forment une population particulière de cellules mais pas un tissu. Selon l'organe d'arrivée (mêle ou femelle), ces cellules germinales deviendront des gamètes mâles ou femelles, avec chacun des spécificités. Une fois dans l'organe définitif, les gonocytes vont commencer à proliférer : on aboutit à la formation d'un très grand nombre d'ovogonies ou de spermatogonies. Cependant, on assiste également à de très nombreux phénomènes de dégénération, mais un très grand nombre de cellules restent tout de même en activité. 3

4 A l'issu du processus de différenciation, on va obtenir des ovules et des spermatozoïdes qui sont radicalement différents : chez l'homme, on a une anisogamie car les 2 gamètes ont une apparence très différente, et on parle également de gonochorie car on a séparation des sexes. Lors de la gamétogenèse, on peut retrouver un phénomène de récapitulation comme dans l'organogenèse : au départ, les cellules germinales mâles et femelles apparaissent au même endroit et ne sont que très peu différenciées. On assiste ensuite à une migration des 2 types de gamètes, et au sein d'un même organisme, on peut alors avoir une différenciation des 2 types de gamètes. On a ensuite eu séparation des 2 sexes : cette étape a nécessité des adaptations beaucoup plus complexes. En effet, le gonochorisme nécessite le transfert de l'un des 2 gamètes dans un autre organisme, et pour cela on a du mettre en place tous les organes et les tubulures nécessaires (mais les gonades ont déjà été différenciées lors de l'étape précédente). Le véritable problème de l sexualité est la rencontre des gamètes : 2 partenaires de sexe différent sont toujours nécessaires. Le gamète mâle est une cellule mobile, de petit taille et avec u cytoplasme dense, et il va essayer de rejoindre le gamète femelle de grande taille et immobile. Chez les hommes, la phase de croissance et d'accumulation des réserves dans le gamète femelle est assez faible mais chez les poules, l'ovule peut atteindre 5 cm de diamètre! A l'issu de cela, on voit donc que l'on a un grand partage des tâches entre les 2 gamètes. Les manifestations extérieures du sexe sont importantes puisque cela permet de différencier les individus et d'assurer une fécondation correcte. La recherche du partenaire coûte cher énergétiquement : ainsi les organismes hermaphrodites sont assez économes, mais la loterie de la reproduction n'est alors plus favorisée du tout. Si la reproduction hermaphrodite est la règle, alors rapidement on va observer un déclin de la population : c'est en fait un phénomène qui assure la survie d'une lignée en cas de conditions défavorables du milieu, mais la reproduction croisée reste possible et obligatoire pour la pérennité de l'espèce. Il existe de très nombreuses modalités de la sexualité : on a vu que l'hermaphrodisme est le plus simple mais il mène à une moins grande variabilité. On distingue également la reproduction croisée, qui assure de très bonnes adaptations au milieu. On a enfin la reproduction parthénogénétique (chez les abeilles par exemple): l'activation du gamète femelle ne nécessite pas l'entrée du gamète mâle et une femelle seule sera capable d'engendrer u certain nombre d'autres individus. La reproduction sexuée a donc un intérêt évident mais elle coûte cher pour la mise en place des organes, des cellules D'un autre côté, elle assure une adaptation rapide des organismes, et cela compense le plus souvent le coût élevé. Les adaptations permettant la multiplication de l'espèce seront ensuite très variables 4

5 II) Les cellules germinales et leur saga 1) Introduction Les gamètes haploïdes sont produits dans des organes particuliers à partir de précurseurs primordiaux possédant des caractéristiques propres. Ce sont en général de grosses cellules qui contiennent dans leur cytoplasme des éléments typiques : des granules ribonucléoprotéiques, des mitochondries en grand nombre et des enzymes plus ou moins spécifiques (par exemple on trouve beaucoup de phosphatase alcaline, ce qui permet une coloration spécifique de ce type de cellule). Les cellules germinales apparaissent très tôt et on pense pour cela qu'elle appartiennent à un lignage particulier. Pendant les phases de la segmentation, elles se divisent assez peu, et ne forment ni épithélium ni tissu organisé. Elles vont ensuite migrer vers les crêtes génitales qui les attirent et qui formeront des organes somatiques. Là, les cellules germinales y subiront leur différenciation : à partir de cellules plus ou moins mésenchymateuses on va avoir formation d'une masse critique. Ce seront ensuite les seules cellules capables de subir la méiose et c'est d'ailleurs une de leurs caractéristiques principales. On ne sait pas encore pourquoi les cellules germinales subissent ce type de différenciation, mais on sait que l'environnement joue un rôle fondamental. Il existe tout de même une autre caractéristique : les gonocytes primordiaux sont immortels. En effet, pendant leur migration puis leur différenciation, elles ne subissent aucune mort par sénescence. Dans les cellules classiques, les séquences télomériques à l'extrémité des chromosomes est grignotée à chaque division cellulaire : dans le cas des cellules germinales, des télomérases corrigent cette suppression de bases et cela permet de compenser les pertes. Cela confère donc aux gonocytes une certaine immortalité, mais ce n'est pas spécifique à ce type cellulaire : on pourra retrouver des télomérases dans certaines cellules embryonnaires et dans certaines lignées de cellules cancéreuses. Cependant, à la différence de ces dernières, les gonocytes sont capables de s'engager dans une voie de différenciation 2) La ségrégation soma/germen La différence entre lignée germinale et lignée somatique est visible assez rapidement au cours de l'embryogenèse, et pour cela, certains chercheurs, dont Weissman et Nussbaum, ont essayé de prouver que ces 2 types de cellules étaient radicalement différentes. Pour eux, les cellules germinales sont l'essence de notre espèce, alors que les cellules somatiques ne permettent la formation que d'un "récipient" dans lequel pourront se développer les cellules germinales. Dans cette vue attachée fortement à la religion, l'organisme ne sert que de réceptacle protecteur aux gamètes, qui assurent la fonction essentielle de l'organisme, à savoir la reproduction. Selon eux, la lignée germinale est déterminée dès la cellule œuf, et elle est représentée par le noyau (appelé alors plasme germinal): cela signifie que les informations contenues dans les noyaux des cellules germinales ou somatiques sont complètement différentes Il existe chez certains organismes comme les Nématodes, des éléments qui tendent à confirmer cette hypothèse. Chez ces individus, la 1 e division mitotique qui suit l'amphimixie donne 2 cellules dont l'une donnera la lignée germinale, l'autre la lignée somatique. 5

6 Chez la souris, les blastomères de la morula sont peu cohésifs et forment une structure particulière. Si on isole l'une de ces cellule, alors on peut la cultiver et réimplanter une des cellules fille dans une nouvelle morula (expérience de Millman) : selon la zone d'insertion, cette cellule fera partie soit du trophectoderme, soit du bouton embryonnaire. Cela signifie que jusqu'au stade morula les cellules sont capables de donner à la fois des cellules somatiques et des cellules germinales : elles ont toutes la même potentialité. Seule leur position dans l'embryon déterminera leur destinée, et la différenciation des cellules germinales sera tout à fait conforme à toute différenciation cellulaire. Dans les processus de clonage, on prélève un noyau somatique et on peut tout à fait obtenir un organisme viable contenant donc une lignée germinale (expérience de Briggs et King) : cela signifie donc que la séparation entre soma et germen est une vue de l'esprit, mais on est quand même obligé de constater que la lignée germinale est la 1 e que l'on peut caractériser. C'est simplement une différenciation comme les autres, avec ses modalités particulières. Selon les espèces, la lignée germinale n'apparaît pas au même moment : elle commence à se différencier vers 7,5 jours chez la souris, cad au moment de la gastrulation. En réalité, selon le phylum évolutif de l'espèce concernée, mais aussi la proportion entre héritage maternel et interactions cellulaires dans l'embryogenèse, la différenciation de la lignée germinale surviendra plus ou moins tôt. 3) Plasme germinal et déterminants germinaux. a) Importance du plasme germinal Chez Parascaris equorum, le zygote diploïde va subir des phases de segmentation : la position des globules polaires permet de définir le pôle animal et la 1 e division se fait de manière équatoriale par rapport à l'axe animal/végétatif. On obtient alors une cellule animal un peu plus grande que la cellule végétative. Boveri a réalisé une étude sur la segmentation de ce zygote particulier : en effet, on remarque la cellule S 1 animale va subir une dégradation de ses chromosomes (= diminution chromosomique), que l'on peut matérialiser par des marquages. La cellule S 1 ainsi que tous ses descendants auront donc un génome altéré. La cellule P 1 végétative se divise de manière perpendiculaire à l'axe animal/végétatif : la cellule qui se retrouve au pôle le plus animal, appelée S 2, va là encore subir une diminution chromosomique, ainsi que toute la lignée qui en est issue. La cellule P 2 du pôle végétatif va de nouveau se diviser en donnant une cellule normal et une cellule "diminuée Finalement, les lignées issues des cellules P 1, P 2 ont un génome entier alors que les lignées issues des cellules S 1, S 2 auront un génome altéré. Or, ce sont les cellules de la lignées P qui sont à l'origine des gonocytes primordiaux, car seules ces cellules permettent la transmission d'un génome normal. Cet exemple a donc été très utilisée pour étayer les hypothèses de Weissman et Nussbaum, mais Boveri s'est demandé pourquoi ce phénomène de réduction chromosomique avait lieu, et surtout pourquoi il n'atteignait pas les cellules P. On place un œuf de Nématode dans une centrifugeuse afin de réorganiser le cytoplasme : on peut par exemple réorienter le fuseau mitotique, et les 2 cellules issues de la 1 e division héritent donc d'un morceau de pôle animal et d'un morceau de pôle végétatif. On se rend alors compte qu'aucune de ces 2 cellules ne subit une réduction chromosomique, mais si on laisse les divisions se faire 6

7 normalement ensuite, alors on va de nouveau avoir formation de cellules au génome réduit si elles sont au pôle animal Finalement, ce n'est pas le noyau mais le cytoplasme qui régit le devenir des cellules, et c'est donc des éléments présents dans le cytoplasme qui caractériseront la lignée germinale. Cette modification du génome existe chez peu d'organismes, et on peut retrouver dans quelques autres types cellulaires des Mammifères des phénomènes de réorganisations du génome : délétions (l'extrême étant représenté par les globules rouges qui n'ont plus de noyau), recombinaisons (dans les cellules immunitaires surtout), polyténisations Cela reste donc des cas très particuliers, et la seule différence que l'on pourra faire entre lignée germinale et lignée somatique se portera sur le contenu du cytoplasme : le plasme germinal de Weissman et Nussbaum n'est donc pas le noyau mais le cytoplasme. Chez un moucheron, particulier (Wachtiella), on peut également retrouver ce phénomène de réduction chromosomique. Le développement embryonnaire est tout à fait comparable à celui de la drosophile : on a formation d'un syncytium avec dans sa partie postérieure un cytoplasme un peu particulier, appelé plasme polaire : il contient des granules ribonucléoprotéiques et un grand nombre de mitochondries. Les noyaux du syncytium vont alors migrer vers la périphérie, et certains se retrouvent au hasard dans le plasme polaire : ils sont alors protégés de la réduction chromosomique qui atteint tous les autres noyaux. Un certain nombre d'expériences ont mis en évidence que c'est bien le cytoplasme qui protège les noyaux, et que ce cytoplasme particulier est nécessaire à la formation de la lignée germinale. En effet, si on réalise une ligature pour isoler le plasme polaire, aucun des noyaux ne pourra y migrer : on constate alors qu'ils vont tous subir la réduction chromosomique, et que l'on n'obtiendra pas de lignée germinale Chez la drosophile, la réduction chromosomique n'existe pas, mais on retrouve un plasme postérieur dans lequel migrent un certain nombre de noyaux. On a montré que ce qui détermine la lignée germinale n'est pas la position des noyaux dans le syncytium mais la nature du cytoplasme 7

8 dont ils héritent. En effet, on prend des noyaux qui devraient se positionner dans le plasme polaire et on les place dans la partie antérieure : ces noyaux seront à l'origine de cellules somatiques, ce qui prouve bien que là encore c'est le cytoplasme qui est nécessaire (expérience à regarder complexe). Chez les Amphibiens, on peut retrouver le même genre de phénomène car il existe chez tous les organisme un cytoplasme particulier par sa composition Dans la partie végétative de l'embryon, on retrouve ainsi un cytoplasme avec les mêmes caractéristiques que celles vues précédemment (granules et mitochondries). Ce sera à partir des cellules héritant de ce cytoplasme que l'on aura développement de la lignée germinale. On prélève les cellules de la zone végétative qui auraient dû former les cellules germinales : la grenouille que l'on obtient alors par développement de l'embryon modifié est stérile. Si on injecte les cellules prélevées dans un autre embryon, alors on constate que les cellules de la lignée germinale de l'adulte ainsi obtenu auront 2 origines différentes de la même manière, si on irradie au stade blastula les cellules du pôle végétatif, alors on obtient des adultes stériles. Finalement, on retrouve bien chez les Amphibiens des cellules se divisant peu, contenant un cytoplasme particulier, et à l'origine de la lignée germinale 8

9 b) Formation du plasme germinal On a vu que l'on a apparition de cellules au contenu cytoplasmique particulier, et on va essayer de comprendre ce qui déclenche la formation de ce plasme germinal. Chez la drosophile, les axes sont déterminés dès la cellule œuf, mais c'est la fécondation qui permet de les matérialiser : on a trouve ainsi un plasme postérieur dans l'ovocyte et il est essentiel à la formation des gonocytes primordiaux. Ces derniers vont subir un certain nombre de mitose, puis plus tardivement, elles subiront 4 mitoses successives et incomplètes menant à la formation de l'ovocyte. Le cytoplasme postérieur de l'ovocyte devient petit à petit différent du reste : il accumule des granules ribonucléoprotéiques et devient à la fois plus foncé et plus hétérogène que le reste. C'est la dynamique microtubulaire qui assure cette différenciation car les éléments formant les granules migrent sur les microtubules grâce à la dynéine ou à la kinésine. On retrouve au niveau du pôle postérieur de l'ovocyte un MTOC, donc on aura toujours un migration vers le pôle (-). La 1 e molécule essentielle est le messager oskar : il est transcrit dan les cellules nourricières et s'accroche sur les protéines motrices pour être transporter jusqu'au pôle postérieur de l'ovocyte. Une fois cette migration terminée, oskar va s'ancrer dans le cytosquelette d'actine via la protéine vasa. C'est ainsi que vont se créer les granules, et on a ajout progressif de nouveaux messagers maternels (Valois, Tudor ) toujours par le même système. De nouvelles vagues de molécules vont arriver depuis les cellules nourricières jusqu'au pôle postérieur de l'ovocyte, et la dernière vague correspond au déversement du cytoplasme des cellules nourricières dans l'ovocyte. On a donc arrivée des messagers nanos et germ-cell less (gcl) qui vont s'ancrer dans les granules, s'ajoutant à tous les autres facteurs. Oskar est essentiel à l'initiation de la formation de ces granules, mais ces derniers sont formés par l'accumulation de très nombreuses molécules. Après la fécondation et la multiplication nucléaire, un certain nombre de noyaux vont gagner ce plasme. Si on irradie la partie postérieure d'un embryon, alors les drosophiles obtenues seront stériles : l'irradiation interfère en réalité avec la structure des ARNm accumulés dans les granules, et en particulier celle de gcl. Si on réinjecte dans la partie postérieure d'un embryon irradié un messager gcl, alors on peut observer la formation de quelques 9

10 cellules germinales : c'est donc que cet ARNm est essentiel à la différenciation de la lignée. Cependant, il n'intervient pas seul car la restauration n'est que partielle, et c'est tout un contexte qui est nécessaire à la formation de la lignée germinale. Dans les granules, on retrouve non seulement des ARNm, mais aussi beaucoup de mitochondries, et c'est vrai chez beaucoup d'espèces. Elles sont capables de synthétiser des ARN ribosomaux de grande taille, que l'on appelle mtlrrna : ils sont toujours associés à la formation des cellules germinales. En effet, si on irradie la partie postérieure d'un embryon et qu'on ajoute des mtlrrna, alors on peut voir apparaître des cellules polaires mais elles ne formeront jamais de cellules germinales, puisqu'il manque gcl. Par contre, si on injecte à la fois ces ARNr et l'arnm de gcl, alors on obtient des cellules germinales, et cela signifie finalement que ce sont tous 2 des éléments nécessaires soit à la ségrégation des cellules soit à leur différenciation. On a pu montrer que les ARNr s'associent avec l'un des 2 centrosomes lors de la division cellulaire, et cela provoque une division asymétrique. Seule la cellule héritant des ARNr, et donc issue du centrosome modifié deviendra une cellule germinale, si elle contient les déterminants nécessaires. On se retrouve dans la problématique de toute différenciation cellulaire, puisqu'elles s'accompagnent toutes d'une division asymétrique, mais ici on aurait trouvé l'une des causes de cette asymétrie Chez les Amphibiens, on retrouve des prémices du plasme germinal dans les cellules du pôle végétatif, et elles ségrègent de manière asymétrique pendant la segmentation. Ce sont des cellules qui se multiplient assez peu par rapport aux autres, et dans tous les cas on a une division asymétrique. Cela permet de conserver un nombre fixe et assez faible de cellules germinales. Pendant l'ovogenèse des Amphibiens, un certain nombre d'arnm ainsi que des mitochondries sont stockés dans la partie végétative, dans la partie animale ou bien de manière aléatoire et donc symétrique. On retrouve par exemple des équivalents de vasa On pense que la détermination des cellules germinales des Amphibiens est très proche de la mécanistique de celle des drosophiles. Une fois dans les gonades, les divisions deviendront complètement symétriques, mais les cellules seront déjà déterminées dans leur lignée. On ne connaît pas encore les facteurs qui assurent la différenciation des cellules germinales, ni pourquoi on a apparition de ces cellules à un moment donné. 4) La migration des cellules germinales Les mécanismes de migration qui vont amener les cellules germinales jusqu'aux gonades sont plus ou moins divers. Chez la drosophile, on sait que l'embryogenèse est le siège de l'invagination d'un sillon dorsal, formant ainsi la bandelette germinative. Cette dernière va s'étaler postérieurement puis dorsalement, et les cellules polaires sont donc entraînées dans ce mouvement. Or, cet étalement 10

11 s'accompagne de l'invagination proctodéale, et les cellules polaires se retrouvent alors dans cette invagination. Les cellules polaires sont associées à l'intestin postérieur, mais avant la différenciation de ce dernier, elles vont migrer à travers la paroi de l'intestin pour gagner les futures gonades. On a donc une étape passive pendant la migration de la bandelette germinative, puis active. Pour que la migration soit possible et surtout efficace, les crêtes génitales sécrètent des substances chimiotactiques. Les mécanismes morphogénétiques lors de la gastrulation chez les embryons de toutes les espèces favorisent très souvent le rapprochement des cellules germinales et des gonades, sauf chez les Oiseaux, où les précurseurs devront emprunter la voie sanguine pour gagner les organes appropriés. Chez les Amphibiens, les cellules germinales apparaissent dans la partie végétative de l'embryon, et restent en petit nombre dans la future paroi du tube digestif. Au moment de la gastrulation, les cellules qui se trouvent dans le plancher de l'intestin vont s'engager dans un processus de migration vers les gonades, mais en même temps elles recommencent à se diviser. La migration se fait à travers le mésentère, et les cellules germinales gagnent ainsi les crêtes génitales qui sont en train de se creuser de chaque côté, et se divisent un peu plus. La migration a été active : on peut observer des émissions de filopodes et de lamellipodes qui, en présence d'une matrice extracellulaire riche en intégrine notamment, permettent le déplacement. 11

12 Chez les Oiseaux, on a apparition dans l'embryon d'un croissant germinal au niveau du mésoderme extra-embryonnaire (où on retrouve une splanchnopleure et une somatopleure). De plus, on a formation d'îlots sanguins sur la splanchnopleure, qui sont à l'origine des vaisseaux et des cellules sanguines, constitués par des hémangioblastes. On a donc une grande proximité entre les îlots et le croissant germinal : pour cela, les vaisseaux en formation vont progressivement englober les cellules germinales, qui se dirigent alors vers l'embryon via la circulation. Une fois dans la circulation, les cellules germinales vont passer la barrière embryonnaire et elles vont finir par passer au niveau des crêtes génitales : on a alors déclenchement du mécanisme de diapédèse qui permet la sortie de ces cellules (même chose quand elles y sont entrées). Là encore les cellules germinales ont été attirées par les substances chimiotactiques (adressines) sécrétées par les gonades, ce qui assure une migration orientée et la pénétration directe dans le gonades. On peut comparer ce phénomène à celui qui se déroule pour les lymphocytes, attirés sur le site inflammatoire. Chez les Mammifères (souris notamment), les cellules germinales apparaissent tardivement et elles sont au nombre de 20 à 40. L'apparition est tardive car on n'a aucun héritage maternel. Cependant, les cellules germinales sont capables de synthétiser des molécules semblables à celles que l'on trouve dans le plasme germinale des autres animaux, et ce grâce à des phénomènes d'induction. 12

13 Les 1 e cellules germinales apparaissent au moment de la gastrulation (7 jours), et elles se situent à la limite de l'ectoderme extra-embryonnaire et de l'épiblaste embryonnaire, et donc à proximité du mésoblaste (à chaque fois le devenir des cellules germinales semble lié à l'intestin ). Ces cellules sont déterminées dans la voie génitale car elles ont reçu des signaux adéquats. En effet, l'endoblaste envoie des signaux de la famille des BMP vers l'épiblaste, et ce dernier répond par la différenciation d'une partie de ses cellules en cellules germinales. Ce phénomène est permis par des voies de signalisation de type phosphorylation, qui aboutissent à l'expression de gènes permettant l'accumulation de substances comparables à celles de la drosophile. Quand l'allantoïde se forme, les cellules germinales se rassemblent, et via le cordon ombilical, elles migrent vers les crêtes génitales en passant par le TD puis le mésentère. Cette migration est facilitée par des mouvements morphogénétiques et par libération de substances chimiotactiques, mais ce mécanisme reste quand même actif. Les 1 e cellules qui s'engagent dans la migration sont les plus proches des gonades : lors de leur déplacement, elles vont laisser derrière elles des expansions cytoplasmiques. On a donc formation d'un véritable fil d'ariane qui servira de guide pour les suivantes : de très nombreux éléments interviennent donc pour rendre cette migration des gonocytes la plus fiable possible. Lors de la migration, les cellules germinales commencent à se diviser de manière symétrique : leur nombre va donc augmenter considérablement. Une fois dans les gonades, la prolifération devient alors beaucoup plus importante, et on peut obtenir jusqu'à plusieurs millions de cellules Ce nombre sera cependant modifié par des phénomènes d'apoptose, ce qui provoque la destruction d'une plus ou moins grande partie des cellules ainsi obtenues : la perte s'élève à 70% pour les spermatogonies et à 30% pour les ovogonies (mais on aura de nouvelles pertes lors de la différenciation folliculaire par la phénomène d'atrésie). On n'observe part contre jamais de mort par sénescence et l'ajustement du stock se fera donc par la seule apoptose (et ce processus est valable aussi pour de très nombreux organes). 5) Aspects généraux de la gamétogenèse. La gamétogenèse suit des modalités différentes selon que l'on se trouve chez le mâle ou chez la femelle : si dans les 2 cas on a un processus de différenciation, il est continu dans le cas de la spermatogenèse et discontinu dans le cas de l'ovogenèse. De plus, on peut obtenir un très grand nombre de spermatozoïdes par multiplication tardive des spermatogonies, alors que les ovogonies sont stockées dans l'ovules et sont bloquées en méiose (donc elles ne peuvent pas se multiplier). La différenciation de ces cellules va également se faire à des moments différents : avant la méiose pour les ovogonies, pendant et après pour les spermatogonies. Cependant, dans les 2 cas, on a une régulation assez fine de ces processus grâce à l'axe hypothalamo-hypophysaire qui sécrète différentes hormones comme le LH et le FSH. De plus, les cellules cibles de ces hormones sont dans les 2 cas des cellules somatiques très semblables, mais on les trouve soit dans les testicules soit dans les ovaires. 13

14 III) La spermatogenèse 1) Description des testicules La différenciation des cellules germinales primordiales va débuter quand elle auront atteint une gonade mâle (testicule en formation). Les testicules ont un développement complexe, et leur organisation est très particulière. C'est un organe pair constitué par des lobules séparés entre eux par des septa testis et dans chaque lobule on retrouve les tube séminifères condensés et contournés dont la quantité et la densité sont très importante. La spermatogenèse se fera justement dans la paroi de ces tubes séminifères, et le reste de l'organe sera responsable de la régulation de ce processus. Les testicules sont entourés par la tunique albuginée, qui joue un rôle de protection physique, et ils sont coiffés par la tête de l'épididyme où sont stockés et modifiés les spermatozoïdes. A l'abri dans l'albuginée, on retrouve en fait un organe à la fois endocrine et exocrine : en effet, les cellules 14

15 de Leydig situées dans le tissu conjonctif ont un rôle sécréteur alors que les tubes séminifères permettent l'expulsion des gamètes mâles. Le processus de la spermatogenèse est centripète : les spermatogonies se retrouvent en effet à la périphérie du tue, alors que les spermatozoïdes sont libérés dans lumière du tube, après un passage entre les cellules de Sertoli. Ils vont alors circuler dans la lumière des tubes jusqu'à la rete testis, où ils sont relargués dans l'épididyme. Là, ils vont subir des modifications biochimiques de leur membrane afin que la fécondation devienne possible. Chez les Amphibiens, l'organisation du testicule est différente : on retrouve bien des lobules, que l'on appelle ici cystes, mais vu les modalités de la reproduction, les cellules germinales ne sont pas disposées de la même manière. En effet, à chaque cyste correspond une phase précise de la spermatogenèse, car cela permet la sortie en masse des spermatozoïde lors de la saison favorable. L'organisation des testicules peut varier légèrement d'une espèce à l'autre, mais ce sera surtout la taille et la proportion par rapport au reste de l'individu qui seront variables. Ainsi, ramenés à une échelle humaine, les testicules d'un rat serait 15 fois plus grosses que celles d'un homme 2) Cinétique de la spermatogenèse Chez l'homme, la spermatogenèse dure 74 jours mais chacune des étapes ne dure pas un temps équivalent. On sait que les spermatogonies se sont fortement multipliées pendant l'embryogenèse, puis ont subi d'importants processus apoptotiques : on a donc un nombre assez faible de spermatogonies dans les testicules matures. Tout au long de la vie, ces cellules vont subir des divisions asymétriques qui permettent de conserver un nombre fixe de spermatogonies souche, et de créer en même temps des spermatogonies de type B qui pourront suivre la voie de la spermatogenèse. 15

16 Les cellules qui s'engagent dans la différenciation subissent des mitoses avec une cytodiérèse imparfaite : la cohorte de cellule va ainsi rester liée, et ce jusqu'à la méiose. La régulation de la spermatogenèse se fera donc sur un groupe de cellules issues d'une même cellule souche : on conserve donc une grande synchronisation. Les spermatogonies vont rentrer tout d'abord dans la prophase de 1 e division méiotique : elles deviennent alors des spermatocytes de type I. On va avoir duplication de l'adn puis formation des bivalents où les complexes synaptonémaux se mettent en place (stade pachytène). Sur un certain nombre de chiasme on peut observer des crossing-over, ce qui permet d'augmenter le nombre de spermatozoïdes qui iront potentiellement féconder un gamète femelle. Dans le noyau de ce spermatocyte I, on peut observer une vésicule germinative : c'est une structure très dense et de nature hétérochromatique. On y trouve les 2 chromosomes sexuels X et Y qui sont donc à l'état condensé alors que tous les autres sont complètement étalés. Les bivalents peuvent s'associer, alors qu'on ne doit pas avoir possibilité de crossing-over entre les 2 chromosomes 16

17 sexuels : la meilleure solution a été la condensation dans une vésicule qui assure l'isolement. Ce phénomène ne se retrouve pas dans l'ovocyte puisqu'on trouve 2 chromosomes X. Les spermatocytes I ont une durée de vie de 23 jours : c'est le temps nécessaire à la phase préméiotique, afin que l'appariement des bivalents soit sans défauts. On va ensuite assister à la véritable méiose : la division réductionnelle crée des spermatocytes II dont la durée de vie ne dépasse pas une journée, puis la division équationnelle crée les spermatides, qui donneront ensuite les spermatozoïdes. Le processus de différenciation se fait pendant et après la méiose, et principalement sur les spermatides. On a au départ une cellule ronde avec un noyau assez volumineux et rond, et un nucléole bien marqué. Dans le cytoplasme, on retrouve des mitochondries en grand nombre, et notamment en périphérie. Au pôle opposé au flagelle en formation, on trouve l'idiosome : c'est une structure golgienne qui rassemble tous les systèmes golgiens de la cellules au pôle opposé au centrosome (à l'origine du fuseau mitotique dans la cellule mère). Dans l'idiosome, on a formation de vésicules qui se remplissent de molécules particulières : on a ainsi formation des granules acrosomiques. Pendant la phase suivante, les granules vont progressivement fusionner pour ne donner qu'une grosse vésicule qui vient alors se plaquer contre la paroi du noyau, dont l'organisation est d'ailleurs modifiée (les lamines se réorganisent). Cette grosse vésicule s'étend pour former une coiffe sur le pôle opposé au flagelle du noyau. Toutes ces enzymes permettront au spermatozoïde de féconder l'ovule : en effet, lors du contact, l'acrosome s'ouvre et les enzymes vont former une voie d'entrée du gamète mâle dans le gamète femelle. La coiffe se développe de plus en plus et finit par se différencier en acrosome, mais le noyau est alors repoussé vers un pôle de la cellule et subit des modifications très particulières. En réalité, la 17

18 cellule se polarise dans son ensemble : elle s'allonge, les mitochondries se rassemblent et le flagelle continue à se développer activement. Le cytoplasme de la spermatide va alors être condensé dans un corps résiduel qui sera éliminé. On aboutit ainsi au spermatozoïde classique où on distingue classiquement une tête avec le noyau et l'acrosome, un cou avec les mitochondries formant un fourreau autour de la naissance du flagelle et un flagelle. Les granules pro-acrosomiques correspondent à toute une batterie d'enzymes typiques : on retrouve ainsi des enzymes de la catégories de trypsines (= acrosine), des enzymes dégradant la matrice extracellulaires Le noyau du spermatozoïde va exprimer un certain nombre de gènes qui permet la synthèse de protéines spécifiques : elles vont assurer un niveau de condensation de la chromatine que seul le spermatozoïde peu atteindre. Cela mène à une structure quasi-cristalline et presque complètement déshydratée : toute activité transcriptionnelle devient alors impossible. Cet état est permis par le remplacement des histones classiques par des protéines type protamines qui assurent une "ultracondensation". E centrosome peut se diviser en 2 et l'un sera à l'origine du flagelle, qui s'entoure d'une gaine mitochondriale. On y trouve 9 doublets de microtubules (microtubule B à 10 protofilaments et microtubule A à 13 protofilaments) qui représente la partie motrice du flagelles. On a établissement de ponts entre les différents doublets ainsi que des protéines radiaires qui permettent l'interaction avec le doublet central. 18

19 En plus du bras de nexine, on retrouve des bras de dynéine sur chaque doublet, ce qui permet des interactions étroites entre les différents microtubules mais aussi leur mouvement relatif les uns par rapport aux autres (cf BGU10). Du fait que tous les éléments microtubulaires sont liés, on aura un mouvement plus ou moins ordonné du flagelle, ce qui assure le mouvement du spermatozoïde. Cependant, ce mouvement est peu efficace tant que le spermatozoïde n'est pas passé dans l'épididyme. Dans un coupe de tube séminifère, on peut voir des associations de différents stades de la différenciation : statistiquement, on va d'ailleurs pouvoir ranger ces coupes dans 6 catégories. A la base de la coupe on trouvera toujours des spermatogonies, puis on a 6 associations de stades différents 19

20 Le stade spermatocyte II est rarement observable puisque sa durée de vie n'excède pas 24h, mais pourtant il existe. Tous les 16 jours, une spermatogonie s'engage dans le processus de la spermatogenèse, et on dit donc que l'on a une onde spermatique tous les 16 jours. De plus, à chaque onde correspond une rotation de l'axe de différenciation, ce qui signifie qu'elles seront légèrement décalées entre elles. On comprend donc que l'on a globalement 6 possibilités d'association des différents stades de la spermatogenèse 3) Expression génique au cours de la spermatogenèse. Pendant la méiose et après, on va avoir des synthèses protéiques particulières aux spermatozoïdes. Cependant, la synthèse d'arnm se fait depuis les spermatogonies jusqu'aux spermatides puisque, après condensation de la chromatine, toute transcription est impossible. Le génome haploïde va donc s'exprimer pendant un bref moment, et cela peut poser problème si l'allèle transcrit est muté 20

21 Les messagers "histones" classiques se retrouvent dans la spermatogonie et la spermatide I, mais à partir de la spermatide II, ils sont remplacés et éliminés par les protamines. On va également avoir synthèse d'hormones, mais ce sont des isoformes qui s'expriment : cela signifie qu'une seule et même molécule existe sous plusieurs formes, chacune caractéristique d'une lignée cellulaire. On a également synthèse de protéines spécifiques dont les protamines On a donc toute une régulation de l'expression génique et chaque gène s'exprimera à différents moments de la spermatogenèse. On pourra observer des synthèses de protéines non spécifiques (donc les promoteurs ne sont pas tissus-spécifiques), de protéines non spécifiques mais dans une forme particulière, et de protéines spécifiques. De plus, on pourra avoir des expressions alternatives d'un même gène selon le promoteur utilisé, ainsi que des phénomènes d'épissage alternatif. Tout cela pendant les phases diploïde et le début de la phase haploïde. 4) Contrôle de la fonction testiculaire Les cellules de Sertoli forment des compartiments entre elles et c'est dans ces espaces que se déroulera la spermatogenèse. Il existe une véritable barrière au niveau de ces compartiments : en effet, on peut observer dans une zone particulière la formation de jonction étanches (occludines). Cela crée une barrière hémato-testiculaire qui peut cependant s'ouvrir pour laisser les cellules qui progressent dans leur différenciation : on a ainsi pu remarquer que seuls les spermatocytes préleptotène peuvent traverser cette barrière. Le compartiment "hémato" renferme donc des cellules où on a des divisions de type mitotique (duplication de l'adn) alors que le compartiment testiculaire renferme des cellules qui subissent une véritable division méiotique. Au fur et à mesure de leur développement, les spermatozoïdes vont donc être isolés du reste de l'organisme. 21

22 Il existe de très nombreuses relations entre les différents types cellulaires du testicule. On sait déjà que la spermatogenèse se déroule au milieu des cellules de Sertoli, donc on peut supposer que leur présence est essentielle. D'autre part, on sait qu'elle est régulée par l'axe hypothalamohypophysaire : la FSH sera capté par les cellules de Sertoli alors que le LH est perçu par les cellules de Leydig. FS et LH ont des récepteurs à 7 domaines transmembranaires, et donc associés à des protéines G : le complexe α-gtp activé permet l'activation de la production d'ampc via l'adénylate cyclase. Tout cela assure la synthèse et la sécrétion d'hormones androgènes qui seront exportées puis modifiées dans les cellules de Sertoli. Les signaux qui sont échangés au sein du testicule se font dans les 2 sens. La cellule de Leydig activée après réception de LH va utiliser le cholestérol pour synthétiser des hormones stéroïdes dont la testostérone. Cette hormone va être libérée dans le tube séminifère, puis captée par les cellules de Sertoli. Si ces dernières ont été activées par du SH, alors on a synthèse d'une aromatase qui va transformer la testostérone en de nombreuses molécules dont les oestrogènes et la dihydrotestostérone, qui pourront exercer un rétrocontrôle négatif sur les cellules de l'axe hypothalamo-hypophysaire. 22

23 Les cellules de Sertoli sont capables de synthétiser toute une batterie de molécules spécifiques ou non, dont des molécules de la famille des FGF et TGFβ : elles vont réguler à la fois l'aromatase (action intracellulaire) et la spermatogenèse (action extracellulaire). De plus, les spermatogonies qui prolifèrent et qui ont reçu des facteurs de la cellule de Sertoli vont libérer d'autres facteurs en direction des autres cellules testiculaires Finalement, on a de très nombreux échanges de molécules informatives entre les cellules de Sertoli, les cellules de Leydig, les cellules en cours de différenciation et même les cellules de l'axe hypothalamo-hypophysaire. On a vu que la testostérone pouvait être transformée en dihydrotestostérone : cette dernière va alors gagner la lumière du tube et accompagne ainsi les spermatozoïdes jusqu'à l'épididyme, où elle permettra la maturation des spermatozoïdes. Les cellules de Sertoli peuvent également synthétiser de l'hormone anti-mullérienne, qui assure la régression des canaux de Muller. Au niveau des tubes séminifères, on retrouve des cellules péritubulaires : elles sont plus ou moins musculeuses et assurent la contraction des tubes pour faciliter l'expulsion des spermatozoïdes. De plus, elles sont capables de synthétiser l'abp (androgen binding protein) qui est nécessaire pour que la spermatogenèse se fasse correctement. 23

24 IV) L'ovogenèse 1) Ovaires, follicules et contrôle hormonal de l'ovogenèse C'est la différenciation des gamètes femelles : elle est particulière puisque c'est un processus méiotique, mais le reste de la différenciation sera un processus tout à fait classique. La majeure partie de la différenciation va se faire pendant le stade diplotène, cad avant la méiose, et c'est une des différences majeures avec la spermatogenèse. De plus, l'ovogenèse est un processus discontinu : à partir des ovogonies, qui se divisent intensément dans les ovaires, on va obtenir un stock assez important de cellules. On va alors observer une phase d'accroissement en taille, qui sera très variable selon les espèces : on parle de cytodifférenciation, et elle se termine par un blocage des ovocytes. A partir de la puberté, les ovogonies vont rentrer dans un processus de maturation, qui revient en fait à la fin de la méiose (elles étaient bloquées au stade diplotène de la prophase de 1 e division méiotique). On va ensuite avoir libération d'ovocytes bloqués en métaphase de 2 e division méiotique, et seule la fécondation permettra de terminer le cycle. a) Evolution des follicules La différenciation de l'ovaire s'effectuer dans l'ovaire : chez les Mammifères, c'est un organe complexe qui se développe selon des modalités particulières. Les ovocytes s'organisent dans des follicules primordiaux : ils seront accompagnés par une structure somatique formant comme un cocon pendant toute leur différenciation. Après l'ovulation, cette structure est conservée dans l'ovaire : c'est le corps jaune, qui va sécréter de la progestérone pendant un certain temps. Les follicules partent d'un stade précoce de petite taille : on trouve alors une couronne de cellules dites de la granulosa entourant l'ovocyte. Ce dernier possède une membrane avec des microvillosités donc on a un contact très particulier entre l'ovocyte et ces cellules somatiques. Suite à une évolution complexe, on va arriver au follicule mature, appelé follicule de De Graaf, qui présente différentes couches cellulaires : - l'ovocyte diploïde bloqué en prophase de méiose, et qui forme une protrusion au niveau de la cavité antrale où on trouve des substances particulières. 24

25 - la granulosa en contact avec le cumulus oophorus qui constitue comme un épithélium - un tissu conjonctif séparé du reste par la membrane de Slavjanski : on y distingue la thèque interne et la thèque externe, fortement irriguée On voit donc à travers l'étude de toutes ces couches que l'on aura établissement d'interactions épithélio-mésenchymateuses, et l'accompagnement de l'ovocyte va assurer le bon déroulement de la phase d'accroissement (cytodifférenciation) et de maturation (méiose). b) Structure des ovaires Quand on observe la différenciation des cellules germinales, on peut généralement retrouver une certaine récapitulation : en effet chez les Mammifères, les ovogonies ne gagnent que secondairement les gonades qui, au cours de leur développement, montrent des structures de plus en plus complexes. Chez les Annélides, les cellules germinales sont produites par simple délamination de cellules dans la cavité cœlomique, et on peut voir dans certain cas une association de ces ovocytes avec des cellules germinales. Chez les Echinodermes, on peut distinguer un ovaire qui commence à se différencier Chez la Drosophile, les ovaires sont constitués par des grappes d'ovarioles où on trouve l'ovocyte associé à 15 cellules nourricières d'origine germinale (mais elles ne subissent pas la méiose). Chez les Amphibiens enfin, les ovaires renferment des ovocytes entourés par une couronne de cellules : globalement, ils ont la même structure que chez les Mammifères, mais en beaucoup moins complexe. De plus, la reproduction est saisonnière, et le nombre d'œufs pondus en même temps devra être très important : pour cela, les ovogonies se multiplient chaque années (à l'opposé des Mammifères). 25

26 c) Contrôle hormonal de l'ovogenèse La régulation de l'ovogenèse a été très étudiée, et elle est actuellement très bine connue : on a ainsi la pilule contraceptive comme meilleure preuve Ce processus se fait entièrement sous le contrôle de l'axe hypothalamo-hypophysaire : sous l'effet de facteurs relâchés de manière cyclique par l'hypothalamus (GnRH notamment), on va avoir sécrétion de LH et de FSH par l'hypophyse (ces noms ont été donnés suite à l'étude de l'ovogenèse, mais on retrouve exactement les mêmes hormones chez les mâles). Ces 2 hormones sont libérées dans la circulation sanguine et vont être reconnues par des récepteurs à 7 segments transmembranaires associés à des protéines G (donc on a stimulation des l'ampc et production de PK A activée). Les cellules de la granulosa vont posséder les récepteurs à FSH alors que les cellules de la thèque seront sensibles à la LH. 26

27 La réception de LH va permettre la synthèse d'hormones stéroïdes qui vont ensuite être véhiculées vers la granulosa. Cette dernière, si elle a été activée par la FSH, va alors modifier ces hormones et les transformer en oestrogènes, libérés ensuite dans le liquide antrique et dans la circulation générale (pour qu'un rétro-contrôle puisse se faire). Quand on n'a pas de liquide antrique, alors on a un signalisation directe entre la granulosa et l'ovocyte via des molécules comme les EGF. 2) Les principales phases de l'ovogenèse a) La division Les ovogonies vont subir des mitoses très intenses jusqu'au milieu de la phase fœtale : ces cellules sont considérées comme immortelles vis à vis de la sénescence (grâce aux télomérases). On peut ainsi arriver à un nombre considérable d'ovogonies, jusqu'à 7 millions, mais au cours de cette phase de division, on peut avoir des phases de prolifération et de phases d'apoptose, qui permettent de faire diminuer le nombre de cellules. Ces 2 types de phases auront une importante différente selon les espèces : chez l'homme, à la naissance, on ne trouvera plus que ovogonies b) La cytodifférenciation Caractéristiques générales Les ovogonies vont entrer dans un processus de méiose, mais vont rester bloqués en prophase de 1 e division méiotique. Cependant, un grand nombre de follicules vont s'engager dans voie de l'atrésie folliculaire : ainsi sur une cohorte de follicules, seul un pourra éventuellement s'engager dans la phase de maturation. Finalement, le nombre de follicules qui pourront entrer en méiose sera 27