Institute for Advanced Biosciences Plateforme de cytométrie en Flux

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1 Institute for Advanced Biosciences Plateforme de cytométrie en Flux Responsables Coordonnées Scientifique & Coordinateur P. Marche Tel : patrice.marche@univ-grenoble-alpes.fr Technique M. Pezet Bureau 114 Tel : /35 mylene.pezet@univ-grenoble-alpes.fr

2 1. Démarrage Préparation pour un tri aseptique Vérification des performances : CST Réglage du jet Réglage de la déflection des jets Réglage du «Drop Delay» Créer une expérience Les compensations automatiques Paramétrage du tri Nettoyage, exctinction Maintenance

3 Trois buses : 70µm analyse, 70µm tri, 100µm Trois configurations : - 70µ 70 psi (high) = buse 70 µm pression 70 psi - 85µ 37 psi (medium) = buse 70 µm pression 37 psi - 100µ 20 psi (low) = buse 100 µm pression 20 psi Démarrage Stérilisation Check performance Réglage du jet Détermination du Drop delay Fermeture et nettoyage Enregistrement des data Set up du tri Set up de l expérience 1) Démarrage Allumer le compresseur qui se trouve à l extérieur de la pièce Soulever le capot de façade Allumer l appareil (bouton vert) et vérifier que les lasers le sont également Allumer l évacuateur d aérosol (Buffalo) Bouton à l arrière. Vérifier sur le manomètre que la pression est autour de 1. Sinon appuyer sur Power bouton en façade. Allumer l informatique : Username : Administrator Password : donné lors de la formation Ouvrir le logiciel BD FACSDiva6 et attendre la connexion La fenêtre CST Mismatch apparait : cliquer sur «Use CST Settings» Vérifier en bas de la fenêtre Cytometer les niveaux des réservoirs de FACS Flow (sheath), Ethanol, Bleach, eau distillée et vider la poubelle si nécessaire. Cytometer Cleaning Mode Prime after tank refill (tout cocher) Enlever les bulles dans les réservoirs à l aide des purgeurs. Changer la buse si nécessaire. 2

4 2) Préparation pour un tri aseptique Long clean : p180 du manuel Prepare for aseptic sort : p187 du manuel Vérifier le niveau des liquides dans les réservoirs et que la poubelle est vide. Réduire la pression de la fluidique à 10 psi en allant dans Cytometer Sheath Pressure «By passer» le filtre à bulles en connectant les deux Sheath lines ensemble. Remettre la pression à la valeur d origine. Aller dans le menu Cytometer, sous-menu Cleaning mode, choisir Long clean with ethanol sans faire au préalable un Fluidic Startup A la fin du Long Clean with Ethanol, procéder à 2 Fluidics Shutdown consécutifs afin d éliminer toute trace d éthanol dans le circuit. Diminuer la pression à 10 psi puis reconnecter les deux Sheath lines au filtre à bulles. Remettre la pression à la valeur d origine. Pour finir réaliser un Fluidics Startup. Nettoyer à l Ethanol et rincer en suite à l eau stérile la buse, et l ensemble du bloc de tri. Il est possible de stériliser aussi les réservoirs plenum (p184) et la chambre d injection (p185). Pour les procédures, se référer au manuel. Démarrage du jet en appuyant sur Stream Vérifier que le jet est centré dans la poubelle, si non, repositionner correctement le bloc tri. 3

5 3) Vérification des performances: «Cytometer Setup and Tracking» 1 fois par semaine Changement de configuration Cytometer View configuration Choisir la configuration souhaité dans CST Fermer CST et revenir sur DIVA Pour changer la configuration du jet : Sort Sort precision 85 micron (par ex) Attention à partir de cette étape bien penser à refermer le capot des lasers et vérifier que le filtre optique FSC soit le 1.0 Check performance Cytometer CST Vérifier que la Cytometer configuration est la bonne sinon cliquer sur Select configuration, sélectionner la bonne, cliquer sur set configuration, une fenêtre d alerte apparaît cliquer sur OK, puis encore OK pour fermer la fenêtre configuration. Vérifier le Lot ID (lot de billes, écrit sur le tube). Mettre un tube avec μL de PBS + 1 goutte de billes CST (se conserve au maximum la journée à 4 C à l abri de la lumière). Pour lancer le check performance, cliquer sur Run puis sur OK A la fin du check performance, cliquer sur «View Report» et contrôler le rapport de contrôle qualité. A vérifier sur le rapport : 1) PMT ne soient pas > à 50 2) CV de FITC (blue), APC (rouge), Cascade blue (violet), DAPI (UV) pas >6% (Coefficient de variation des billes pour les PMT les plus énergétiques de chaque laser ne soit pas >6%) 3) les lasers delays ne doivent pas avoir doublé par rapport à ceux obtenus lors de la baseline Fermer CST et revenir sur DIVA Une fenêtre apparaît : Si le rapport du check performance est passed : cliquer sur Use CST settings. Si le rapport n est pas bon : cliquer sur Keep current settings et contacter un responsable. 4

6 4) Réglage du jet Attendre que la fluidique se stabilise et vérifier la stabilité du jet. Les paramètres d un bon jet sont (comme le jet de gauche) : un train de gouttes, une cassure (avec la drop 1) suivi de gouttes indépendantes avec un minimum de satellites rapides. Pour cela, en fonction de la pression du jet, régler la fréquence selon les valeurs du tableau ci-dessous et ne plus la modifier, puis obtenir le jet décrit précédemment en jouant sur l amplitude. Une fois le jet réglé, entrer les valeurs de la Drop1 et du Gap de la partie grisée dans les cases blanches. Cliquer sur Sweet Spot qui va permettre de conserver les caractéristiques du jet pendant le tri et qui va stopper le tri si ces caractéristiques varient. 5) Réglage de la déflection des jets View Sorting Pour le tri en tubes, enlever le splash shield (Cf p163) et installer le support de tubes souhaité. Mettre des tubes vides dedans. Ouvrir la porte du bloc de tri, mettre en route le voltage (attention à ne pas toucher les plaques de déflection et la buse quand le voltage est en route), enlever le tiroir de poubelle en cliquant sur 5

7 Waste Drawer et cliquer sur Test Sort. Vérifier que les jets tombent bien dans les tubes. Ajuster éventuellement leur trajectoire avec les curseurs de voltage. 6) Réglage du «Drop delay» Créer une expérience que vous appellerez «Drop Delay» Préparer un tube avec une goutte de billes BD Accudrop pour 0,5 ml de PBS et le loader, régler le nombre d événements autour de 1000 evts/sec selon la configuration. Diluer éventuellement 2x. Créer un Dot plot FSC SSC, sélectionner une fenêtre P1 là où il n y a pas de billes et avec un clic droit, faire Invert Gate pour créer une population Not P1 Ouvrir une fenêtre Sort Layout Sélectionner Not P1 dans le tube de gauche Cliquer sur Sort : une fenêtre apparaît afin de mettre en route le voltage et enlever le tiroir poubelle. Cliquer sur Cancel. Mettre en route Optical filter Régler la déflection pour que les billes soient dans le cadran de gauche Cliquer sur Autodelay puis Start run Réglage du jet pour le drop delay Après la détermination du drop delay, cliquer sur Exit et ne plus toucher cette valeur pour le jet paramétré. En cas de modification importante du jet refaire ce réglage. 6

8 7) Créer une expérience Ouvrir les différentes fenêtres de travail grâce à l onglet View Fenêtres de travail Cytometer : réglage des paramètres d analyse (PMT, threshold, compensation) Browser : tableau de bord pour gérer les expériences Inspector : montre les propriétés des objets sélectionnés Worksheet: feuilles de travail (globale ou simple) avec dot plots, histogrammes et statistiques + hiérarchies des populations Acquisition Controls : démarrage et arrêt de l acquisition et enregistrement des data Créer une expérience : Folder Experiment (l expérience est ouverte quand le livre est ouvert) Specimen Tube Dans Cytometer Parameters : supprimer les fluorochromes non utilisés. Régler les compensations automatiques, si nécessaire. Compensations automatiques Experiment Create compensation controls Confirmer les fluochromes sélectionnés pour lesquels vous voulez calculer les compensations Un specimen Compensation controls se crée dans le Browser avec un tube correspondant au tube non marqué et au tube simplement marqué pour chaque fluorochrome. Sélectionner la population cellulaire et régler les PMT de FFC, SSC et de chaque fluochrome en passant les tubes sans les enregistrer. (voir 4 pour le passage des tubes) 7

9 Ne plus modifier aucun paramètre. Passer le tube non marqué et enregistrer dans Unstained control Avec un clic droit sur la population cellulaire sélectionnée Apply in All Compensation Controls Next tube dans la fenêtre Acquisition controls permet de passer au tube suivant. Enregistrer les data pour chaque fluorochrome et ajuster la gate sur la population positive. Experiment Compensation setup Calculate compensation Soit enregistrer les compensations en cliquant sur Link & Save ou juste appliquer les compensations : Apply only Crée dans le Browser un Specimen, les compensations calculées seront directement appliquées (on peut les visualiser dans Cytometer Compensation) 8) Analyse et enregistrement des data Specimen Tube : le curseur à côté de chaque tube doit être vert afin de pouvoir avoir accès à l Acquisition Dashboard et à la feuille de travail correspondante. Réaliser votre feuille de travail (globale ou normale) avec Dot Plot, histogrammes et organiser la hiérarchie de populations en faisant les gates souhaitées (pour l élimination des doublets et autres). Choisir les paramètres d affichage et d enregistrement dans la fenêtre Acquisition Dashboard. Load pour charger un tube, l acquisition se lance automatiquement ensuite. Ajuster le nombre d événements (au max = Fréquence en Hertz /4) par sec en jouant sur le Flow rate ( max 4-5). Record Data pour enregistrer les données. Dans le menu Cytometer, choisir l agitation et la température de l échantillon avec Sample agitation et Sample Temperature. 8

10 9) Paramétrage du tri Tri en plaque : curseur 1 Tri en tubes : 1 tube : curseur 2 2 tubes : curseurs 2 et 3 4 tubes : de gauche à droite curseurs 1 à 4 Tri en tube Installer le support de tube adéquat (2 x 5 ml, 4x 5 ml ou 2x 15 ml). Installer le ou les tubes vides et ajuster le voltage du curseur correspondant pour que le jet soit centré dans le tube. Tri en plaque Faire sortir le support de plaque. Installer une plaque avec couvercle. Depuis le menu «Sort» cliquer sur «Home device», sélectionner le type de plaque et faire un test sort pour vérifier la position du jet. Ajuster la déflection du (des) jet (s) en modifiant le voltage des différentes voies à l aide des curseurs. Allumer le Buffalo avec l interrupteur situé derrière et vérifier qu il soit au minimun : 20%. Ouvrir la fenêtre Sort Layout en cliquant sur l onglet qui ressemble à une plaque bleue dans le Browser ou en allant dans le menu Sort et en cliquant sur New sort layout. Choisir le mode de précision de votre tri (Yield, Purity ou autres). Sélectionner la ou les populations à trier en faisant un clic droit sur la fenêtre correspondant au tube choisi (sachant que le tri est meilleur dans tube gauche puis tube droit, puis extrême gauche puis extrême droit) et cliquer sur Add. Vous pouvez sélectionner plusieurs populations à trier dans un même tube. Cliquer sur Sort puis sur OK pour mettre en route le voltage et enlever le tiroir poubelle. A la fin du tri, augmenter l aspiration du Buffalo jusqu à 100% pendant 30 secondes, puis redescendre à 20% et ouvrir pour récupérer votre plaque. 9

11 10) Nettoyage, exctinction Prévoir 3 tubes avec - 3ml FACS Clean, - 3mL FACS Rinse - 3ml d eau distillée Passer successivement chaque tube comme un échantillon pendant 5 à 10 minutes en augmentant progressivement le Flow Rate jusqu à 10. Vérifier que les lavages ont été efficaces (minimum d évènements détectés), sinon prolonger. Arrêter le jet, puis depuis le menu «Cytometer» puis «Cleaning Mode» faire 3 fois «Clean Flow Cell» avec le Clean puis répéter avec le Rinse. Procéder au Fluidic Shutdown. A la fin de la procédure, un message apparaît : Installer à la place du tube demandé un tube d éthanol 70 et faire ok. Faire de même au message suivant. Quitter le logiciel BD FACSDiva6, fermer la station informatique, éteindre le FACS Aria en appuyant sur le bouton principal ainsi que le compresseur et le Buffalo. Afin d éviter les dépôts de sel, nettoyer à l eau stérile : l intérieur du bloc tri, la buse et les plaques. REMPLIR LE CAHIER D UTILISATION 11) Maintenance Sonication de la buse Accéder à la buse en tournant le levier vers la droite d un quart de tour. Tirer sur la buse avec un mouvement circulaire vers le haut pour abaisser l avant de la buse et ainsi éviter de laisser le micro joint dans la chambre d analyse. Si le joint est resté dans la chambre d analyse, le récupérer au moyen d un petit cône de pipette. Enlever le joint de la buse avec un cône et le conserver. Mettre la buse dans un bécher rempli d eau stérile. Soniquer la buse pendant une trentaine de secondes. Sécher la buse et remettre le joint en place. Verrouiller la buse au moyen du petit levier en le remettant en position verticale. 10

12 Nettoyage au Contrad Permet un nettoyage efficace de la chambre, recommander surtout si un Check performance ne fonctionne pas, mais à ne pas renouveler tous les jours. Faire 5 Clean Flow Cell au Contrad 15% (dilué dans l eau distillée Contrad stocké dans Falcon 50mL, armoire vitrée). Après 1h30, rallumer le jet pendant quelques minutes puis l éteindre. Faire 4 à 5 Clean flow Cell avec de l eau distillée. Remettre le jet pendant environ 10 min puis l éteindre. Enlever la buse + le levier, les nettoyer avec de l eau distillée et les sécher. Nettoyer également leur emplacement à l eau distillée afin d éviter les dépôts de Contrad. Et la remettre. Nettoyage au Contrad sur la nuit En fin de journée, procéder au Fluidic shut down (voir 5. Fermeture) Faire 5 Clean Flow Cell au Contrad 15% (dilué dans l eau distillée) Fermer Diva, éteindre l ordinateur, l Aria et le compresseur. Laisser le Contrad agir toute la nuit. Le lendemain matin, rallumer le compresseur, ensuite l Aria et l ordinateur. Lancer BD FACSDiva6. Enlever la buse + le levier, les nettoyer avec de l eau distillée et les sécher. Nettoyer également leur emplacement à l eau distillée afin d éviter les dépôts de Contrad. Et la remettre. Procéder à une Fluidic Shutdown puis à un Fluidic Startup afin de rincer la chambre. 11