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1 1 CHAPITRE N 1 : LA MUCOVISIDOSE Correction du TP mucoviscidose 1) Les phénotypes de la mucoviscidose a) Phénotype macroscopique La mucoviscidose affecte trois fonctions : - respiratoire : accumulation d un mucus visqueux qui piège les bactéries provoquant des infections qui détruisent les poumons ; - digestive : obstruction des canaux pancréatiques empêchant la libération des enzymes digestives dans l intestin ; - reproductive : infertilité due à l obstruction des canaux déférents chez l homme. b) Phénotype cellulaire

2 2 Organisation de l épithélium pulmonaire

3 htm Présence d un mucus visqueux qui encombre : les voies respiratoires : difficultés respiratoires et infections à répétition, à l origine de la destruction progressive du tissu pulmonaire ; le canal pancréatique, ce qui provoque les troubles digestifs des malades ; les canaux déférents, provoquant l infertilité des hommes atteints Mucus visqueux Coupe de bronche normale (en bas) et avec mucoviscidose (en haut)

4 4 c) Phénotype moléculaire Organisation membranaire d une cellule épithéliale La protéine CFTR (1480 acides aminés) est un canal chlore situé au pôle apical des cellules épithéliales. Cette protéine contrôle les flux d'entrée et de sortie des ions chlorures dans les cellules.

5 5 Position de l'acide aminé 508 (en jaune) dans le modèle de la protéine CFTR

6 6 Représentation simplifiée du modèle de la structure de la protéine CFTR. En haut, à droite, représentation agrandie de l environnement de la phénylalanine F508 (en violet) La protéine CFTR a perdu un acide aminé : la phénylalanine, en position 508. Cette délétion affecte la séquence ou structure primaire de la chaine peptidique, ce qui a des répercussions sur la structure tridimensionnelle de la protéine et donc sa fonction. Cette protéine se situe dans la membrane cytoplasmique externe des cellules de divers épithéliums : l épithélium pulmonaire, l épithélium du canal pancréatique, l épithélium des canaux déférents. La protéine forme un canal ionique qui assure une sortie d ions Cl- vers le milieu extracellulaire, accompagnée d une sortie d eau. En surface des divers épithéliums cités, on trouve un mucus, mélange de molécules de nature glucidique et d eau. La teneur en eau élevée de ce mucus lui confère une fluidité importante. L altération de la protéine interdit le passage des ions Cl- et d eau, ceci entraînant alors une augmentation de la viscosité des mucus en particulier des poumons et de l appareil digestif. Localisation de la CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) dans un épithélium respiratoire normal (N) à gauche et mucoviscidosique avec mutation F508 à l'état homozygote (ΔF508/508) à droite. 1% seulement des protéines CFTR se situent sur la membrane externe de l épithélium : La CFTR n assure plus sa fonction de fluidifier le mucus.

7 7 2) Plusieurs mutations du gène CFTR dont ΔF508 Exercice : Analyse de l arbre généalogique d une famille atteint par la mucoviscidose Déterminer le mode de transmission de la mucoviscidose (autosomale/gonosomale, dominante/récessive) et le risque pour les couples I1 et I2, III3 et III4 d avoir un enfant malade. La femme IV3 rencontre un homme non atteint par la maladie. Sachant que la probabilité d être hétérozygote dans la population est de 1/20 chance, calculer le risque pour le couple d avoir un enfant atteint. Arbre généalogique d une famille atteinte par la mucoviscidose Remarque : 1 individu a 1 chance sur 20 d être hétérozygote

8 8 - maladie récessive : parents I1 et I2 normaux (porteurs sains) + 2 enfants atteints - maladie autosomique (portée par des autosomes et non par les chromosomes sexuels) car filles et garçons atteints et si portée par X, II8 aurait hérité d un allèle malade du père et de la mère, or le père n est pas atteint. - Probabilité de transmettre l allèle : I1 et I2, III3 et III4 : porteurs sains tous les 4 car frères et sœurs atteints donc les 2 parents ont transmis un allèle muté. Gamètes mère I1 50% N 50% m (N//N) Sain 1/4 (N//m) Porteur sain (N//m) Porteur sain (m//m) Malade 1/4 Gamètes père I2 50% N 50% m Echiquier de croisement des gamètes des parents I1 et I2 Si les 2 parents sont porteurs sains, l enfant a ¼ chance d être malade. - La fille IV3 a ½ chance de transmettre l allèle m. Son mari a 1/20 chance d être hétérozygote + ½ chance de transmettre l allèle m. Le risque pour le couple d avoir un enfant malade est de : 1/2 x 1/20 x 1/2 = 1/80 Localisation chromosomioque du gène CFTR : bras long du chromosome 7 - Longueur du gène CFTR : 4443 nucléotides

9 9 Allèles normal et ΔF508 du gène CFTR et conséquences sur la protéine CFTR D après - Mutation = Délétion de 3 nucléotides CTT en position 1521, 1522, ) Traitements - Drainage bronchique, médicaments mucolytiques et bronchodilatateurs, antibiotiques pour l'atteinte respiratoire, extraits pancréatiques, vitamines et suppléments caloriques pour les troubles digestifs et nutritionnels - Kinésithérapie respiratoire : 2 fois/jour, pour éliminer l excès de mucus - Oxygénothérapie : air enrichi en O2 par masque ou canule nasale - Hygiène de vie stricte : sans tabac, contact avec allergènes ; + activité physique - Greffe de poumon (cas extrêmes) - Thérapie génique (à l essai) Lire doc.2 et 3 p

10 10 La thérapie consiste à apporter l'allèle normal aux cellules des bronches. Pour cela, il faut un "moyen de transport" appelé vecteur, généralement un adénovirus (virus à ADN), dont la virulence a été désactivée. Les premiers essais cliniques français (1994) ont montré que cette thérapie génique est réalisable et sans danger. L'essai portait sur six patients ayant une atteinte pulmonaire modérée, qui ont reçu une dose unique d'adénovirus porteurs de l'allèle CFTR normal. Le virus choisi, responsable de rhumes, est rendu inoffensif par élimination d'une partie de son génome. Actuellement les résultats portant sur 26 essais cliniques restent encore modestes, en effet l'effet thérapeutique est limité et non durable. Le gène est intégré dans seulement 3 à 5 % des cellules, et on observe la protéine CFTR normale dans certaines cellules pendant environ 14 jours. L'administration doit être régulièrement répétée car l'épithélium bronchique se renouvelle assez rapidement. Ainsi les cellules corrigées meurent et de nouvelles administrations sont nécessaires pour corriger les nouvelles cellules. Ainsi, pour le moment la thérapie génique n'est pas le "remède miracle", mais, dans les années à venir, elle trouvera sûrement une place dans le traitement des patients.

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12 12 PRINCIPE DE LA THERAPIE GENIQUE DE LA MUCOVISCIDOSE Depuis la découverte du gène CFTR en 1989, la thérapie génique est apparue comme une stratégie thérapeutique intéressante pour combattre la mucoviscidose. Cette thérapie a pour objectif de remplacer le gène CFTR défectueux par un gène sain et de rétablir ainsi la fonction normale de celui-ci. Les expériences menées in vitro ont démontré dès 1990 que l'injection de l'adn codant la protéine CFTR normale dans les cellules malades de l'épithélium pulmonaire corrigeait les anomalies. Cependant, la thérapie génique de la mucoviscidose ne peut être envisagée que dans une optique in vivo car les zones touchées sont trop étendues. Vectorisation L'ADN du gène humain CFTR est le matériel génétique utilisé pour la thérapie génique de la mucoviscidose. Pour parvenir jusqu aux cellules à traiter, le gène médicament doit être transporté par un vecteur qui est soit d origine virale (par exemple un adénovirus (1)), soit synthétique (liposome). Le vecteur est ensuite administré dans les voies aériennes des patients par aérosol. Ce vecteur entrera en contact avec les cellules à corriger (2), libérera dans la cellule le gène médicament (3) ; celui-ci ira se localiser dans le noyau cellulaire (4) et produira la protéine CFTR (5) qui sera transportée à la surface de la cellule (6) où elle fonctionnera comme un canal chlore. Les adénovirus : Ils ont la particularité, une fois leur génome modifié avec le gène humain, de pouvoir être produits en grosse quantité. Mais ils ont plusieurs inconvénients : - une fois insérés dans le noyau cellulaire, les transgènes n agissent que de façon provisoire, - les cellules génétiquement modifiées par les adénovirus sont la cible du système immunitaire qui les reconnaît en gènes étrangers et tente de les éliminer. Les premiers essais cliniques français (1994) ont montré que cette thérapie génique est réalisable et sans danger. L'essai portait sur six patients ayant une atteinte pulmonaire modérée, qui ont reçu une dose unique d'adénovirus porteurs de l'allèle CFTR normal. Le virus choisi, responsable de rhumes, est rendu inoffensif par élimination d'une partie de son génome.actuellement les résultats portant sur 26 essais cliniques restent encore modestes, en effet l'effet thérapeutique est limité et non durable. Le gène est intégré dans seulement 3 à 5 % des cellules, et on observe la protéine CFTR normale dans certaines cellules pendant environ 14 jours. L'administration doit être régulièrement répétée car l'épithélium bronchique se renouvelle assez rapidement. Ainsi les cellules corrigées meurent et de nouvelles administrations sont nécessaires pour corriger les nouvelles cellules. Pour le moment la thérapie génique n'est pas le "remède miracle", mais, dans les années à venir, elle trouvera sûrement une place dans le traitement des patients. Les espoirs : Dans le cas de la mucoviscidose, deux thérapies semblent intéressantes : - La première appelée SmaRT (Spliceosome-mediated RNA trans-splicing) garde les mêmes problèmes que les autres en terme de transfert car elle nécessite également un vecteur. Cependant, elle est une avancée car elle permettrait de réguler l'expression du gène. En effet, toutes les autres thérapies géniques insèrent le gène médicament n'importe où dans le matériel génétique des cellules cibles. Ce gène médicament est exprimé en continu, ce qui n'est pas naturel. Dans cette technique de thérapie, le gène parviendrait à s'insérer exactement au bon endroit dans l'adn à la place du gène malade et non en plus du gène malade, comme dans les autres styles de thérapies géniques. La cellule le reconnaîtrait donc comme partie intégrante de son patrimoine génétique et la régulation serait faite naturellement par la cellule. - La deuxième propose de créer un chromosome humain entièrement artificiel. Cela permettrait une meilleure expression du gène qui serait alors contrôlé par ses propres séquences régulatrices. Ainsi, malgré la vague d'enthousiasme qu'elle a soulevée à ses débuts, la thérapie génique ne répond pas encore de manière efficace aux espoirs de guérison qu'elle a suscités. D après

13 13 À partir du texte, argumentez sur les aspects positifs et négatifs de la thérapie génique. La thérapie génique dite in-vivo consiste à administrer au patient lui même, et non à des cellules en culture, un vecteur qui permet la libération différée du gène d intérêt. Cette méthode permet donc d agir sur des organes dont on ne peut prélever les cellules ou si les cellules à traiter sont impossibles à isoler ou cultiver. De plus elle n endommage pas les cellules physiquement. Cette thérapie nécessite la mise au point de systèmes de transfert de gène utilisant des vecteurs biologiques tels que des virus modifiés ou des liposomes. Elle est intéressante du fait qu elle permet d envisager de soigner les maladies héréditaires telles que la mucoviscidose. L utilisation de «transporteurs de gènes» totalement inoffensifs, susceptibles d atteindre spécifiquement les cellules à corriger génétiquement, intéresse vivement les chercheurs car, contrairement aux vecteurs virus, ils ne présentent pas de risques. C est le cas des liposomes (vésicules lipidiques) auxquels on introduit le transgène, et qui, alors munis de l information génétique, vont fusionner aux membranes cellulaires pour déverser directement dans la cellule le nouveau gène. L avantage de ces vecteurs, c est qu il peuvent atteindre des tissus composés de cellules qui ont cessées de se diviser (cellules quiescentes ) comme c est le cas de la plupart des tissus du cerveau, du foie et des muscles. La deuxième catégorie de vecteurs candidats à la thérapie génique est la catégorie des virus. Ceux-ci deviennent alors des outils thérapeutiques. La procédure consiste à modifier un génome viral en supprimant certaines séquences, notamment pathogènes, pour installer dans le site libéré le transgène à exprimer dans le génome des cellules visées. Les adénovirus : Ils ont la particularité, une fois leur génome modifié avec le gène humain, de pouvoir être produits en grosse quantité. Mais ils ont plusieurs inconvénients : - une fois insérés dans le noyau cellulaire, les transgènes n agissent que de façon provisoire, - les cellules génétiquement modifiées par les adénovirus sont la cible du système immunitaire qui les reconnaît en gènes étrangers et tente de les éliminer. Essais et résultats : A la fin de l année 1992, trois équipes anglaises d Oxford et Cambridge ont démontré l efficacité d un transfert de gène normal dans les cellules déficientes de la muqueuse respiratoire de souris atteintes d un modèle animal de mucoviscidose. Le gène normal a été intégré dans des liposomes. Ces vecteurs de gène ont alors été introduits dans un aérosol qui fut propulsé simplement dans les voies respiratoires des souris malades. A la suite de cette thérapie génique, les cellules de la trachée, des bronches et des alvéoles pulmonaires exprimaient le gène normal. Cette expérience apporte beaucoup d espoir car le gène de la mucoviscidose humaine et celui de la mucoviscidose animale sont responsables tous les deux du même déficit d une protéine complexe (canal membranaire à chlore).

14 14 BILAN : NIVEAU OBSERVATIONS

15 15 PHENOTYPE MACROSCOPIQUE - Espérance de vie : 40 ans PHENOTYPE CELLULAIRE - Présence d un mucus visqueux qui encombre : les voies respiratoires : difficultés respiratoires et infections à répétitions à l origine de la destruction progressive du tissu pulmonaire ; le canal pancréatique, ce qui provoque les troubles digestifs des malades ; les canaux déférents, provoquant l infertilité des hommes atteints.

16 16 PHENOTYPE MOLECULAIRE - Protéine CFTR (= canal transmembranaire à chlore) non fonctionnelle car la perte de PHE en position 508 modifie sa structure. - Protéine de 1480 acides aminés (CFTR = Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator) GENOTYPE ET MODE DE TRANSMISSION - Maladie autosomique récessive : les deux parents doivent transmettre le gène muté pour que l enfant déclare la maladie. - 1 individu : 1/20 chances d être hétérozygote - Gène CFTR sur le bras long du chromosome 7

17 mutations du gène dont la plus fréquente est ΔF508 (70% des mutations) par délétion de 3 nucléotides C1521, T1522, T Drainage bronchique, médicaments mucolytiques et bronchodilatateurs, antibiotiques pour l'atteinte respiratoire, extraits pancréatiques, vitamines et suppléments caloriques pour les troubles digestifs et nutritionnels TRAITEMENT - Kinésithérapie respiratoire : 2 fois/jour, pour éliminer l excès de mucus - Oxygénothérapie : air enrichi en O2 par masque ou canule nasale - Hygiène de vie stricte : sans tabac, contact avec allergènes ; + activité physique - Greffe de poumon (cas extrêmes) - Thérapie génique (à l essai) La mucoviscidose se caractérise par une altération du gène codant pour la protéine CFTR, sur le chromosome 7. Cette protéine est un canal ionique dont la fonction normale est de réguler le transport du chlore à travers les membranes cellulaires. Son dysfonctionnement atteint tous les organes et provoque une augmentation de la viscosité du mucus, puis son accumulation dans les voies respiratoires et digestives. La mucoviscidose est une maladie autosomique récessive : les deux parents doivent transmettre le gène muté (dont ils sont eux-mêmes porteurs sains) pour que l enfant déclare la maladie. La pathologie est connue depuis le Moyen Âge (maladie du "baiser salé"), mais elle a été pour la première fois décrite médicalement par Guido Fanconi en 1936, sous le nom de fibrose kystique, puis par Dorothy Hansine Andersen en 1938, qui précisa la nosologie. Le gène a été isolé en Depuis, on a découvert près de mutations sur ce gène très instable, dont la plus fréquente (Delta F 508) concerne 70 % des allèles identifiés chez les patients. L'incidence de la mucoviscidose est variable en fonction des populations et très rare dans les populations asiatiques ou africaines. La prévalence en Europe se situerait entre 1/8 000 et 1/ individus. La pathologie est chronique et habituellement progressive. Même s il existe des formes à révélation tardive, souvent moins graves, la mucoviscidose s'exprime généralement dès la petite enfance, parfois dès la naissance : troubles de l'appareil respiratoire (bronchite chronique), du pancréas (insuffisance pancréatique, diabète à partir de l'adolescence, pancréatite parfois), de l'intestin (obstruction stercorale) ou du foie (cirrhose). La stérilité masculine est presque toujours observée. Le diagnostic repose sur le test sudoral (concentration du chlore), confirmé par un test d identification des mutations génétiques. Le dépistage néonatal, généralisé depuis fin 2002, permet le diagnostic dans près de 95 % des cas. Le conseil génétique offre l'opportunité pour un couple porteur d un allèle muté de ne pas avoir un second enfant malade, en pratiquant un diagnostic prénatal dès la huitième semaine de grossesse. Inserm, E. Puchelle Adhérence de pseudomonas aeruginosa aux cellules respiratoires.

18 18 Si l'on ajoute des liposomes à des cultures infectées, l'adhérence de pseudomonas diminue de façon spectaculaire : le nombre de bactéries fixées sur les cellules chute de 67%. Les traitements sont palliatifs et symptomatiques : drainage bronchique, médicaments mucolytiques et bronchodilatateurs, antibiotiques pour l'atteinte respiratoire, extraits pancréatiques, vitamines et suppléments caloriques pour les troubles digestifs et nutritionnels. Alors que la majorité des patients mouraient avant 5 ans dans les années 1960, la vie médiane dépasse aujourd hui 35 ans et l'espérance de vie 40 ans. Outre une meilleure prise en charge médicale, sociale et psychologique, l espoir des patients et de leurs familles repose sur les biothérapies innovantes. D après Du gène à la protéine La protéine anormale a une maturation incomplète (repliement incorrect) et reste dans le RER, ne rejoignant pas sa place dans la membrane plasmique.

19 19 BILAN : La mucoviscidose est une maladie fréquente, provoquée par la mutation d un gène qui est présent sous cette forme chez une personne sur 40 environ. Seuls les homozygotes pour l allèle muté sont malades. Le phénotype malade comporte des aspects macroscopiques qui s expliquent par la modification d une protéine. L étude d un arbre généalogique permet de prévoir le risque de transmission de la maladie. On limite les effets de la maladie en agissant sur des paramètres du milieu. La thérapie génétique constitue un espoir de correction de la maladie dans les cellules pulmonaires atteintes. Epithélium pulmonaire Coupe d épithélium pulmonaire (x100)