Analyse des images après lecture

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1 1 Analyse des images après lecture Utilisation d un logiciel d analyse d image!: Sur la plate-forme de l ENS, nous avons choisi de travailler avec le logiciel GenePix Pro, vous trouverez toutes les caractéristiques de ce logiciel sur le site Internet d Axon!: gn_genepixsoftware.html Présentation de l interface!: L interface du logiciel se présente de la façon suivante (la version utilisée pour les captures d écran est la version 4.1)!: Elle est constitué d onglet pour naviguer entre les différentes grandes fonction du logiciel (visualisation de l image, tableau de résultats, ). La fenêtre de l onglet image se compose de 3!zones qui contiennent les outils de sélection et de navigation dans l image, la zone de visualisation proprement dite au centre et sur la droite la palette des menus sous forme d icônes. La palette des outils en haut à gauche permet d accéder aux différents réglages concernant l image et la grille de spots!:

2 2 En dessous de cette palette se trouve un outil qui permet de se focaliser sur un spot sur l image (lorsque l on clique dessus) et d afficher son image dans les deux canaux avec les mesures des intensités :

3 3 Enfin à droite sont regroupées toutes les icônes qui donnent accès aux réglages des paramètres du scanner. On utilisera plus particulièrement pour la partie analyse d image les icônes suivantes : Les différentes étapes de l analyse d images : Dans la pratique, voici les différentes étapes à suivre pour effectuer l analyse d une image de puces à ADN avec le logiciel GenePix : 1. Ouvrir les images dans le logiciel avec l option «Open Images» (icône «Fichier»), les images sont au format TIFF. Vous pouvez enregistrer ces images sous deux formes. En un seul fichier TIFF, la gestion des fichiers est plus simple. Sous forme de fichiers multiples, les fichiers ainsi créés sont moins gros individuellement et vous pouvez réouvrir vos images dans d autres logiciels d analyse d image. 2. Dans la fenêtre principale de GenePix, il y a plusieurs boutons à connaître :

4 4 a. Tout d abord le réglage de la luminosité et du contraste. En modifiant ces deux paramètres vous visualisez mieux vos spots sur la lame. Ces réglages ne modifient en rien les valeurs brutes, ils ne changent que leur représentation à l écran. b. Ensuite le mode zoom qui vous permet de vous rapprocher de votre image, vous pouvez ainsi voir un bloc en particulier ou un spot en particulier. Vous pouvez toujours revenir au niveau de zoom précédent. 3. Vous devez maintenant charger la grille de référence sur votre image. Ce fichier au format GAL (Gene Array List) contient toutes les informations concernant chaque spot permettant de connaître le nom et la position des gènes sur la lame. Utilisez la fonction Load Array List pour charger votre grille (icône «Fichier»). La grille correspondant aux lames utilisées pendant la formation est disponible sur le site de la plate-forme de l ENS sur la page de la formation INSERM.

5 Une fois la grille chargée, vous devez la positionner sur votre image. Pour cela vous devez vous positionner en mode bloc (bouton avec une flèche et un carré à gauche dans la palette d outils). Avec ce mode, vous pouvez sélectionner des blocs et les déplacer. Même si le logiciel est capable de positionner les blocs de façon automatique, il est indispensable de l aider un peu en prépositionnant la grille. Pour vous faciliter le travail, poussez la luminosité et le contraste de façon à bien voir les spots même les faibles. Ensuite, utilisez le spot en bas à gauche de chaque bloc comme point de référence. En effet c est le spot déposé en premier sur la lame. 5. Enregistrez votre grille de paramètres qui est elle contrairement à la grille de gènes spécifique de votre puce. Pour cela utilisez la fonction Save Settings. Ces paramètres sont enregistrés dans un fichier GPS (GenePix Settings). 6. Une fois tous les blocs pré-positionnés vous pouvez lancer la reconnaissance automatique des blocs et des spots à l intérieur de chaque bloc. Une fois que GenePix à effectuer sa reconnaissance vous devez vérifier qu il n a pas fait d erreur, ligne de spots oubliés, mélange entre les blocs. Pour cela vous pouvez déplacer un seul bloc précisément et lui redemander de chercher à nouveau les spots à l intérieur de ce bloc.

6 Pensez à sauvegarder régulièrement votre grille de paramètres. 8. L étape suivante consiste à regarder par spot les problèmes qui pourraient se poser. Plusieurs choses peuvent arriver : GenePix peut avoir mal entouré le spot, avoir rejeté un spot que vous considérez comme correct ou avoir accepté un spot artéfactuel. Cette étape est la plus fastidieuse et dépend beaucoup de la qualité de l image obtenue. Plus l image est belle moins cette étape prend de temps. Pour travailler, vous devez passer en mode spot (feature mode, icône avec une flèche et un rond dans la palette d outils à gauche). Et vous pouvez déplacer les spots, agrandir leur taille ou la diminuer et leur ajouter une étiquette (flag) si vous souhaitez les éliminer par exemple. Cette étape est importante surtout pour supprimer les artéfacts qui pourraient créer des faux positifs, par exemple une poussière avec une fluorescence dissymétrique. Il faut donc bien veiller à éliminer ces spots et surtout à ne pas hésiter à retourner à l image pour vérifier vos résultats. 9. Les différents types de «flag» que l on peut obtenir avec GenePix sont les suivants : Spot Absent Spot Non Trouvé Mauvais Spot 10. En effectuant un clic droit en mode «feature» sur un spot on accède à un menu contextuel qui permet d accéder aux paramètres d un spot, avec entre autre la possibilité d y affecter un «flag» défini :

7 Une fois que votre image a été bien vérifiée, vous pouvez lancer l analyse à savoir la transformation des pixels de l image en valeurs d intensités. Il vous faut alors aller dans l onglet d analyse pour pouvoir visualiser vos résultats. Enregistrez vos résultats, le fichier est sous la forme d un fichier GPR (GenePix Results).

8 Au moment de l enregistrement GenePix peut afficher un message vous indiquant que certain spots n ont pas d identifiant unique. C est normal. Il s agit des spots vides marqués «empty». Attention toutefois à les supprimer pour ne plus avoir à les prendre en compte dans la suite des analyses.