MAXQUANT : mise en place et utilisation sur la Plateforme de Protéomique Fonctionnelle

Transcription

1 MAXQUANT : mise en place et utilisation sur la Plateforme de Protéomique Fonctionnelle

2 Laboratoire de Mathias Mann

3 Maxquant : Quantification et validation «C'est une suite d'algorithmes développés pour des données quantitatives de MS à haute résolution.» Il permet de faire des analyses de données SILAC obtenues sur un appareil de type Orbitrap. Le logiciel va faire une validation des données d'identification et la quantification relative des données. Les résultats sont obtenus sous forme de tableaux.

4 Les différentes étapes Xcalibur Quant Base de séquence Protéiques Tableur Identify

5 Les différentes étapes Xcalibur Quant.raw Base de séquence Protéiques Tableur Identify

6 Les différentes étapes Xcalibur Quant.msm.raw.fasta Base de séquence Protéiques Tableur Identify

7 Les différentes étapes Xcalibur Quant.msm.raw.raw.fasta.dat Base de séquence Protéiques.fasta Tableur Identify

8 Les différentes étapes Xcalibur Quant.msm.raw.raw.fasta.dat.txt Base de séquences Protéiques.fasta Tableur Identify

9 Maxquant : les différents modules Xcalibur Quant Identify Résultats

10 Maxquant : les différents modules - Détection des pics - Détermination des «paires» - Recalibration - Extraction des spectres pour Xcalibur Quant Identify Résultats

11 Maxquant : les différents modules - Détection des pics - Détermination des «paires» - Recalibration - Extraction des spectres pour Nécessaire? Nous travaillons directement sur Xcalibur Quant Identify Résultats

12 Maxquant : les différents modules - Détection des pics - Détermination des «paires» - Recalibration - Extraction des spectres pour - Extraction des données - Recalibration - Calcul des ratio «protéine» Nécessaire? Nous travaillons directement sur Xcalibur Quant Identify Résultats

13 Maxquant : les différents modules - Détection des pics - Détermination des «paires» - Recalibration - Extraction des spectres pour - Extraction des données - Recalibration - Calcul des ratio «protéine» Nécessaire? Wait and See... Nous travaillons directement sur Xcalibur Quant Identify Résultats

14 Maxquant : la détection de pic Recherche des pics 2D Résultat de la détection en 3D et calcul de la masse : jusqu'à un minimum local, puis calcul m/ z à partir des 3 points centraux Moyenne pondérée de la masse de chaque centroïde, et calcul de l'erreur par «bootstrap» Passage en 3D Connexion des pics ayant de 7 ppm de Xcalibur Quant Identify Résultats

15 Maxquant : la détection des massifs et des paires Détection du profil isotopique : Mesure écart entre 2 pics ayant une bonne corrélation en temps de rétention (en tenant compte de la charge...). Pas de «trou» dans le massif isotopique. Détection des paires : Recherche des massifs ayant une bonne corrélation en temps (± 1 scan) et en masse (selon type marquage) Xcalibur Quant Identify Résultats

16 Intensité du centroïde condition 2 Maxquant : Calcul des ratios Régression linéaire Pente = ratio Intensité du centroïde condition 1 Normalisation des ratios (médiane des ratios en log =0). Sur lysine et sur arginine séparément Par groupe d'intensité Xcalibur Quant Identify Résultats

17 Maxquant : Calcul de la masse Calcul de la masse et estimation de l'erreur : Moyenne pondérée des centroïdes de chaque pic. Détection des couples de charge : Rechercher les différents états de charge d'un même peptide Calibration non linéaire en masse : Xcalibur Quant Identify Résultats

18 Maxquant : Interrogation Génère trois (double marquage) fichiers de spectres. Fichier Contenant les spectres Interrogation Iso 0 Sil 0 Sil 1 Pas associés en couple Plutôt «léger» Plutôt «lourd» marquage en variable pas de marquage marquage lourd en fixe Filtrage des données : - sur le type d'acide aminé en Cter (connu vu l'assemblage en paire) - recalibration linéaire en utilisant les peptides ayant un score >30 et rejet des peptides ayant une erreur de masse supérieure à celle déterminée à l'étape précédente (bootstrap) Calcul d'un FDR et d'une «posterior error probabilities» - Les interrogations sont faites sur une base decoy - possibilité de filtrer les peptides selon PEP Xcalibur Quant Identify Résultats

19 Maxquant : passage Peptide vers Protéine Module de re quantification des pics non assemblés en paire. Création de «groupes» de protéines (redondance) Attribution de type «Rasoir d'occam» Calcul d'un FDR pour les protéines Multiplication des PEP des peptides du groupe de protéines (pas de prise en compte de la redondance peptidique). Xcalibur Quant Identify Résultats

20 Maxquant : «ratio significance» Le but est de déterminer les ratio protéiques extrêmes par rapport à la répartition de l'ensemble des ratio (loi normale), et de leur donner une «significativité». > <-> <->0.01 <0.001 p-value Benjamini-Hochberg Significance A (calcul global) Xcalibur Quant Significance B (calcul par groupe d'intensité) Identify Résultats

21 MaxQuant : structure Tache créée par Oana Vigy pour synchroniser le dossier «conf»

22 MaxQuant : SequenceReverser Outils permettant de créer des bases de données compatibles avec Maxquant : - inversion des séquences et ajout dans la banque pour calcul faux positif ce n'est pas juste une inversion, il y a aussi échange de position des lysines et arginines avec l'acide aminé précèdent. - Ajout de «contaminants» classiques (kératines, protéines sériques...)

23 MaxQuant : Quant (Résultat) Génère quatre (triple marquage) ou trois (double marquage) fichiers de spectres. Iso 0 : marquage en variable Sil 0 : pas de marquage Sil 1 : marquage mi lourd en fixe Sil 2 : marquage lourd en fixe.

24 MaxQuant : Identify (Résultat) Fichiers générés par Maxquant, mais avec beaucoup de renvois de l'un à l'autre Information sur la quantification des peptides Information sur la quantification des protéines

25 MaxQuant : Les différents fichiers

26 Résultats en sortie de Maxquant

27 Le viewer... Mailing-List: list contact Emanuele, It is hard to give a definite delivery date but it might take something like 2 months. Regards, Juergen On Tue, Mar 3, 2009 at 8:31 PM, Emanuele <LcapH@aim.com> wrote: > > > > > > > > > > To MaxQuant developers, do you have an idea of when you will be able to release a bug-free version of Viewer.exe? Last update was on a post of Jan 07. Are there any options for trying a beta version till the official release? Thank you for your attention Best Regards Emanuele Apparemment il existe des «initiés», mais pour l'instant rien d'officiel...

28 Maxquant en résumé Plate-forme Windows 32 bits (Xp et vista). Spectromètre de masse ThermoScientific (Orbi ou FT), et acquisition en LockMass. Utilisation très simple. MAIS attention au dossier «conf» (la majorité des erreurs conduisant à des questions sur le groupe de discussions est dûe à des soucis de synchronisation avec le serveur ou au fichier «label»). Il faut travailler avec beaucoup de données (statistique). Interprétation des résultats fastidieuse (en attendant un viewer). Les tests faits sur la plateforme sur un jeu ayant permis l'identification de 1000 protéines, validés par la suite manuellement montre effectivement un taux de faux positif de moins de 1 %. D'autres modules en attente...

29 Maxquant et Label Free : Présentation Orale HUPO 2008 Protéine de E. coli ratio attendu 3 Protéine de HeLa ratio attendu 1

30 Maxquant et Label Free : Présentation Orale HUPO 2008 Protéine de E. coli ratio attendu 3 Protéine de HeLa ratio attendu 1

31 Maxquant : Protocol

32 Maxquant : GoogleGroups

33 Plateforme de Protéomique Fonctionnelle Patrick Jouin Philippe Marin (Management) Edith Demettre (Biochimie) Oana Vigy (Informatique) Martial Séveno Julie Augier Serge Urbach (Spectrométrie de Masse) Eric Thouvenot (Neurologue en Thèse)

34 Plateforme de Protéomique Fonctionnelle Et bientôt Patrick Jouin Philippe Marin (Management) Edith Demettre (Biochimie) Oana Vigy (Informatique) Martial Séveno Julie Augier Franck Vandermoere (CR CNRS) Serge Urbach (Spectrométrie de Masse) Eric Thouvenot (Neurologue en Thèse)

35 Recalibration non linéaire

36 Répartition des scores Sens/Reverse

37 MMS MS ayant conduit à une identification