Maladies auto-immunes (MAI) définition C'est la rupture des mécanismes de tolérance du système immunitaire visà-vis de constituants de l'organisme (auto-antigènes) Plusieurs caractéristiques communes aux MAI: Évolution chronique, par poussées. Sans relation avec un agent pathogène ou toxique (même si certaines sont révélées au décours d'une infection ou d'une prise médicamenteuse). Les médicaments actuels ne peuvent, au mieux, que contrôler les poussées. Il est rare qu'ils apportent la guérison. Les maladies auto-immunes constituent la troisième cause de morbidité dans les pays développés, avec une prévalence de 6 à 7 % dans la population générale (augmente avec la population vieillissante).
Réponse immune inadaptée Système immunitaire Facteurs génétiques HLA Facteurs génétiques - HLA II (HLA DR) - HLA III (Complément, TNF...) -... MAI Facteurs environnementaux Facteurs d'environnement - Virus / rétrovirus - UV - Poussières minérales - Produits chimiques - Médicaments -...
Non Spécifiques d organe Polyarthrite rhumatoïde Lupus érythémateux disséminé Maladie de Gougerot Sjögren Sclérodermie Dermato-polymyosite Syndrome des anti-phospholipides Vascularites... Sylvain Spécifiques d organe Diabète Thyroïdite Cytopénies Myasthénie Anémie de Biermer... 2 grands types de MAI Maladies auto-immunes
Aspects cliniques pour résumer
Diagnostic des maladies auto-immunes http://www.images.cri-net.com/ Clinique Imagerie Histologie Biologie
Rechercher des marqueurs biologiques de maladies auto-immunes : dans quel but? Maladies auto-immunes spécifiques d organe : Identifier l'origine auto-immune des troubles organiques (Diabète, thyroïdites, anémies,...) Identifier les sujets à risque (exemple : Diabète dans la fratrie) Maladies auto-immunes non spécifiques d organe: Identifier l'origine auto-immune des troubles organiques (insuffisance hépatocellulaire, insuffisance rénale, ) Identifier la maladie auto-immune (spécificité des Ac) Valeur pronostique (Ac anti-adn natif et lupus) Diagnostic délicat
Problématique des maladies auto-immunes Diagnostic Pronostic Évolution Traitement Biologie Biologie VL VH Biologie CL CH
Auto-Ac : effecteurs ou marqueurs? Maladies auto-immunes spécifiques d'organe Maladies auto-immunes non spécifiques d'organe Effecteurs possibles Blocage (activation) de récepteurs Effets cytotoxiques...?? Marqueurs +++ (Apoptose?)
Savoir prescrire à bon escient : 2 situations 1) La clinique est fortement évocatrice Le diagnostic est confirmé Prescrire les marqueurs utiles à la surveillance évolution (poussées, rémission), pronostic Rarement les Ac qui ont servi au diagnostic Exploration du Complément plasmatique Évaluation du syndrome inflammatoire Fonction d'un organe cible Économie Sélectionner les marqueurs à forte valeur diagnostique (confirmer le diagnostic, mais éviter une enquête trop large)
Savoir prescrire à bon escient : 2 situations 2) Les données cliniques ne permettent pas d'orienter le diagnostic : Exemple : connectivite (maladie de système, maladie auto immune non spécifique d'organe) Femme jeune Altération de l'état général Fébricule Poly-arthralgies de type inflammatoire Syndrome de Raynaud En 1 ère intention : Auto-anticorps anti-nucléaires Facteurs rhumatoïdes + Syndrome inflammatoire (VS, CRP...) Électrophorèse des protéines sériques Étude du Complément Recherche d'une cryoglobulinémie
Savoir interpréter les résultats! En fonction du contexte clinique +++ - Dans tous les cas! Âge (> 60 ans) Traitement éventuel Maladie associée (dysglobulinémie) - Marqueur précoce/ tardif? La clé du succès = le dialogue clinico-biologique - Performances des tests utilisés (sensibilité, spécificité) - Interférences? FR : faux positifs (interférences avec ELISA) Cryoglobuline : faux négatifs
Quelle stratégie pour le biologiste? 1) On "connaît" le diagnostic et la cible antigénique Test ELISA (exemple : maladie auto immune spécifique d'organe) ENZ ENZ Microplaque Dépôt de protéines purifiées ENZ ENZ Ac sériques A B C D E F G H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Réaction colorée Dot Ag fixés Ag purifiés ou recombinants (procaryotes)
Quelle stratégie pour le biologiste? 2) On ne connaît pas le diagnostic et/ou la cible antigénique (exemple : maladie auto immune non spécifique d'organe) Hématologie : NFS, VS TP/ TCA Immunologiques : FR Ac anti-nucléaires (ANA) Les tests utiles au diagnostic : ne sont pas tous immunologiques! En fonction des signes d'appel (fonction rénale, ) Exploration du complément CH50 C3c, C4 Cryoglobuline
Mise en évidence des auto-anticorps en pratique courante : Connectivites une stratégie hiérarchisée Débrouillage IFI Ouchterlony Pré-orientation ELISA Ouchterlony Confirmation ELISA/ DOT Western blot
Mise en évidence des auto-anticorps en pratique courante : Connectivites une stratégie hiérarchisée Débrouillage IFI Ouchterlony Pré-orientation ELISA Ouchterlony Confirmation ELISA/ DOT Western blot
Immunofluorescence indirecte Rappel technique FITC Ac sériques Aspects de la fluorescence (nucléaire, cytoplasmique...) Titres +++ (1/80 > 1/1000 ème)
IFI = sur cellules HEp2! IFI : en pratique... Qu'exiger des lames? Nombre de cellules Tassement Nombre de mitoses Contamination Débris cellulaires Stockage des lames HEp2 (fournisseur) Retour à température ambiante Incuber en chambre humide Altération mécanique (essuyage intempestif) Tampon PBS (pas de protéine) Bleu d'evans oui, pas trop (extinction de la fluorescence) Anti-globuline = IgG adsorbée sur HEp2 ou mieux = anti Fab'2 (polyvalente = bruit de fond?)
IFI : en pratique... 1) Commencer par l'objectif x 20 Vue d'ensemble Regarder le noyau et le cytoplasme 2) Passer à l'objectif x 40 (sec ou immersion) Pour le noyau Chercher les cellules en division Quelles sont leurs caractéristiques Sont elles plus fluorescentes?
Quel seuil diagnostique? L'enquête... Arthritis Rheumatism Sept 1997 40 (9); 1601-11 IFI : Les limites Fréquences Dilutions Population normale LED Sjögren Sclérodermie Estimation de la fréquence de dépistage d'auto-ac par IFI sur cellules HEp2 dans 4 populations (4 laboratoires référents). 1/40 31.7 97 84.2 100 1/80 13.3 97 76.3 94.6 1/160 5 95 73.7 86.5 1/320 3.3 94 71.1 83.8 Limites : IFI sur HEp2 : 1 ère dilution = 1/80 ème Seuil d'interprétation : 1/320 ème Manque de spécificité Expérience du lecteur +++ Subjectivité Pas de définition précise de l'auto-ac Absence de contrôle de qualité Pas de standardisation inter-laboratoires
IFI sur lames HEp2 = Le meilleur test de dépistage IFI est elle un test idéal? Large éventail (> 30 spécificités / 10 à 12 pour les autres tests) Approche semi quantitative (titrer le sérum au moins jusque 1/1000) MAIS : L'IFI ne suffit pas Manque de spécificité Pas de définition précise de l'auto-ac il faut compléter l'analyse!
Les pièges de l'ifi Après 60 ans : de la fréquence des Auto-Ac Médicaments et viroses faux positifs ATTENTION! si titres élevés Une IFI "négative" n'élimine pas avec certitude le diagnostic de connectivite 5% de lupus à "ANA négatifs" S'aider des tests simples réalisés au laboratoire (Coombs, exploration du Complément, FR...). ATTENTION! Cryoglobuline Répéter les tests parfois 10 à 12 mois sont nécessaires pour constituer le tableau complet
Diagnostic des connectivites : Hiérarchie des tests biologiques IFI sur Hep2 Négatif Fluorescence nucléaire Fluorescence cytoplasmique Arrêt des investigations Fluorescence homogène Fluorescence mouchetée SSa Lupus à ANA négatifs Clinique Clinique Coombs, Coombs, Complément, Complément, FR, FR, TP/TCA TP/TCA Cryoglobuline Ac anti-adn natif DNA ELISA - Histone DNA simple brin Lupus induit SAPL, PR Maladie générale (viroses, cirrhose, cancer,...) + Crithidia luciliae FARR LED Ac anti-ena Ouchterlony SSA, SSB, Sm, RNP Scl-70, JO1, PCNA Connectivites Actine : HCAI Mitochondrie : CBP Triple substrat Hépatopathies
Fluorescence nucléaire sur cellules HEp2 Ac anti-adn natif Ac anti-rnp Ac anti-ssa Ac anti-centromères http://www.labodia.com//en/ana/atlas/index.htm
Fluorescence nucléaire sur cellules HEp2 Ac anti-scl70 Ac anti-nucléoles Ac anti-jo1 http://www.labodia.com//en/ana/atlas/index.htm Ac anti-mitochondries Ac anti-actine
Comment confirmer la présence d'ac anti-adn natif Suspicion : IFI sur HEp2 : Aspect homogène (titre 1/80) 3 méthodes disponibles Blépharoplaste ELISA IFI : Crithidia luciliae (seuil = 1/40ème) Test de Farr : "Test de référence" (?) Sensibilité Spécificité Interférences ELISA Précipitation par le C. sulfate luciliae d'ammonium, des Farr IgG anti- ADN natif +++ marqué à l' 125 I ++ (Ig de forte affinité) +++ ± ++ +++ Viroses Phénomène de zone Héparine, Ac anti-histones Dextran, Polyanions Contraintes (-) (-) ++
Ouchterlony Identification des Ac anti-ena Méthodes ELISA/ DOT Western blot A B C D E F G H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Dépôt de protéines purifiées Migration électrophorétique des protéines
Recherche des Ac anti-nucléaires Méthodes : intérêts et limites IFI (HEp2) ELISA Ouchterlony WBlot Large éventail diagnostique +++ (30 spécificités) + (10 spécificités) - (10) + (30) Fiabilité Reproductibilité +++ ++ ++ ++ +++ +++ ++ ++ Quantification Sensibilité / (Spécificité) Équipement Durée Coût +++ +++ (-) ++ + + +++ +++ (++) ++ + ++ - + (+++) - +++ - - ++ (±) +++ ++ +++
Conclusion Le diagnostic de maladie auto-immune = Ensemble de symptômes cliniques et biologiques Dialogue clinico-biologique Les tests biologiques simples ont souvent une grande valeur d'orientation (NF, TCA, Coombs, ) Les tests biologiques en vue du diagnostic des maladies auto-immunes ont des limites qu'il faut bien connaître : Mise en œuvre Interprétation délicate Un résultat biologique extrait du contexte clinique n'a pas de signification Interpréter les résultats Préciser les méthodes utilisées (éventuellement leurs limites) Associer un commentaire