Statut du document : Définitif

Compte rendu 141 Auto-immunité : QUAL-IMMUN 3 Centre Toulousain pour le Contrôle de qualité en Biologie clinique Association déclarée à la Préfecture de la Haute-Garonne le 30 Octobre 1973 et enregistrée sous le n W313002633 CTCB - 33 route de Bayonne - 31300 TOULOUSE : 05 34 51 49 80 Fax : 01 57 67 25 90 Email : secretariat.ctcb@ctcb.com site Internet : www.ctcb.com Siret : 428 789 853 000 28 APE : 8559A Statut du document : Définitif 1 - PRESENTATION DU PROGRAMME D INTERCOMPARAISON Expert du programme et Coordonnateur : Stéphanie Albarède, CTCB, s.albarede@ctcb.com Expert du programme : Mme Fortenfant, Laboratoire d Immunologie, fortenfant.f@chu-toulouse.fr Un large panel vous est proposé en auto-immunité en collaboration avec la société THERADIAG. THERADIAG apporte ainsi son savoir-faire dans la fabrication d échantillon et le CTCB son expérience et son indépendance pour le traitement des données. Fréquence de passage (pour chaque programme d auto-immunité) : 2 enquêtes par an, avec 3 échantillons (400-600 µl de niveaux différents) Présentation du programme : L ensemble des échantillons est adressé en une seule fois par la société THERADIAG. Le programme proposé est réparti de la façon suivante : apl Anticorps anti-phospholipides IgG, IgM (APL, ACL et B2GP1) FII Anticorps anti-prothrombine IgG et IgM ANCA Anticorps anti-cytoplasme des polynucléaires neutrophiles Dépistage et typage (MPO et/ou PR3) MBG Anticorps anti-membrane basale glomérulaire 2 - DETERMINATION DE LA NOTATION DU LABORATOIRE Le système de notation qualitatif repose sur l échelle d'évaluation suivante : A = Réponse attendue B = Réponse acceptable C = Réponse à analyser par le laboratoire D = Réponse erronée Le résultat attendu est la valeur assignée qualitative transmise par le fournisseur lorsque les résultats des participants sont cohérents en inter-réactifs. Des différences par groupe de pairs peuvent amener l Expert à moduler cette valeur, le fournisseur ne pouvant pas tester tous les dispositifs médicaux de diagnostic in vitro (DMDIV) présents sur le marché. En effet, dans le domaine de l auto-immunité, de nombreux facteurs dont la nature et la présentation de l antigène, peuvent induire des discordances de résultats entre deux techniques voire deux réactifs d une même technique. Ceci explique que les valeurs indicatives disponibles sur le site internet à la date de clôture puissent différer de la valeur attendue. Etant donné les faibles effectifs et la dispersion des résultats, les données quantitatives ne sont pas exploitées (pas d évaluation des résultats quantitatifs). 3 - TRAITEMENT STATISTIQUE QUANTITATIF Le traitement statistique quantitatif est réalisé selon les protocoles suivants : - Pour les résultats rendus en inverse de dilution : Détermination de l effectif (N) après élimination des résultats rendu avec un signe < ou >, de la Médiane, Min et Max. - Pour les résultats rendus en unité internationale : Détermination de l effectif (N), effectif après troncature (N*), moyenne après exclusion des valeurs aberrantes par la médiane +/-50%, écart type (ET), coefficient de variation (CV), valeur minimum et maximum (Min, Max) avant troncature. - Critères de rendus des résultats : si l effectif est supérieur ou égal à 3. Page 1 sur 18

4 - ANALYSE DES REPONSES ET COMMENTAIRES I. Matériel et méthode A. Recherche d anticorps anti phospholipide Ce contrôle permet de réaliser : - La détection globale des anticorps anti-phospholipides (réactifs ne permettant pas de définir la spécificité de l anticorps anti-phopholipides) - Et/ou la recherche des anticorps anti-cardiolipine - Et/ou la recherche des anticorps anti Béta2GP1 - Et/ou la recherche des anticorps anti-prothrombine Pour chacun de ces tests, les laboratoires pouvaient opter pour des réactifs recherchant des IgG ou des IgM. a) Détection globale des anticorps anti-phospholipides Le nombre de laboratoires ayant réalisé cette détection globale d anticorps anti-phospholipides est de 5 pour l isotype IgG et de 3 pour l isotype IgM. Les réactifs utilisés relèvent tous d une technique immuno-enzymatique. b) Recherche des anticorps anti-cardiolipines On dénombre 46 participants pour la recherche des IgG cardiolipines et 36 pour la recherche des IgM. La technique la plus utilisée est l immuno-enzymologie (figures 1 et 2). 4% 13% 83% Chimiluminescence Immunoenzymologie X-MAP Figure 1. Répartition des techniques : recherche d IgG anti-cardiolipine. 5% 14% 81% Chimiluminescence Immunoenzymologie X-MAP Figure 2. Répartition des techniques : recherche d IgM anti-cardiolipine. c) Recherche des anticorps anti bêta 2 glycoprotéine (β2gp1) La recherche d IgG anti- β2gp1 a été réalisée par 41 laboratoires et des IgM par 29 laboratoires avec une majorité de réactifs relevant de la technique d immuno-enzymologie (figures 3 et 4). Page 2 sur 18

2% 15% Chimiluminescence 83% Immunoenzymologie X-MAP Figure 3. Répartition des techniques : recherche d IgG anti-β2gp1. 4% 17% Chimiluminescence 79% Immunoenzymologie X-MAP Figure 4. Répartition des techniques : recherche d IgM anti-β2gp1. d) Recherche des anticorps anti-prothrombine 5 laboratoires ont réalisé la recherche d IgG anti-prothrombine et 3 laboratoires la recherche d IgM. Deux laboratoires utilisent des réactifs relevant d une technique d immuno-enzymologie et les trois autres d une technique X-MAP. B. ANCA/Anti MBG Ce contrôle permet de réaliser le dépistage des anticorps anti-cytoplasme des polynucléaires neutrophiles en IFI et l identification des anticorps anti-mpo, anti-pr3 et anti-mbg. a) Dépistage des ANCA (Immunofluorescence indirecte) Le nombre de laboratoires ayant réalisé le dépistage des anticorps anti-cytoplasme des polynucléaires neutrophiles est de 44. La majorité des laboratoires (86%) utilisent une dilution de dépistage au 1/20 (tableau I). La lecture se fait au grossissement 40 dans 82% des laboratoires (tableau II). L origine des lames utilisées est reportée dans le tableau III. Nombre d utilisateurs par dilution de dépistage Effectif 10 3 20 38 40 2 80 1 Total général 44 Tableau I. Nombre d utilisateurs par dilution de dépistage. Nombre d utilisateurs par grossissement Effectif Non renseigné 2 20 2 40 36 50 1 60 1 63 1 100 1 Total général 44 Tableau II. Nombre d utilisateurs par grossissement. Page 3 sur 18

Réactifs IFI Effectif BIO ADVANCE Granulocytes fixés à l'éthanol (réf : 1200-10xx) 2 BIO ADVANCE Granulocytes fixés éthanol/formol (réf : 1201-10xx-2) 8 BIO ADVANCE Granulocytes fixés éthanol/formol/foie/hep2 (réf : 1201-10xx-3) 1 BIO-RAD Lames ANCA COMBI éthanol/formol (réf : 29419) 1 BIO-RAD Lames ANCA éthanol (réf : 29417 / 29416) 7 BMD Test de détection des ANCA - éthanol (réf : IMM 1140) 1 EUROBIO/ IMMUNO CONCEPTS ANCA éthanol 1 INGEN ImmuGlo Comvi ANCA IFA (éthanol + formol) 1 INOVA Lames de neutrophiles fixées à l'éthanol 15 INOVA NOVA Lite ANCA 5 MENARINI ANCA fixé à l'éthanol (lame 6 ou 12 puits) 1 MENARINI ANCA fixé éthanol + formol 1 Total général 44 Tableau III. Réactifs IFI pour le dépistage des ANCA. b) Identification des spécificités MPO/PR3 L identification des anticorps anti-mpo et anti-pr3 a été réalisée par 43 laboratoires. La technique la plus utilisée est l immuno-enzymologie (figure 5). 5% 9% 70% 16% Chimiluminescence ImmunoDot Immunoenzymologie X-MAP Figure 5. Répartition des techniques : Identification des Ac anti-mpo- Ac anti-pr3. c) Identification des anticorps anti-membrane basale glomérulaire Pour l identification des anticorps anti-mbg, la technique la plus utilisée est l immunodot (44% des laboratoires). La répartition des techniques est représentée en figure 6. Cette analyse a été réalisée par 27 participants. 41% 4% 7% 4% 44% Chimiluminescence IFI ImmunoDot Immunoenzymologie X-MAP Figure 6. Répartition des techniques : Identification des Ac anti-mbg. Page 4 sur 18

II. Echantillon 1411 A. Composition de l échantillon - Présence d anticorps IgG anti-cardiolipine, anti- β2gp1 et d IgM anti- β2gp1. - Présence d anticorps anti-cytoplasme des polynucléaires de type anti-mpo. - Présence d anticorps anti-mbg. B. Recherche d anticorps anti-phospholipide a) Détection globale des anticorps anti-phospholipides On observe 100% de bonnes réponses qualitatives pour l isotype IgG et une réponse faussement négative pour l isotype IgM obtenue avec le réactif d ORGENTEC Alegria (tableau IV). Dosage des anticorps anti-phospholipides- Echantillon 1411 Marqueur IgG Positif BMD/THERADIAG PHOSPHO-LISA 3 ORGENTEC Anti Phospholipid Screen IgG/IgM (réf : ORG 529) 1 ORGENTEC Anti Phospholipid Screen IgG Alegria (réf : ORG 229G) 1 Total général 5 Marqueur IgM Négatif Positif BMD/THERADIAG PHOSPHO-LISA 2 ORGENTEC Anti Phospholipid Screen IgM Alegria (réf : ORG 229M) 1 Total général 1 2 Tableau IV. Tests globaux de recherche des anticorps anti-phospholipides Echantillon 1411. b) Recherche des anticorps anti-cardiolipines L ensemble des participants a mis en évidence la présence d anticorps IgG anti-cardiolipines. Pour l isotype IgM, les réponses se répartissent en 50% de résultats négatifs, 36% de résultats positifs et 14% de résultats douteux (tableau V). Cependant, pour le réactif PHADIA, au vu des résultats rendus de 14 à 27 U/ml pour un seuil de positivité à 40 U/mL, l ensemble des utilisateurs de ce réactif aurait dû rendre un résultat négatif. Ce qui fait une répartition des résultats en 64% de résultats négatifs, 30,5% de résultats positifs et 5,5% de résultats douteux. Dosage des IgM anti-cardiolipines - Echantillon 1411 Marqueur IgM Négatif Douteux Positif Chimiluminescence 1 1 DIASORIN LIAISON Cardiolipin IgM 1 MENARINI ZENIT RA Cardiolipin IgM 1 Immuno-enzymologie 13 4 12 Autre 1 BIOADVANCE ELISA anti-cardiolipide IgM 2 BIORAD Anti-Cardiolipin IgM EIA 1 BMD/THERADIAG Cardio Chorus IgM 1 1 BMD/THERADIAG Cardio LISA IgM 2 INOVA QUANTA Lite ACA IgM III 4 ORGENTEC Anti-Cardiolipin IgM Alégria (réf : ORG 215M) 9 PHADIA EliACardiolipin IgM 3 3 2 X-MAP 5 BIORAD BioPlex 2200 APLS IgM 3 BMD/THERADIAG FIDIS APS IgM 2 Total général 18 5 13 Tableau V.Résultat qualitatif de la recherche des IgM anti-cardiolipine - Echantillon 1411. Page 5 sur 18

Les résultats quantitatifs du dosage des IgG anti-cardiolipine sont présentés dans le tableau VI. Réactif N N* Moyenne ET CV Min Max BMD/THERADIAG FIDIS APS IgG 3 3 180,00 45,03 25,02 134 224 INOVA QUANTA Lite ACA IgG III 5 5 140,02 11,02 7,87 127 149 ORGENTEC Anti-Cardiolipin IgG Alégria (réf : ORG 215G) 4 4 97,13 22,48 23,15 68,6 120* PHADIA EliA Cardiolipin IgG 12 12 326,75 37,74 11,55 269 404 Tableau VI. Dosage des IgG anti-cardiolipine (U/ml) - Echantillon 1411. *En plus des 4 laboratoires, 6 laboratoires ont rendu un résultat «> 120» Titres rendus en IgM pour information : tableau VII Réactif N N* Seuil Min Max INOVA QUANTA Lite ACA IgM III 4 4 20 24 36 ORGENTEC Anti-Cardiolipin IgM Alégria (réf : ORG 215M) 9 9 7 3,4 6 PHADIA EliACardiolipin IgM 8 8 40 14 27 Tableau VII. Dosage des IgM anti-cardiolipine (U/ml) - Echantillon 1411. c) Recherche des anticorps anti bêta 2 glycoprotéine (β2gp1) Pour l isotype IgG, on observe un résultat faussement négatif sur 41 résultats rendus (tableau VIII), ce résultat ayant été obtenu sur automate Chorus (le titre observé est bien inférieur au seuil de la technique). Pour l isotype IgM (tableau IX), on observe 19 résultats négatifs, 1 douteux et 9 positifs. Concernant les résultats quantitatifs, on observe des bons CV% pour l isotype IgG, tous inférieurs à 20% (tableau X). Le tableau XI présente les résultats quantitatifs pour l isotype IgM anti-β2gp1. Dosage des anticorps IgG anti-β2gp1 - Echantillon 1411 Marqueur IgG Négatif Positif Chimiluminescence 1 MENARINI ZENIT RA Β2 GLYCOPROTEIN I IgG 1 Immuno-enzymologie 1 33 Autre 1 BIOADVANCE ELISA Anti-B2GP1 IgG 2 BIORAD anti-b2 Glycoprotein I IgG EIA Kit 1 BMD/THERADIAG B2GP1 LISA IgG 1 BMD/THERADIAG Chorus LISA IgG 1 1 INOVA QUANTA Lite B2 GPI IgG 3 ORGENTEC anti-b2 Glycoprotein I IgG Alégria (réf : ORG 221G) 9 ORGENTEC anti-b2 Glycoprotein IgG/IgM (réf ORG : 521) 1 PHADIA EliA B2 Glycoprotein I IgG 13 PHADIA Varelisa B2 Glycoprotein I (IgG) antibodies 1 X-MAP 6 BIORAD BioPlex 2200 APLS IgG 3 BMD/THERADIAG FIDIS APS IgG 3 Total général 1 40 Tableau VIII.Résultat qualitatif de la recherche des anticorps IgG anti-β2gp1 - Echantillon 1411. Page 6 sur 18

Dosage des anticorps IgM anti-β2gp1 - Echantillon 1411 Marqueur IgM Négatif Douteux Positif Chimiluminescence 1 MENARINI ZENIT RA Β2 GLYCOPROTEIN I IgM 1 Immuno-enzymologie 19 4 Autre 1 BIOADVANCE ELISA Anti-B2GP1 IgM 2 BIORAD anti-b2 Glycoprotein I IgM EIA Kit 1 BMD/THERADIAG B2GP1 LISA IgM 1 BMD/THERADIAG Chorus LISA IgM 1 INOVA QUANTA Lite B2 GPI IgM 2 ORGENTEC anti-b2 Glycoprotein I IgM Alégria (réf : ORG 221M) 4 ORGENTEC anti-b2 Glycoprotein IgG/IgM (réf ORG : 521) 1 PHADIA EliA B2 Glycoprotein I IgM 9 PHADIA Varelisa B2 Glycoprotein I (IgM) antibodies 1 X-MAP 5 BIORAD BioPlex 2200 APLS IgM 3 BMD/THERADIAG FIDIS APS IgM 2 Total général 19 1 9 Tableau IX.Résultat qualitatif de la recherche des anticorps IgM anti-β2gp1 - Echantillon 1411. Réactif N N* Moyenne ET CV Min Max BMD/THERADIAG FIDIS APS IgG 3 3 131,33 9,45 7,20 124 142 INOVA QUANTA Lite B2 GPI IgG 3 3 92,57 8,70 9,40 83 100 ORGENTEC anti-b2 Glycoprotein I IgG Alégria (réf : ORG 221G) 9 5 14,76 2,03 13,76 12,1 175,8 PHADIA EliA B2 Glycoprotein I IgG 13 13 104,44 14,76 14,13 76,7 127 Tableau X. Dosage des IgG anti-β2gp1 (U/ml) - Echantillon 1411. Réactif N N* Moyenne ET CV Min Max BIORAD BioPlex 2200 APLS IgM 3 3 28,27 2,11 7,47 28 30,5 ORGENTEC anti-b2 Glycoprotein I IgM Alégria (réf : ORG 221M) 4 4 - - - 1,9 4,1 PHADIA EliA B2 Glycoprotein I IgM 8 6 - - - 1 3,5 Tableau XI. Dosage des IgM anti-β2gp1 (U/ml) - Echantillon 1411. d) Recherche des anticorps anti-prothrombine Parmi les 5 laboratoires ayant recherché les IgG anti-prothrombine (tableau XII), on observe 3 réponses douteuses, une réponse négative et une positive. Trois laboratoires ont réalisé la recherche d IgM et l ont rendu négative. Dosage des anticorps anti-prothrombine - Echantillon 1411 Marqueur IgG Négatif Douteux Positif Immuno-enzymologie 1 1 INGEN AESKULISA prothrombin-gm 1 ORGENTEC Anti-Prothrombin IgG Alégria (réf : ORG 241G) 1 X-MAP 2 1 BMD/THERADIAG FIDIS APS IgG 2 1 Total général 1 3 1 Marqueur IgM Négatif Immuno-enzymologie 1 INGEN AESKULISA prothrombin-gm 1 X-MAP 2 BMD/THERADIAG FIDIS APS IgM 2 Total général 3 Tableau XII. Résultat qualitatif de la recherche des anticorps anti-prothrombine - Echantillon 1411 Page 7 sur 18

C. ANCA/Anti MBG a) Dépistage des ANCA (Immunofluorescence indirecte) Parmi les 44 participants, on observe un faux négatif, 41 laboratoires (93%) ont mis en évidence une fluorescence périnucléaire P-ANCA (réponse attendue) et 2 laboratoires (5%) ont rendu une fluorescence cytoplasmique C-ANCA dont un est du à inversion d échantillon 1411 et 1413 (tableau XIII). La répartition des titres observés est représentée dans la figure 7 : la médiane est à 1/160 avec des titres allant de 1/20 à 1/320. Aspect de la fluorescence Ininterprétable Négatif Positif Aucun aspect 1 Aspect cytoplasmique 2 Aspect périnucléaire 1 40 Total général 1 1 42 Tableau XIII. Résultat qualitatif du dépistage des ANCA selon les aspects de la fluorescence - Echantillon 1411. Nombre de réponse 14 12 10 8 6 4 2 Répartition des titres en inverse de dilution pour l'aspect panca médiane = 160 0 20 >20 40 50 60 80 160 >160 320 Total 3 4 3 1 1 4 12 1 5 Figure 7. Titrage des ANCA sur échantillon 1411. Réactif N Médiane Min Max BIO ADVANCE Granulocytes fixés éthanol/formol (réf : 1201-10xx-2) 6 120 20 160 BIO-RAD Lames ANCA éthanol (réf : 29417 / 29416) 3 160 160 160 INOVA Lames de neutrophiles fixées à l'éthanol 10 160 20 320 INOVA NOVA Lite ANCA 3 80 60 320 Tableau XIV. Résultats quantitatifs 1411 - IFI (Aspect périnucléaire). Réponses à la question «Est-il nécessaire de rechercher des AAN sur HEp2 ou de réaliser la recherche d ANCA sur formol?» : -27 réponses «Non» -17 réponses «Oui» dont 10 laboratoires qui ont conclu «Présence d anticorps anti-nucléaires associés à des anticorps P-ANCA» et un laboratoire a conclu «Ininterprétable» (il a rendu le dépistage ANCA positif avec une fluorescence P-ANCA). Remarque : -le laboratoire ayant rendu au dépistage ANCA négatif a répondu oui à la recherche d AAN et a conclu à la «Présence d anticorps anti-nucléaires associés à des anticorps P-ANCA». Page 8 sur 18

-Un des 2 laboratoires ayant rendu au dépistage des ANCA positif avec une fluorescence c-anca, a répondu oui à la recherche d AAN et a conclu à la «Présence d anticorps anti-nucléaires associés à des anticorps P-ANCA». Le laboratoire ayant rendu au dépistage ANCA «ininterprétable avec une fluorescence P-ANCA a répondu oui à la recherche d AAN et a conclu à la «Présence d anticorps anti-nucléaires associés à des anticorps P-ANCA». b) Identification des spécificités MPO/PR3 La présence d anticorps anti-mpo, a été mise en évidence par 42 laboratoires sur 43. Le seul résultat faussement négatif est dû à une inversion d échantillon 1411 1413 (tableau XV). Pour les anticorps anti-pr3, on observe un seul résultat faussement positif qui est dû à une inversion d échantillon 1411-1413 (tableau XVI). Les résultats quantitatifs des anticorps anti-mpo sont présentés dans le tableau XVII. Négatif Positif Chimiluminescence 2 INOVA QUANTA Flash MPO 1 MENARINI ZENIT RA MPO 1 ImmunoDot 7 BIO ADVANCE EUROLINE MPO + PR3 + GBM (réf : DL 1200-1601-3 G) 1 BMD ANCA MBG DOT (réf : HM025) 2 D-Tek BlueDot ANCA+GBM (MPO/PR3/GBM) 1 EUROBIO ANCA DOT 1 GENERIC ASSAYS GmbH ANCA Dot 1 INGEN ANCA-Goodpasture (MPO/PR3/GBM) 1 Immuno-enzymologie 30 BIO ADVANCE ELISA ANTI-MPO IgG (réf : EA 1211-9601 G) 2 INOVA QUANTA Lite MPO IgG 4 INOVA QUANTA Lite MPO SC 1 ORGENTEC ANCAcombi (réf : ORG 530) 1 ORGENTEC Anti-MPO (p-anca) (réf : ORG 519) 1 ORGENTEC Anti-MPO (p-anca) Alégria (réf : ORG 219) 9 PHADIA / THERMO FISCHER EliA MPOS Well 12 X-MAP 1 3 BIORAD BioPlex 2200 Vasculitis 1 1 BMD FIDIS VASCULITIS (réf : MX007) 2 Total général 1 42 Tableau XV. Résultat qualitatif de la recherche d anticorps anti-mpo - Echantillon 1411. Page 9 sur 18

Négatif Positif Chimiluminescence 2 INOVA QUANTA Flash PR3 1 MENARINI ZENIT RA PR3 1 ImmunoDot 7 BIO ADVANCE EUROLINE MPO + PR3 + GBM (réf : DL 1200-1601-3 G) 1 BMD ANCA MBG DOT (réf : HM025) 2 D-Tek BlueDot ANCA+GBM (MPO/PR3/GBM) 1 EUROBIO ANCA DOT 1 GENERIC ASSAYS GmbH ANCA Dot 1 INGEN ANCA-Goodpasture (MPO/PR3/GBM) 1 Immuno-enzymologie 30 BIO ADVANCE ELISA Anti-PR3 hn hr IgG (réf : EA 1201-9601-2 G) 2 INOVA QUANTA Lite PR3 4 INOVA QUANTA Lite PR3 SC 1 ORGENTEC ANCAcombi (réf : ORG 530) 1 ORGENTEC Anti-PR3 (c-anca) Alégria (réf : ORG 218) 6 ORGENTEC Anti-PR3 hs (réf : ORG 618) 2 ORGENTEC Anti-PR3 hs Alégria (réf : ORG 318) 2 PHADIA / THERMO FISCHER EliA PR3S Well 11 PHADIA / THERMO FISCHER VARELISA PR3 ANCA 1 X-MAP 3 1 BIORAD BioPlex 2200 Vasculitis 1 1 BMD FIDIS VASCULITIS (réf : MX007) 2 Total général 42 1 Tableau XVI. Résultat qualitatif de la recherche d anticorps anti-pr3 - Echantillon 1411. Réactif N N* Moyenne ET CV Min Max INOVA QUANTA Lite MPO IgG 4 4 44,75 10,86 24,26 28,8 52 ORGENTEC Anti-MPO (p-anca) Alégria (réf : ORG 219) 9 9 11,61 2,15 18,56 7,2 14,1 PHADIA / THERMO FISCHER EliA MPOS Well 12 11 32,09 5,07 15,79 27 47,1 Tableau XVII. Dosage des Ac anti-mpo (U/ml) - Echantillon 1411. c) Identification des anticorps anti-membrane basale glomérulaire L ensemble des participants a rendu la réponse attendue c est-à-dire positive. Les résultats quantitatifs sont présentés dans le tableau XVIII. Réactif N N* Moyenne ET CV Min Max ORGENTEC anti-gbm Alégria (réf ORG 250) 5 5 161,58 41,43 25,64 102,3 200 PHADIA / THERMO FISCHER EliA GBM Well 5 5 62,80 10,16 16,18 48 73 Tableau XVIII. Dosage des Ac anti-mbg (U/ml) - Echantillon 1411. D. Commentaires Concernant les anticorps anti-phospholipides, l échantillon a été préparé, notamment dilué, pour avoir le profil suivant : présence d anticorps IgG anti-cardiolipine, anti- β2gp1 et d IgM anti- β2gp1. En raison de ce mode de préparation, les différences de sensibilité des réactifs, les différents seuils de positivité utilisés par les laboratoires font que pour certains paramètres (IgM anti cardiolipines et anti- β2gp1) les résultats sont très dispersés : la notation des résultats individuels dans un tel cas se fait par réactif (consensus des laboratoires participants utilisant un même réactif pris en compte). Page 10 sur 18

III. Echantillon 1412 A. Composition de l échantillon - Présence d anticorps IgG et IgM anti Cardiolipines, anti-β2gp1. - Présence d anticorps IgM anti-prothrombine. - Absence d anticorps anti-cytoplasme des polynucléaires, présence d anticorps anti-nucléaires. - Absence d anticorps anti-mbg B. Recherche d anticorps anti-phospholipide a) Détection globale des anticorps anti-phospholipides Pour l isotype IgG, on note la présence d une réponse négative obtenue avec le réactif BMD/THERADIAG PHOSPHO-LISA (titre rendu 12 pour un seuil à 15) et quatre réponses positives. L ensemble des participants ont mis en évidence la présence d anticorps IgM anti-phospholipides (tableau XIX). Dosage des anticorps anti-phospholipides- Echantillon 1412 Marqueur IgG Négatif Positif BMD/THERADIAG PHOSPHO-LISA 1 2 ORGENTEC Anti Phospholipid Screen IgG/IgM (réf : ORG 529) 1 ORGENTEC Anti Phospholipid Screen IgG Alegria (réf : ORG 229G) 1 Total général 1 4 Marqueur IgM Positif BMD/THERADIAG PHOSPHO-LISA 2 ORGENTEC Anti Phospholipid Screen IgM Alegria (réf : ORG 229M) 1 Total général 3 Tableau XIX. Tests globaux de recherche des anticorps anti-phospholipides Echantillon 1412. b) Recherche des anticorps anti-cardiolipines Pour l isotype IgG, on observe 52% de réponses positives, 7% de réponses douteuses et 41% de réponses négatives (tableau XX). L ensemble des laboratoires a mis en évidence la présence des IgM. Les résultats quantitatifs sont présentés dans les tableaux XXI et XXII. Dosage des IgG anti-cardiolipines - Echantillon 1412 Marqueur IgG Négatif Douteux Positif Chimiluminescence 2 DIASORIN LIAISON Cardiolipin IgG 1 MENARINI ZENIT RA Cardiolipin IgG 1 Immuno-enzymologie 18 2 18 Autre 1 BIOADVANCE ELISA anti-cardiolipide IgG 1 BIORAD Anti-Cardiolipin IgG EIA 3 BMD/THERADIAG Cardio Chorus IgG 1 1 BMD/THERADIAG Cardio LISA IgG 1 2 IBL Cardiolipin IgG ELISA (réf : RE75011) 1 INOVA QUANTA Lite ACA IgG III 3 1 1 ORGENTEC Anti-Cardiolipin IgG Alégria (réf : ORG 215G) 1 9 PHADIA EliA Cardiolipin IgG 12 X-MAP 1 1 4 BIORAD BioPlex 2200 APLS IgG 3 BMD/THERADIAG FIDIS APS IgG 1 1 1 Total général 19 3 24 Tableau XX. Résultat qualitatif de la recherche des IgG. anti-cardiolipines - Echantillon 1412. Page 11 sur 18

Réactif N N* Moyenne ET CV Min Max BIORAD Anti-Cardiolipin IgG EIA 3 3 26,33 5,03 19,11 21 31 BIORAD BioPlex 2200 APLS IgG 3 3 37,87 0,64 1,68 37,5 38,6 INOVA QUANTA Lite ACA IgG III 5 4 13,24 3,21 24,25 10,96 26 ORGENTEC Anti-Cardiolipin IgG Alégria (réf : ORG 215G) 10 8 22,74 4,77 20,98 7 38,6 PHADIA EliA Cardiolipin IgG 10 10 5,97 0,98 16,34 4,8 8 Tableau XXI. Dosage des IgG anti-cardiolipine (U/ml) - Echantillon 1412. Réactif N N* Moyenne ET CV Min Max BIORAD BioPlex 2200 APLS IgM 3 3 114,03 0,59 0,51 113,6 114,7 INOVA QUANTA Lite ACA IgM III 4 4 99,61 19,73 19,81 77,42 123 ORGENTEC Anti-Cardiolipin IgM Alégria (réf : ORG 215M) 8 8 60,59 10,81 17,84 41 80 PHADIA EliACardiolipin IgM 8 8 131,63 12,48 9,48 114 154 Tableau XXII. Dosage des IgM anti-cardiolipine (U/ml) - Echantillon 1412. c) Recherche des anticorps anti bêta 2 glycoprotéine (β2gp1) On observe 41,5% de réponses positives, 5% de réponses douteuses et 53,5% de réponses négatives pour la recherche d anticorps IgG anti- β2gp1 (tableau XXIII). Pour l isotype IgM, deux réponses douteuses ont été rendues contre 27 résultats positifs (tableau XXIV). Les résultats quantitatifs sont présentés dans les tableaux XXV et XXVI. Dosage des IgG anti-β2gp1 - Echantillon 1412 Marqueur IgG Négatif Douteux Positif Chimiluminescence 1 MENARINI ZENIT RA Β2 GLYCOPROTEIN I IgG 1 Immuno-enzymologie 22 2 10 Autre 1 BIOADVANCE ELISA Anti-B2GP1 IgG 2 BIORAD anti-b2 Glycoprotein I IgG EIA Kit 1 BMD/THERADIAG B2GP1 LISA IgG 1 BMD/THERADIAG Chorus LISA IgG 2 INOVA QUANTA Lite B2 GPI IgG 3 ORGENTEC anti-b2 Glycoprotein I IgG Alégria (réf : ORG 221G) 2 7 ORGENTEC anti-b2 Glycoprotein IgG/IgM (réf ORG : 521) 1 PHADIA EliA B2 Glycoprotein I IgG 13 PHADIA Varelisa B2 Glycoprotein I (IgG) antibodies 1 X-MAP 6 BIORAD BioPlex 2200 APLS IgG 3 BMD/THERADIAG FIDIS APS IgG 3 Total général 22 2 17 Tableau XXIII. Résultat qualitatif de la recherche des IgG anti-β2gp1 - Echantillon 1412. Dosage des IgM anti-β2gp1 - Echantillon 1412 Marqueur IgM Douteux Positif Chimiluminescence 1 MENARINI ZENIT RA Β2 GLYCOPROTEIN I IgM 1 Immuno-enzymologie 2 21 Autre 1 BIOADVANCE ELISA Anti-B2GP1 IgM 2 BIORAD anti-b2 Glycoprotein I IgM EIA Kit 1 BMD/THERADIAG B2GP1 LISA IgM 1 BMD/THERADIAG Chorus LISA IgM 1 INOVA QUANTA Lite B2 GPI IgM 2 ORGENTEC anti-b2 Glycoprotein I IgM Alégria (réf : ORG 221M) 1 3 ORGENTEC anti-b2 Glycoprotein IgG/IgM (réf ORG : 521) 1 PHADIA EliA B2 Glycoprotein I IgM 9 PHADIA Varelisa B2 Glycoprotein I (IgM) antibodies 1 X-MAP 5 BIORAD BioPlex 2200 APLS IgM 3 BMD/THERADIAG FIDIS APS IgM 2 Total général 2 27 Tableau XXIV. Résultat qualitatif de la recherche des IgM anti-β2gp1 - Echantillon 1412. Page 12 sur 18

Réactif N N* Moyenne ET CV Min Max BIORAD BioPlex 2200 APLS IgG 3 3 92,97 19,28 20,74 77,9 114,7 BMD/THERADIAG FIDIS APS IgG 3 3 20,67 4,51 21,82 16 25 ORGENTEC anti-b2 Glycoprotein I IgG Alégria (réf : ORG 221G) 9 7 9,09 2,78 30,64 6,2 97,9 PHADIA EliA B2 Glycoprotein I IgG 12 11 4,38 0,90 20,59 3 10 Tableau XXV. Dosage des IgG anti-β2gp1 (U/ml) - Echantillon 1412. Réactif N N* Moyenne ET CV Min Max PHADIA EliA B2 Glycoprotein I IgM 9 9 97,78 16,72 17,10 76 127 Tableau XXVI. Dosage des IgM anti-β2gp1 (U/ml) - Echantillon 1412. d) Recherche des anticorps anti-prothrombine On observe 100% de bonnes réponses qualitatives (négatives) pour l isotype IgG, et une réponse faussement négative pour l'isotype IgM (tableau XXVII). Dosage des anticorps anti-prothrombine - Echantillon 1412 Marqueur IgG Négatif Immuno-enzymologie 2 INGEN AESKULISA prothrombin-gm 1 ORGENTEC Anti-Prothrombin IgG Alégria (réf : ORG 241G) 1 X-MAP 3 BMD/THERADIAG FIDIS APS IgG 3 Total général 5 Marqueur IgM Négatif Positif Immuno-enzymologie 1 INGEN AESKULISA prothrombin-gm 1 X-MAP 2 BMD/THERADIAG FIDIS APS IgM 2 Total général 1 2 Tableau XXVII. Résultat qualitatif de la recherche des anticorps anti-prothrombine - Echantillon 1412. C. ANCA/Anti MBG a) Dépistage des ANCA (Immunofluorescence indirecte) La répartition des réponses qualitatives sur cet échantillon qui ne contenait pas d ANCA mais des AAN est la suivante (tableau XXIII) : - 39% de réponses «positives» - 25% de réponses «négatives» - 36% de réponses «ininterprétable». Ce taux de «faux positifs» est vraisemblablement lié à une mécompréhension du masque de saisie. Celui-ci prévoit 2 paragraphes : - Un paragraphe permettant de rendre les résultats du dépistage des ANCA, - Un paragraphe permettant de signaler la suspicion de la présence d AAN et de rendre le résultat de leur dépistage sur Hep2. De ce fait, en cas de présence uniquement d anticorps antinucléaires, la présence de ces anticorps ne doit pas être signalée au niveau du dépistage des ANCA par le choix de la réponse «positive». Une réponse «ininterprétable» est prévue à cet effet. La présence d AAN sera confirmée dans le paragraphe permettant de rendre les conclusions de la recherche des AAN sur HEp2 et/ou de la recherche d ANCA sur formol. Aspect de la fluorescence Ininterprétable Négatif Positif Aucun aspect 1 6 3 Autre aspect atypique 6 2 5 Aspect périnucléaire 9 3 9 Total général 16 11 17 Tableau XXIII. Résultat qualitatif du dépistage des ANCA selon les aspects de la fluorescence - Echantillon 1412. Page 13 sur 18

Réponses à la question «Est-il nécessaire de rechercher des AAN sur HEp2 ou de réaliser la recherche d ANCA sur formol?» : La majorité des laboratoires (38) a jugé nécessaire de rechercher des AAN ou ANCA sur formol dont : - 26 laboratoires qui ont mis en évidence la présence d AAN - 1 laboratoire a mis en évidence la présence d anticorps anti-nucléaires associés à des anticorps P- ANCA - 6 laboratoires qui ont répondu «Ininterprétable» - 5 laboratoires qui n ont pas rendu de conclusion Ces conclusions sont classées en fonction du résultat quantitatif du dépistage des ANCA (tableau XXIX). Résultat du dépistage ANCA Présence d AAN Ininterprétable Conclusion Présence d'aan associés à des anticorps P-ANCA Pas de conclusion Ininterprétable 14 2 Négatif 6 Positif 6 4 1 5 Tableau XXIX. Conclusion rendue à la recherche des AAN selon le résultat qualitatif du dépistage des ANCA- Echantillon 1412. Six laboratoires ont répondu que la recherche d AAN ou d ANCA sur formol n était pas utile. b) Identification des spécificités MPO/PR3 Nous avons recensé 43 réponses pour ces deux anticorps. On observe 100% de bonnes réponses (négatives) dans les deux cas. c) Identification des anticorps anti-membrane basale glomérulaire On observe 100% de bonnes réponses (négatives). Un laboratoire n a pas réalisé la recherche sur cet échantillon. D. Commentaires Concernant les anticorps anti-phospholipides, la remarque pour l échantillon 1411 page 10 sur l influence des modalités de préparation des échantillons sur la dispersion des résultats en intraréactifs du fait d une sensibilité différente des réactifs est également valable pour cet échantillon 1412. Concernant les anticorps anti-cytoplasmes des polynucléaires neutrophiles, les résultats sont bons si on les analyse en tenant compte de la mécompréhension du masque de saisie. Celui-ci sera amélioré pour palier à ce problème et ainsi faciliter le rendu des résultats ainsi que l analyse des réponses. Page 14 sur 18

IV. Echantillon 1413 A. Composition de l échantillon - Absence d anticorps anti-phospholipides - Présence d anticorps anti-cytoplasme des polynucléaires de type anti-pr3. - Présence d anticorps anti-mbg B. Recherche d anticorps anti-phospholipide a) Détection globale des anticorps anti-phospholipides On observe un résultat faussement positif pour l isotype IgG obtenu avec le réactif BMD/THERADIAG PHOSPHO-LISA qui est probablement dû à une erreur de saisi car le titre rendu est de 1 U/ml et le seuil à 15 (tableau XXX). Dosage des anticorps anti-phospholipides- Echantillon 1413 Marqueur IgG Négatif Positif BMD/THERADIAG PHOSPHO-LISA 2 1 ORGENTEC Anti Phospholipid Screen IgG/IgM (réf : ORG 529) 1 ORGENTEC Anti Phospholipid Screen IgG Alegria (réf : ORG 229G) 1 Total général 4 1 Marqueur IgM Négatif BMD/THERADIAG PHOSPHO-LISA 2 ORGENTEC Anti Phospholipid Screen IgM Alegria (réf : ORG 229M) 1 Total général 3 Tableau XXX. Tests globaux de recherche des anticorps anti-phospholipides Echantillon 1413. b) Recherche des anticorps anti-cardiolipine On observe 100% de bonnes réponses (négatives) quel que soit l isotype. c) Recherche des anticorps anti bêta 2 glycoprotéine (β2gp1) L ensemble des participants ont rendu la bonne réponse (négatives) quel que soit l isotype. d) Recherche des anticorps anti-prothrombine On observe 100% de bonnes réponses qualitatives (négatives) quel que soit l isotype étudié. C. ANCA/Anti MBG a) Dépistage des ANCA (Immunofluorescence indirecte) Parmi les 44 participants, 42 laboratoires ont mis en évidence la fluorescence attendue : fluorescence cytoplasmique C-ANCA. Un laboratoire a mis en évidence une fluorescence périnucléaire P-ANCA. On observe un résultat faussement négatif obtenu avec la BIO-RAD Lames ANCA COMBI éthanol/formol (tableau XXXI). La répartition des titres observés est représentée dans la figure 8 : la médiane est à 1/80 avec des titres allant de 1/20 à 1/320. Page 15 sur 18

Aspect de la fluorescence Négatif Positif Aucun aspect 1 Aspect cytoplasmique 42 Aspect périnucléaire 1 Total général 1 43 Tableau XXXI. Résultat qualitatif du dépistage des ANCA selon les aspects de la fluorescence - Echantillon 1413. Nombre de réponse 15 10 5 0 Répartition des titres en inverse de dilution pour l'aspect canca médiane = 80 20 >20 23 40 50 80 160 320 Total 6 5 1 4 1 12 4 2 Figure 8. Titrage des ANCA sur échantillon 1413. Réactif N Médiane Min Max BIO ADVANCE Granulocytes fixés éthanol/formol (réf : 1201-10xx-2) 6 40 20 80 BIO-RAD Lames ANCA éthanol (réf : 29417 / 29416) 3 20 20 80 INOVA Lames de neutrophiles fixées à l'éthanol 10 80 20 320 INOVA NOVA Lite ANCA 4 80 80 160 Tableau XXXII. Résultats quantitatifs 1413 - IFI (Aspect cytoplasmique). Réponses à la question «Est-il nécessaire de rechercher des AAN sur HEp2 ou de réaliser la recherche d ANCA sur formol?» : -41 réponses «Non» -3 réponses «Oui» dont un laboratoire qui a rendu ininterprétable (il a rendu le dépistage ANCA positif avec une fluorescence C-ANCA). b) Identification des spécificités MPO/PR3 Pour les anticorps anti-mpo, on observe un seul résultat faussement positif qui est dû à une inversion d échantillon 1411-1413 (tableau XXXIII). La présence d anticorps anti-pr3 a été mise en évidence par 42 laboratoires sur 43. Le résultat faussement négatif est dû à une inversion d échantillon 1411 1413 (tableau XXXIV). Les résultats quantitatifs des anticorps anti-pr3 sont présentés dans le tableau XXXV. Page 16 sur 18

Négatif Positif Chimiluminescence 2 MENARINI ZENIT RA MPO 2 ImmunoDot 14 BIO ADVANCE EUROLINE MPO + PR3 + GBM (réf : DL 1200-1601-3 G) 2 BMD ANCA MBG DOT (réf : HM025) 4 D-Tek BlueDot ANCA+GBM (MPO/PR3/GBM) 2 EUROBIO ANCA DOT 2 GENERIC ASSAYS GmbH ANCA Dot 2 INGEN ANCA-Goodpasture (MPO/PR3/GBM) 2 Immuno-enzymologie 23 INOVA QUANTA Lite MPO IgG 5 ORGENTEC ANCAcombi (réf : ORG 530) 2 ORGENTEC Anti-MPO (p-anca) Alégria (réf : ORG 219) 6 PHADIA / THERMO FISCHER EliA MPOS Well 10 X-MAP 3 1 BIORAD BioPlex 2200 Vasculitis 1 1 BMD FIDIS VASCULITIS (réf : MX007) 2 Total général 42 1 Tableau XXXIII. Résultat qualitatif de la recherche d anticorps anti-mpo - Echantillon 1413. Négatif Positif Chimiluminescence 2 INOVA QUANTA Flash PR3 1 MENARINI ZENIT RA PR3 1 ImmunoDot 7 BIO ADVANCE EUROLINE MPO + PR3 + GBM (réf : DL 1200-1601-3 G) 1 BMD ANCA MBG DOT (réf : HM025) 2 D-Tek BlueDot ANCA+GBM (MPO/PR3/GBM) 1 EUROBIO ANCA DOT 1 GENERIC ASSAYS GmbH ANCA Dot 1 INGEN ANCA-Goodpasture (MPO/PR3/GBM) 1 Immuno-enzymologie 30 BIO ADVANCE ELISA Anti-PR3 hn hr IgG (réf : EA 1201-9601-2 G) 2 INOVA QUANTA Lite PR3 4 INOVA QUANTA Lite PR3 SC 1 ORGENTEC ANCAcombi (réf : ORG 530) 1 ORGENTEC Anti-PR3 (c-anca) Alégria (réf : ORG 218) 6 ORGENTEC Anti-PR3 hs (réf : ORG 618) 2 ORGENTEC Anti-PR3 hs Alégria (réf : ORG 318) 2 PHADIA / THERMO FISCHER EliA PR3S Well 11 PHADIA / THERMO FISCHER VARELISA PR3 ANCA 1 X-MAP 1 3 BIORAD BioPlex 2200 Vasculitis 1 1 BMD FIDIS VASCULITIS (réf : MX007) 2 Total général 1 42 Tableau XXXIV. Résultat qualitatif de la recherche d anticorps anti-pr3 - Echantillon 1413. Réactif N N* Moyenne ET CV Min Max INOVA QUANTA Lite PR3 4 3 82,70 6,32 7,64 32,4 90 ORGENTEC Anti-PR3 (c-anca) Alégria (réf : ORG 218) 6 5 41,64 6,05 14,53 35,7 79,1 PHADIA / THERMO FISCHER EliA PR3S Well 11 11 44,29 7,19 16,24 32 54 Tableau XXXV. Dosage des Ac anti-pr3 (U/ml) - Echantillon 1413. c) Identification des anticorps anti-membrane basale glomérulaire Les 26 participants ont tous mis en évidence l anticorps anti membrane basale glomérulaire. Le tableau XXXVI présente les résultats quantitatifs. Réactif N N* Moyenne ET CV Min Max ORGENTEC anti-gbm Alégria (réf ORG 250) 6 6 87,00 19,39 22,28 59,4 113,7 PHADIA / THERMO FISCHER EliA GBM Well 5 5 26,60 3,05 11,46 23 31 Tableau XXXVI. Dosage des Ac anti-mbg (U/ml) - Echantillon 1413. Page 17 sur 18

D. Commentaires Concernant les anticorps anti-phospholipides, les résultats sur cet échantillon négatif sont excellents quelle que soit la spécificité et l isotype de l anticorps recherché. Concernant les ANCA, on observe également de très bons résultats : les rares erreurs sont liées au pré-analytique. ***** Rédaction : Dr S. ALBAREDE - s.albarede@ctcb.com Pharmacien Biologiste Dr F. FORTENFANT - fortenfant.f@chu-toulouse.fr Laboratoire d Immunologie - CHU de Toulouse - Hôpital Rangueil Autorisation du rapport d essai d aptitude par le Coordonnateur des programmes : Dr S. ALBAREDE - s.albarede@ctcb.com Pharmacien Biologiste ***** PS : Ces documents doivent être archivés selon les recommandations du GBEA (Arrêté du 26 novembre 1999, paru au JO du 11 décembre 1999). --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Pour tout renseignement : COORDONNATEUR et BIOLOGISTE : Stéphanie ALBAREDE - s.albarede@ctcb.com ADMINISTRATIF : Marie-Christine ONDERBEKE, Tél. : 05.34.51.49.80 - Fax : 01.57.67.25.90 - secretariat.ctcb@ctcb.com ADMINISTRATIF et TRAITEMENT STATISTIQUE : Delphine GARIMBAY, Tél. : 05.34.51.49.81 - d.garimbay@ctcb.com ASSURANCE QUALITE : Erick SANCHEZ, Tél. : 05.34.51.49.82 - e.sanchez@ctcb.com INFORMATIQUE : Philippe GONZALVO - p.gonzalvo@ctcb.com Information : Les essais d homogénéité et de stabilité se sont avérés conformes aux modalités décrites dans la procédure de contrôle. Les documents utilisés pour réaliser ce programme d inter comparaison (préparation des objets d essai, détermination des valeurs indicatives et assignées, traitement statistique, ) sont disponibles sur demande auprès du CTCB. L interprétation de ces résultats ne doit pas se faire isolément et doit être rapprochée de ceux obtenus lors des autres opérations de contrôle effectuées dans le cadre de l évaluation interne et de l évaluation externe du laboratoire. Page 18 sur 18