UTILISATION DE LA LC-MS
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- Michel Simoneau
- il y a 8 ans
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1 UTILISATION DE LA LC-MS
2 Preparation de l échantillon 1 mg de produit dans 1 ml de MeOH, CH3CN ou H2O Placez le septum sur le vial, face bleu (PTFE) coté produit, face blanche vers le haut. Précautions Vérifiez s il y a assez de solvant dans les bouteilles. Si les bouteilles sont vides, remplissez-les avec du solvant de qualité HPLC. L allumage de la chaîne se fait de haut en bas : -le général -les lampes -le passeur -la pompe. NE PAS TOUCHER LA SOURIS ET LE CLAVIER DE L ORDINATEUR AVEC LES GANTS Démarrage Pour ouvrir le logiciel de pilotage de la LC-MS, cliquez sur l'icône HyStar 3.1 située sur le bureau
3 Dans le fenêtre qui s est ouverte, cliquez sur Sample Table. Pour créer une Sample Table, entrez un nom et cliquez sur Open. Sinon ouvrez-en une déjà existante dans votre dossier.
4 La Sample Table ouverte, il faut créer une nouvelle ligne pour votre échantillon. Pour cela, cliquez sur Edit, puis Add New Samples. Dans la partie inférieure de l écran, passez dans l onglet General Donnez un nom à l échantillon à analyser. Indiquez la position du vial. Choisissez le dossier où vous voulez que les données soient enregistrées. Indiquez le volume d injection.
5 Passez dans l onglet Methods Ciquez sur le dossier jaune Dans le fenêtre qui vient de s ouvrir, choisissez une méthode LC/MS. Chacune de ces 4 méthodes est constituées d une méthode HPLC et d une méthode de masse
6 Pour lancer l expérience, cliquez sur Acquisition. Une fenêtre s ouvre pour demander s il on veut enregistrer les modification de la sample table. Répondre yes. Les logiciels Esquire et Hystar Acquisition vont alors s ouvrir automatiquement. Dans la partie supérieure de la fenêtre Hystar Acquisition, on visualise l état des différents éléments intervenant dans la chaîne LC/MS. Le passeur et le détecteur UV se mettent automatiquement en ready (en vert) et, sur la droite, la masse se met sur operate. Dans cette zone, vous retrouvez toutes les informations relatives à l expérience que vous avez remplies précédemment dans la Sample Table. Si vous constatez une erreur, il est possible de modifier les informations en cliquant sur le bouton Sample Table.
7 Passez dans la fenêtre Esquire Vérifiez que la méthode préalablement choisie dans Hystar se soit bien ouverte (.lcms_lcms.m) et que la masse est en mode Operate. Dans la partie droite du logiciel, vérifiez: -La polarité -ICC décoché -Target à 100 -Rolling Averaging décoché Dans l onglet Mode, vérifiez que l'appareil soit en to Source Dans l onglet Tune, vérifiez que la Target Mass soit à 173 Dans l onglet Optimize, vérifiez que la Target Mass soit à 173 Dans l onglet Sample Info, le Sample Name est rempli automatiquement par le logiciel. Il faut remplir le Filename et choisir dans Subdirectory le dossier où vous voulez que les informations soient enregistrées.
8 Retournez dans la fenêtre Hystar Acquisition Il faut maintenant mettre la pompe en marche. Pour cela, faites un clic droit sur pump puis cliquez sur Pump On. Le module de la pompe ainsi que l état général du système Hystar passent en ready (vert). Purge Pour purger les voie, faites à nouveau un clic droit sur pump puis cliquez sur Purge. Choisissez la voie à purger Réglez le Flow à 9 Ouvrez la vanne de purge sur l appareil. cliquez sur Purge On Pour changer de voie, cliquez sur Purge off dans la fenêtre Purge, puis sélectionnez un autre solvant. Quand toutes les voies sont purgées, refermez la vanne de purge. Attention! Avant de fermer la fenêtre de purge, il faut attendre que tous les voyants dans la fenêtre Hystar Acquisition soient redevenus vert.
9 Equilibrage Il faut maintenant attendre que la colonne soit équilibrée. Pour mieux visualiser la pression dans la colonne, vous pouvez changer l échelle du graphique. Pour cela, cliquez sur le bouton Strech. Dans le fenêtre qui vient de s ouvrir, faites varier le factor relatif à la pression. Lors de l acquisition, c est dans cette même fenêtre Strech Chromatogramms que vous pourrez à tout moments modifier l'échelle des autres détections (UV et TIC).
10 Lancez l acquisition Une fois la colonne équilibrée et la pression stable, cliquez sur le bouton Start de la barre d outils. Si vous avez plusieurs échantillons à analyser, cliquez sur Start sequence. Si vous n avez qu un seul échantillon à analyser, cliquez sur Start one acquisition. une fois l'acquisition lancée, tous les instrument impliquées dans l analyse passent en mode run (bleu), que ce soit dans la fenêtre Hystar Acquisition ou dans la fenêtre Esquire.
11 Traitements Deux logiciels permettent de traiter les données : Post Processing (PP) et Data Analysis (DA). Si ces logiciels ne sont pas ouverts, les raccourcis se trouvent : -soit sur le bureau -soit dans la barre d outils de Hystar Acquisition Le logiciel Post Processing sert uniquement à traiter la partie LC de l analyse. Deux possibilités : -soit vous ouvrez le spectre enregistré aux longueurs d onde définies dans la méthode avec une extension.unt -soit vous ouvrez le spectre 2D avec une extension.u2 Sélectionnez l extension voulue dans le Files of types, puis sélectionnez votre analyse. Votre spectre ouvert, pour visualiser les temps de rétention, cliquez sur Process puis sur Peak Detection Pour visualiser les intégrations, cliquez sur Process puis sur Peak Integration Pour changer l échelle du spectre, utilisez ces quatre touches. Pour le rapport, cliquez sur imprimer
12 Le logiciel Data Analysis Décochez tous les fichiers à gauche afin qu ils ne se superposent pas à votre analyse. Ouvrez le fichier avec l extension.d de votre analyse. Ce fichier ouvert, faites un clic droit dans la zone Chromatogram puis cliquez sur Edit Chromatograms. Dans le fenêtre Edit Chromatograms Traces qui vient de s ouvrir, sélectionnez dans le menu déroulant type : UV Chromatogram. Pour caler la détection UV avec la détection masse, tapez 65 s dans le Time offset. Vous pouvez également spécifier la longueur d onde. Cliquez ensuite sur Add puis sur OK Pour voir le spectre de masse d un pic, il faut maintenir un clic droit entre le début et la fin du pic. Lorsque l on relâche le bouton, le spectre apparaît dans le fenêtre du dessous. Pour le rapport, cliquez sur imprimer et choisissez dans le menu déroulant Display Report.
13 Arrêt Lorsque toutes vos analyses sont terminées, fermez la fenêtre Hystar. La fenêtre Close Hystar Application s ouvre. Cliquez sur Yes. Retournez dans la fenêtre Esquire, puis allez dans Method et cliquez sur load-esquirecontrol Part Dans le fenêtre qui vient de s ouvrir, choisissez la méthode : methodeinfusion.m, puis mettez la masse en Standby. Ensuite éteignez la chaîne de bas en haut: - la pompe - le passeur - les lampes - le général
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