COPIE NON GEREE. Utilisation du RTM (Real Time Microscope)

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1 Objet Destinataire (s) CE MICROSCOPE PERMET L NLYSE IN VIVO D OBJETS SNS L JOUT D UCUNE SONDE COLORNTE OU FLUORESCENTE, VEC UNE RÉSOLUTION MÉLIORÉE D UN FCTEUR 2, PR RPPORT À UN MICROSCOPE CHMP LRGE CLSSIQUE. SON PRINCIPE EST CELUI DU CONTRSTE OPTIQUE DU FOND NOIR. DÉPOURVU D OCULIRE, L LECTURE SE FIT DIRECTEMENT DNS L FENÊTRE DE PRÉVISULISTION DU LOGICIEL SSOCIÉ (VOLOCITY ; IMPROVISION) MRI users Historique des modifications uteur Numéro de version Date de modification Escoute Création Modifications Escoute Rédacteur pprobateur Verdeil Page 1 / 25

2 PROTOCOLE D UTILISTION DU RTM 1- PRÉSENTTION DU SYSTÈME 2- METTRE EN MRCHE LE MICROSCOPE, L CMÉR ET LE LOGICIEL D CQUISITION 3- LE MICROSCOPE ET SES CCESSOIRES 3.1- Vue de face 3.2- Vue latérale gauche 3.3- Vue du condenseur 3.4- Comment manipuler le RTM 3.5- Les systèmes d éclairage 3.6- Molette de réglage du condenseur 4- PROCÉDURE D LIGNEMENT DU CONDENSEUR 5- OBSERVTION DES ÉCHNTILLONS 6- PROCÉDURE D OBSERVTION UX OBJECTIFS x40 et x VISULISTION EN DIFFÉRENTS MODES À L OBJECTIF x UTILISTION DE L FLUORESCENCE 9- NETTOYGE DES LENTILLES DU CONDENSEUR ET DES OBJECTIFS PRÈS UTILISTION Page 2 / 25

3 1- PRÉSENTTION DU SYSTÈME FIG 1 Le dispositif comprend, le microscope, la caméra (Sony Tri ccd 640x480 pixels), la box faisant office d enceinte, le cube permettant de réguler la température, le brick régulant le CO 2 et l O 2 et une chambre (Fig 2) permettant l observation en effectuant des perfusions. FIG 2 Page 3 / 25

4 Une station informatique (Fig 3) et un incubateur CO 2 (Fig4) FIG 3 FIG 4 2- METTRE EN MRCHE LE MICROSCOPE, L CMÉR ET LE LOGICIEL D CQUISITION TTENTION : EN FIN DE MNIP SUVEGRDER LES FICHIERS SUR UN DISQUE EXTERNE, LES FICHIERS EN LOCL SUR LE POSTE RTM SERONT RÉGULIÈREMENT EFFCÉS! a- Mettre en marche le microscope (Fig 9), la caméra (Fig 3), le PC, et se connecter sur RIO (Nom et mot de passe) b- Ouvrir le logiciel Volocity (raccourci sur le bureau) c- Choisir l ouverture d une bibliothèque préexistante sur le disque D (Fig 6) ou en créer une nouvelle (Fig 5) Page 4 / 25

5 FIG 5 FIG 6 d- Dans Volocity menu Video/Show video preview, pour ouvrir la fenêtre de visualisation de la caméra (Fig 7 N) e- près optimisation de l image (voir paragraphes suivants), appuyer sur l icône C ou D de manière à capturer l image ou la séquence. Pour arrêter la séquence appuyer de nouveau sur l icône D. Cette image ou cette séquence se placera directement dans la bibliothèque ouverte précédemment. La fréquence de la séquence sera sélectionnée dans la fenêtre O f- Pour exporter une image ou une séquence, la sélectionner dans la bibliothèque et par File/Export et choisir.tiff pour une image et.mov (QuickTime) ou.avi (WMP) pour une séquence. Il existe également sur le site» improvision.com», une version allégée de Volocity qui permet d ouvrir le format propriétaire des bibliothèques. Page 5 / 25

6 FIG 7 -- Barre d outils (ROI, baguette magique, tampon, recadrage, loupe, main, ligne point) B- Visualisation sous différentes formes de la dynamique dans chaque composante de l image C- Icône prise d une image D- icône prise d une séquence E- Icône ouverture/fermeture du shutter uniblitz de l épiillumination F- Richardson contrast : Inversion de la luminance G- Richardson contrast FL ; image en fond noir H- Richardson contrast CT ; Inversion de la chrominance et de la luminance I- Richardson contrast FLCT ; Inversion de la chrominance. J- Réglages du point blanc et du point noir K- Réglages du temps d exposition et du gain L- Indique l objectif utilisé (à régler manuellement) M- Palette de défilement des séquences N- Fenêtre de prévisualisation O- Fenêtre de sélection de la fréquence de prise vidéo Page 6 / 25

7 3- LE MICROSCOPE ET SES CCESSOIRES 3.1- Vue de face FIG 8 Page 7 / 25

8 3.2- Vue latérale gauche FIG 9 Page 8 / 25

9 3.3- Vue du condenseur FIG 10 Page 9 / 25

10 3.4- Comment manipuler le RTM FIG 11 Page 10 / 25

11 3.5- Les systèmes d éclairage FIG 12 Page 11 / 25

12 3.6- Molette de réglage du condenseur FIG13 4- PROCÉDURE D LIGNEMENT DU CONDENSEUR CE PRÉLBLE EST À EFFECTUER EN DÉBUT DE CHQUE UTILISTION a- ppuyer sur le bouton «marche-arrêt» du microscope (Fig 9), et ajuster la luminosité entre 5 et 6 (Fig 9). Le logiciel volocity doit être ouvert comme décrit en 2 b- Monter le condenseur (Fig 10) juste au-dessous de la platine en tournant la vis d ajustement du condenseur (Fig 13) dans le sens des aiguilles d une montre. c- Mettre des gants et déposer une à deux gouttes d huile sur une lame comme indiqué ci-dessous (Fig14), la partie dépolie de la lame doit se trouver sur la face inférieure. La goutte doit être déposée en regard de la jonction de la partie dépolie et non dépolie: Page 12 / 25

13 FIG 14 d- Tout en tenant la lame la renverser rapidement, de manière à ce que la goutte reste suspendue sous la lame, par la tension de surface e- Placer la lame sur la platine dans les maintiens de celle-ci (Fig 8) en manœuvrant les molettes d ajustement en xy (Fig 8),positionner la lame de façon à ce que la goutte soit en regard de la lentille du condenseur, puis enlever les gants (Fig 14) f- Procéder à l alignement du condenseur proprement dit L objectif de grossissement x5 en place, ajuster par les molettes d ajustement en xy (Fig 8), la position de la lame de manière à ce que la partie dépolie recouvre à moitié la surface de la lentille du condenseur, comme indiqué ci-dessous Page 13 / 25

14 vec la partie huilée en place, mettre au point avec les molettes de réglage en z fine et large sur la jonction entre dépoli et non dépoli. juster la luminosité et la mise au point jusqu à ce que la partie dépolie et la limite entre les deux soit claire et nette : Mise au point non correcte Mise au point correcte Mise au point et luminosité correctes En utilisant les molettes d ajustement en xy (Fig 8), modifier la position de la lame pour que la portion dépolie soit entièrement dans le champ avec une mise au point parfaite (voir figure ci- après) g- Le but de cet alignement est d obtenir un cône de lumière parfaitement centré qui va éclairer uniformément le champ d observation. En fermant le diaphragme de champ (Fig 9) on doit obtenir l image suivante : Page 14 / 25

15 Un alignement non correct peut induire des images non concordantes, pour parfaire le réglage agir en différents points : Régler le centrage en se servant des vis de centrage du condenseur (Fig 10) ffiner la hauteur du condenseur en se servant de la molette d ajustement en hauteur de celui-ci (Fig13) En ajustant la hauteur du condenseur de la lame et de la platine, par les molettes de réglage en z (Fig 8). Cet ajustement permet de préciser la mise au point du couple échantillon/lame mais ne modifie en rien le système optique d illumination L ouverture ou la fermeture du diaphragme de champ en opérant sur la molette de réglage de celui-ci (Fig 13) juster l illumination par la molette d ajustement de la luminosité (Fig 9), h- Ensuite ouvrir complètement le diaphragme de champ en agissant sur sa molette (Fig 9), pour obtenir cette image: 5- OBSERVTION DES ÉCHNTILLONS a- Régler la hauteur du condenseur (cf en 4) b- Baisser la platine et en se servant de la molette en caoutchouc noir de la tourelle à objectifs (Fig 15), placer cette dernière dans une position sans objectif Page 15 / 25

16 FIG15 c- Mettre des gants et placer une goutte d huile sous la lame en regard de l objet comme indiqué (Fig 14) d- Enlever les gants e- Mettre en place l objectif du plus faible grossissement (X5), en se servant de la molette en caoutchouc (Fig 15) f- Utiliser la molette de réglage en z large (Fig 8), pour amener la platine au plus près de la distance de travail de l objectif (tableau 1) g- ffiner la mise au point avec la molette de réglage en Z fine (Fig 8) sur l échantillon h- Une fois la mise au point faite à l objectif de faible grossissement, il est possible de passer à des objectifs à plus fort grossissement en se servant de la molette (Fig 15), ajuster la mise au point, il est possible de se servir des graduations gravées sur la molette d ajustement fine en z Page 16 / 25

17 TBLEU 1 6- PROCÉDURE D OBSERVTION UX OBJECTIFS x40 et x100 Ces deux objectifs nécessitent comme milieu intermédiaire de l huile entre leurs lentilles et la lamelle. Ils possèdent un diaphragme ajustable qui permet de régler l ouverture numérique de la lumière collectée par celui-ci (Fig 16). a- Centrer la zone d intérêt dans le champ, au grossissement inférieur b- Baisser la platine de 300 µm (Tourner la molette de réglage fine en z de trois tours, dans le sens antihoraire) c- Baisser l intensité lumineuse (1 à 2) e- Débloquer la tête de l objectif en appuyant dessus et en tournant vers la gauche, avant qu il ne soit au-dessus de l échantillon d- mener la tourelle d objectif à une position vide pour le x100 et entre le x20 et x40 pour le x40 f- Mettre une goutte d huile sur la lamelle au centre d intérêt g- En se servant de la molette (Fig 15) mettre en place l objectif x100 ou x40 h- S assurer qu il y a contact entre l objectif et la goutte d huile et ouvrir le diaphragme de l objectif à moitié i- Ouvrir le diaphragme de champ au maximum j- L intensité lumineuse doit être fixée à une valeur moyenne k- Monter la platine, après environ 100 µm, ajuster l intensité lumineuse de manière à ce que l échantillon apparaisse flou, continuer avec la mise au point en z fine en remontant la platine, jusqu à ce que l échantillon apparaisse focalisé. Page 17 / 25

18 FIG VISULISTION EN DIFFÉRENTS MODES À L OBJECTIF x100 En réglant de manières différentes à la fois l intensité lumineuse, l ouverture du diaphragme de champ et le diaphragme iris de l objectil comme indiqué dans le tableau 2, on obtient du même échantillon des modes différents de visualisation (Fig 17) Page 18 / 25

19 TBLEU 2 Page 19 / 25

20 Instruction C O PI E N O N G ER EE FIG 17 (Cellule humaine de l intérieur de la joue) Page 20 / 25

21 8- UTILISTION DE L FLUORESCENCE Le système comprend un transformateur (X-cite120) qui permet la mise sous tension de la lampe à vapeur de mercure. IL EST NÉCESSIRE DE RESPECTER L CONSIGNE SUIVNTE ; LISSER L LMPE OUVERTE U MINIMUM 20 MINUTES, DE MÊME SI ELLE ÉTÉ ÉTEINTE NE L RLLUMER QU U BOUT DE CE MÊME TEMPS Le shutter de cette lampe est commandée par un autre système (Uniblitz) qui est mis en marche en appuyant sur son bouton de marche/arrêt (Fig 20) La lumière est envoyée vers le RTM et le cube de fluorescence approprié à l observation requise par un guide composé de fibres de verre (Guide lumière fluo Fig 18) La jonction guide/rtm est réaliisée par un joint hermétique (daptateur guide Fig18) Un filtre anti UV, un diaphragme de champ et d ouverture ainsi qu un shutter mamuel complètent le système d épifluorescence (Fig 18) Les cubes de fluorescence utilisés sont de marque LEIC, qui s adaptaient sur les machines type DMRX. FILTRE UV ; BP ; DICHROÏQUE 400 ; LP 425 FILTRE Bleu LP; BP ; DICHROÏQUE 510 ; LP 515 FILTRE Bleu BP; BP ; DICHROÏQUE 505 ; BP 527/30 FILTRE Vert ; BP ; DICHROÏQUE 570 ; LP 580 a- llumer la lampe fluo (120W) en appuyant sur le bouton marche-arrêt de l excite (Fig 19) l intensité de fluorescence peut être ajustée par sa molette de réglage (Fig 18 et 19) b- Mettre sous tension en appuyant sur le bouton marche-arrêt du shutter (Unibliz ; Fig 20) c- Mettre en place le cube de fluorescence correspondant au fluorochrome utilisé en positionnant correctement la tourelle (Fig 21) c- Ouvrir les diaphragmes de champ et d ouverture à fond et mettre en place le filtre BG-38 anti-uv (Fig 18) d- Ouvrir le shutter (Fig 20), après avoir pressé sur l icône d ouverture de l uniblitz dans le logiciel volocity (Fig 22 point rouge) e- Procéder à l observation de l échantillon comme indiqué aux paragraphes 5 et 6 Page 21 / 25

22 FIG 18 Page 22 / 25

23 FIG 19 FIG 20 ) Page 23 / 25

24 FIG 21 FIG NETTOYGE DES LENTILLES DU CONDENSEUR ET DES OBJECTIFS PRÈS UTILISTION Page 24 / 25

25 Nettoyer précautionneusement après avoir mis des gants, la lentille du condenseur, avec un coton tige, trempé au préalable dans de l alcool isopropylique pur. Recommencer jusqu à ce qu il ne reste plus de trace d huile, dans un second temps terminer le nettoyage avec un coton tige dont l excès d alcool aura été au préalable éliminé sur un papier propre. NE PS PPUYER SUR LES LENTILLES, NETTOYER DNS UN MOUVEMENT DE ROTTION DU COTON TIGE Les objectifs à immersion (x40 et x100), doivent être nettoyés de la même façon. Nettoyer également la lentille du port lumineux S il est nécessaire de désinfecter, se servir d alcool isopropylique 70%. Page 25 / 25

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