Formation et biologie des métastases

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1 19/04/2016 PELLAT Andréanne L2 CR : NICOLAS Margot BMCP Pr. OUAFIK 22 pages Formation et biologie des métastases Plan : A. Rappels B. Tumorigénèse I. Principales étapes de la progression métastatique II. Entrée passive ou active des cellules tumorales dans la circulation sanguine III. Événements durant les premières étapes de la cascade métastatique IV. Les interactions entre la cellule tumorale et les cellules hôtes pendant les premières étapes de la cascade métastatique V. Les étapes de l'extravasation VI.Cascade invasion métastase VII. Le lien entre le volume tumoral et le risque de métastase C. Principales étapes de la progression métastatique I. Dissémination tumorale II. Les micro-métastases D. La biologie des métastases I. La E-cadherine II. Les modifications cellulaires et moléculaires associées à l'emt III. Expression des marqueurs et EMT IV. Transformation EMT/MET V. La manifestation de EMT à l'interface tumeur/stroma VI.Les protéases VII. Le rôle du TGF β1 dans l'emt VIII. Similarité entre le signaling EMT durant l'embryogenèse et la progression tumorale E. Le système lymphatique I. Le système lymphatique au niveau de la glande mammaire II. Extravasation via les systèmes vasculaire et lymphatique III. Le ganglion sentinelle F. Les principaux sites métastatiques A. Rappels Lors de la progression tumorale, il y a une interaction entre le micro-environnement et la composante tumorale. Du fait de cette interaction, le micro-environnement devient un partenaire aussi actif que la cellule tumorale. CR : (Le prof n'en a pas parlé mais je vous mets quand même le contenu de sa diapo). La phase de croissance tumorale est exponentielle et nécessite une néoangiogenèse. La masse tumorale peut avoir une croissance in situ ou invasive (avec formation de métastases). 1/22

2 Changement dans les propriétés adhésives des cellules transformées : Dans un organe sain : Il existe une bonne interaction entre les cellules endothéliales et entre les cellules épithéliales qui est assurée par la E-cadherine. L'expression sur ces cellules de l'α5β1 intégrine et de l'α3β1 intégrine assure l'interaction des cellules avec la membrane basale et donc avec le milieu extra-cellulaire. Dans un organe possédant des cellules tumorales : Il va y avoir l'expression d'un répertoire différent de gènes entraînant des modifications telles que la disparition de la E-cadherine et son remplacement par la N-cadherine. Nous avions montré que la E-cadherine jouait un rôle très important dans les interactions homotypiques entre les cellules épithéliales tumorales alors que la N-cadherine va permettre d'assurer une interaction avec des cellules autres que les cellules tumorales. Il y a également expression de nombreuses protéases qui vont permettre à la cellule tumorale de dégrader la membrane basale et la matrice extra-cellulaire. Le système d'intégrines qui était présent est remplacé par un autre système d'intégrines : la αvβ6 intégrine et la α6β4 intégrine qui vont jouer un rôle très important au moment du mouvement de la cellule tumorale vers la vascularisation pour aller atteindre la circulation générale. B. Tumorigénèse Interactions tumeur-stroma : I. Principales étapes de la progression métastatique Lors de la progression métastatique, on a, à ce moment là, une masse tumorale très importante qui possède une bonne vascularisation, stable et nécessaire à la croissance tumorale. Les cellules tumorales présentes dans la masse vont changer petit à petit de phénotype pour essayer de traverser la membrane basale et le stroma tumoral afin d'atteindre la vascularisation. C'est à ce moment là qu'on commence à parler de métastase. On a des cellules épithéliales normales (CR : dans la phase de cancer in situ) ainsi que des cellules tumorales qui ont changé leur phénotype. Ces cellules tumorales ont dégradé la membrane basale et la matrice extra-cellulaire et sont entrées en interaction avec les différentes cellules qui composent le stroma tumoral : c'est le phénomène de progression. 2/22

3 Après cela il y a le phénomène d'invasion qui va permettre d'orienter les cellules tumorales vers la vascularisation permettant la migration des cellules. Il va ensuite se réaliser l'intravasation qui peut être active ou passive selon la proximité de la masse tumorale vis à vis de la vascularisation. Lors de l'arrivée des cellules tumorales au niveau de la vascularisation il va y avoir un contact qui va se faire entre la cellule tumorale avec la membrane basale, la matrice extra-cellulaire. L'intravasation correspond au passage de la cellule tumorale dans la circulation sanguine. Les cellules vont circuler grâce au sang pour atteindre les sites métastatiques. Cependant une grande partie des cellules va mourir car elles ne vont pas supporter le courant sanguin si elles ne changent pas de phénotype. En effet, si elles restent avec leur phénotype initial épithélial, plus de 99% des cellules tumorales vont mourir, les cellules restantes vont pouvoir atteindre les sites métastatiques une fois qu'elles auront subi l'extravasation. L'extravasation correspond au moment où la cellule tumorale quitte la circulation sanguine pour aller atteindre les niches secondaires afin de former des micro-métastases voire des macro-métastases. II. Entrée passive ou active des cellules tumorales dans la circulation sanguine La cellule tumorale peut atteindre la circulation sanguin soit de manière : Passive : c'est un contact physique entre la masse tumorale et la vascularisation si elle se trouve à proximité. Les cellules tumorales vont continuer à proliférer et à un moment donné elles vont entrer en contact sans le vouloir avec la vascularisation. À force de pousser à cause de leur prolifération il va y avoir une déchirure de la paroi vasculaire ce qui va permettre à ces cellules tumorales de pénétrer dans la circulation sanguine. 3/22

4 Active : ce sont les cellules tumorales qui ont pu changer leur phénotype (passage du phénotype épithélial au phénotype mésenchymateux) leur donnant une grande facilité pour migrer à travers le stroma au contact avec les cellules normales (CR : qui forment le stroma tumoral) afin d'atteindre la circulation sanguine. On retrouve alors dans la vascularisation : des cellules épithéliales qui correspondent aux cellules tumorales circulantes (CTC). ainsi que des cellules tumorales circulantes ayant pu changer leur phénotype se présentant comme des cellules mésenchymateuses. Cette migration se réalise à l'aide des enzymes protéolytiques (MMPs) qui vont aider la cellule tumorale en dégradant la matrice et les différents obstacles physiques afin de leur de tracer une route jusqu'à la circulation sanguine La majorité des cellules ayant atteint la vascularisation de manière passive finiront par mourir à cause des interactions fortes dans la circulation sanguine. À l'inverse les cellules ayant atteint la vascularisation de manière passive vont être à l'origine de l'initiation du phénomène métastatique. CR : Le changement de phénotype pour un phénotype mésenchymateux va donner un pouvoir très important à la cellule en circulation pour atteindre la paroi interne de la vascularisation et s'y arrêter, traverser la composante endothéliale pour aller former une micro-métastase qui va pouvoir devenir ensuite une macro-métastase. III. Évènements durant les premières étapes de la cascade métastatique 0min : intravasion 2 5min : transit 7h 24h après l'intravasation : arrêt au niveau de la paroi interne du vaisseau 3 5 jours : extravasation quelques semaines à des années : début d'un dialogue entre la cellule tumorale avec le milieu extracellulaire qu'elle ne connaît pas (foie? Cerveau? Os? Rein?) pour ensuite former une tumeur secondaire appelée métastase. Si c'est en quelques semaines on dit que c'est actif car c'est très rapide, cela signifie que le microenvironnement possède un milieu propice pour une nouvelle croissance tumorale au moment de l'arrivée de la cellule tumorale (CR : le milieu est hospitalier pour la tumeur). La maladie va alors évoluer très vite. Si l'environnement n'est pas propice lors de l'arrivée de la cellule tumorale cela peut alors prendre des années et des années. C'est pour cela que l'on dit que l'environnement joue un rôle très important dans la prolifération tumorale primitive comme métastatique. 4/22

5 IV. Les interactions entre la cellule tumorale et les cellules hôtes pendants les premières étapes de la cascade métastatique La cellule tumorale circulante va, dès qu'elle rentre dans la circulation, interagir avec les plaquettes, les neutrophiles, les monocytes, les macrophages.. Les plaquettes vont encadrer la cellule tumorale afin d'essayer de la protéger vis à vis des différents signaux négatifs venant des autres types cellulaires de la circulation sanguine surtout ceux venant des cellules immunitaires. À force d'interagir avec les plaquettes, à un moment donné il va y avoir la formation d'une thrombose dans certaines régions vasculaires qui vont faire qu'il va y avoir un premier contact de la cellule tumorale avec la paroi interne de la cellule endothéliale qui forme donc la vascularisation. CR : il y a instauration d'un dialogue entre la cellule tumorale et les plaquettes et autres types cellulaires. Au moment de cet arrêt, à cause de la pression qui sera mise sur la cellule tumorale provenant des micro-thrombose, la cellule va trouver un chemin afin de quitter la vascularisation. Le phénotype mésenchymateux va permettre de faciliter le passage de la cellule tumorale en dehors de la vascularisation. La cellule va sortir de la circulation sanguine à travers la paroi et entrer en contact avec le mésenchyme. La cellule va alors créer un dialogue avec l'environnement et être à l'origine de micro-métastases soit à ce niveau là soit plus loin après avoir migré grâce aux enzymes protéolytiques qui vont permettre de former un chemin dans la matrice jusqu'aux niches. Elle va ensuite être à l'origine de micro-métastase qui va par la suite donner lieu à une tumeur secondaire ressemblant à la tumeur primitive. 5/22

6 V. Les étapes de l'extravasation (A) Cellule cancéreuse qui est dans la circulation sanguine. (B) Plaquettes qui entourent la cellule cancéreuse. (C) Formation de la micro-thrombose. (D) Contact de la cellule cancéreuse avec les cellules endothéliales suite à la pression provenant de la micro-thrombose. (E) Interaction de la cellule cancéreuse avec les cellules endothéliales et le micro-environnement. (F) Formation de la métastase soit en continuant à proliférer à l'intérieur du vaisseau soit en migrant dans des niches (CR : à ce moment là, la cellule quitte la vascularisation et ne se met à proliférer qu'après). VI.Cascade invasion métastase On a la tumeur primitive avec sa vascularisation stable et fonctionnelle (CR : grâce au phénomène d'angiogenèse) qui joue un rôle très important dans la prolifération tumorale. En zoomant, nous pouvons observer le contact entre la cellule tumorale et la vascularisation.ce contact va permettre l'intravasation passive ou active de la cellule. La cellule dans la circulation, va atteindre, par la voie veineuse, le tissu cardiaque qui va à ce moment là propulser les cellules tumorales dans la circulation générale, permettant aux cellules d'atteindre d'autres organes (comme le poumon, l'os, le cerveau). Lorsque la cellule arrive au niveau de l'organe il va alors y avoir le phénomène d'extravasation et la formation de micro-métastase ou de macro-métastase. Il existe une très grande similarité entre la tumeur primitive et les métastases (CR : phénotypiquement parlant, c'est presque la même chose). La seule différence qu'il peut y avoir est au niveau du plan génotypique : au niveau de la tumeur primitive il va y avoir plusieurs clones de cellules tumorales, mais il peut y avoir une sélection clonale lors du voyage des cellules tumorales qui ne va pas permettre à tout les clones de se retrouver dans les métastases mais uniquement ceux qui auront résisté au changement d'environnement. 6/22

7 VII. Le lien entre le volume tumoral et le risque de métastase Pour une masse tumorale primitive de moins de 1cm, il y a 22% de chances d'avoir des métastases. Pour une masse tumorale primitive de plus de 10cm, il y a 77% de chances d'avoir des métastases. Ex cancer du sein : si la tumeur primitive est < 1cm : on va trouver seulement 4% de cellules possédant la mutation p53 (CR : on rappelle que p53 est le gendarme au niveau du cycle cellulaire. Si elle subit des mutations ou des délétions, elle devient non-fonctionnelle et va donc laisser passer les différentes altérations sans les réparer). si la tumeur primitive est d'environ 3cm : on va trouver entre 40 et 50% des cellules possédant la mutation p53 Il existe donc une logique entre les altérations génétiques, la masse tumorale et la formation de métastases. C'est la règle générale en pathologie. Il existe une exception à cette règle : c'est le cas des mélanomes car la tumeur est tellement petite que l'on a l'impression qu'elle n'a pas bougé mais en réalité lorsqu'on cherche les cellules tumorales circulantes dans la circulation sanguine, on trouve alors de nombreuses métastases alors que la tumeur est de très petit diamètre. C. Principales étapes de la progression métastatique I. Dissémination tumorale 1) Le PETscan L'image est obtenue grâce à un PETscan. Le PETscan : Positron Emission Tomography, est basé sur l'utilisation de Fluoro 18 couplé à la molécule de glucose (CR : c'est le FDG). C'est donc du sucre que l'on a marqué avec du Fluoro18 radioactif possédant une demi très très courte. Le PETscan nous renseigne sur l'activité métabolique cellulaire. Or la cellule tumorale est une cellule possédant une prolifération très importante et un métabolisme très actif, elle va donc par rapport à une cellule normale consommer beaucoup plus de sucre. 7/22

8 Le métabolisme dans le corps du patient va pouvoir être suivi en lui injectant le FDG18. Cette injection va nous permettre de distinguer l'organe ayant un métabolisme normal aux organes possédant une tumeur ou une métastase. Le cerveau apparaît comme possédant beaucoup de FDG, c'est physiologique (CR : puisque le cerveau consomme de façon normale beaucoup d'énergie). Le PETscan n'est donc pas utilisé pour détecter les tumeurs cérébrales on utilise plutôt l'irm. Par contre pour le reste du corps le PETscan est très utilisé, sur cette image il révèle les métastases présentes chez la personne (taches blanches). Exemples : Présence de cellules d'îlots de pancréas au niveau du vaisseau lymphatique On observe des cellules qui ont métastasé à l'intérieur du système lymphatique, elles vont pouvoir soit migrer à l'intérieur de l'organe soit continuer à proliférer et entraîner la fermeture de ce conduit et donc l'arrêt de la circulation. Présence de cellules cancéreuses au niveau de la moelle osseuse On prélève de la moelle osseuse et on cherche le marqueur des cellules épithéliales qui n'est pas présent sur les cellules mésenchymateuses. Pour cela, on utilise soit des anticorps soit le marqueur bleu GIEMSA. Ils permettent de révéler le nombre de métastases présentes dans la moelle osseuse. 2) Les différents modèles d'invasion Exemples : Le cancer du sein : A gauche : la tumeur A droite : les cellules commencent à migrer Le bleu (clair) correspond au stroma et le marron (plus foncé) correspond aux cellules tumorales. Les cellules tumorales se présentes sous la forme de file indienne lors de leur migration. 8/22

9 Le mélanome : Le rouge correspond à la E-cadherin Le bleu correspond au collagène A droite il y a le front de migration : on voit qu'à fur et à mesure que les cellules tumorales migrent, elles digèrent tout ce qui est autour (le collagène) pour se créer un chemin de migration. Le changement du phénotype épithélial des cellules vers un phénotype mésenchymateux va être à l'origine du changement du statut d'expression des intégrines. Ces nouvelles intégrines sont utilisées par la cellule tumorale comme un point d'attache à la matrice cellulaire afin d'avancer. La migration des cellules tumorales se réalisent grâce aux: protéases qui vont dégrader la matrice cellulaire intégrines qui vont être le point d'attache sur la matrice cellulaire et qui vont donc permettre la migration 3) Les routes majeures de la circulation sanguine chez les mammifères Le sang veineux passe au travers de différents organes dont l'organe possédant la tumeur primitive. Les cellules tumorales qui ont pu atteindre la vascularisation vont arriver à ce moment là au niveau du ventricule droit du cœur puis vont passer dans la circulation pulmonaire avant d'arriver dans le ventricule gauche où elles seront propulsées de nouveau dans la circulation générale. Avant que le sang n'arrive dans le ventricule gauche, les cellules tumorales vont devoir d'abord traverser la circulation pulmonaire. Les cellules tumorales possèdent-elles la capacité de traverser le poumon? Les cellules tumorales circulantes possèdent un diamètre deux fois plus grand que celui des plaquettes. Or les plaquettes possèdent une sorte de plasticité qui va leur permettre de traverser différents types de vascularisation : elles peuvent faire des virages, subir des déformations pour traverser la vascularisation. Ex : Capacité de déformation des plaquettes (photo) Cependant les cellules tumorales ne peuvent pas réaliser ce type de déformations, ainsi lorsqu'elles se retrouvent au niveau d'un angle de 90 environ, elles ne pourront pas réaliser le virage, elles vont alors rester coincées à ce niveau là, rentrer en contact avec la paroi et commencer à proliférer à l'intérieur du vaisseau. 9/22

10 II. Les micro-métastases 1) La détection des micro-métastases dans la moelle osseuse On utilise pour les détecter des anti-corps spécifiques. Ex : Les cellules du cancer du sein : Les cellules du cancer du colon : 2) L'hétérogénéité génétique des micro-métastases et leurs évolutions Expérience : On a injecté à des animaux des cellules tumorales, on les a laissé proliférer entraînant la formation de métastases. On enlève ensuite la tumeur primitive aux animaux en leur laissant dans leur circulation des cellules tumorales. Le but est de savoir si l'animal va au bout de quelques mois développer des métastases. Ici, lorsque l'on enlève la tumeur primitive, on a une idée sur la clonalité de la tumeur : notre tumeur possède différents clones présentant différentes mutations (représentées ici par différentes couleurs). À un moment donné les différents clones vont quitter la tumeur primitive. Lors de la formation des métastases on remarque que seuls quelques clones sont présents. Il y a une sorte de sélection qui a eu lieu lors de la traversée de la vascularisation par les différents clones : ce sont les clones qui ont su survivre qui seront présents de manière majoritaire dans les métastases alors que les autres clones qui n'auront pas su survivre seront soit totalement absents, soit présents de manière minoritaire. La métastase va former un site tumoral secondaire qui va alors être aussi à l'origine, à partir d'un certain volume, de métastases. Le clone qui était majoritaire lors de la première métastase va : garder sa capacité particulière puisqu'il a su s'adapter et permettre la formation d'une métastase dans un nouvel environnement rester majoritaire dans les autres métastases formées à partir du site tumoral secondaire. 10/22

11 Il y a donc une sélection génotypique qui se réalise depuis la tumeur primitive jusqu'à la métastase. Au final, on remarque que de nombreuses mutations génotypiques présentes dans la tumeur primitive ne sont pas retrouvées dans les métastases. Il y a donc une sélection clonale qui se réalise avec le temps. 3) Les cellules tumorales dormantes Ce sont des cellules tumorales présentes dans un tissu qui ont proliféré deux-trois fois puis qui se sont arrêtées. Lors d'un contrôle au bout de trois mois, on observe que l'intensité de la fluorescence de ces cellules est inchangée... À partir de là, on considère alors que l'on a des cellules cancéreuses dormantes qui n'ont pas trouvé un environnement propice pour proliférer. Ces cellules ne sont pas mortes : en effet expérimentalement lorsqu'on les remet en culture cellulaire en présence d'un milieu propice, on remarque qu'elles commencent à proliférer. Ces cellules dormantes vont donc rester comme ça dans l'environnement, ou elles vont se mettre à proliférer si l'environnement devient propice un jour suite à un changement. D. La biologie des métastases Pourquoi une cellule épithéliale cancéreuse décide-t-elle de partir? Quels sont les mécanismes moléculaires qui ont font que cette cellule a acquis la capacité de bouger pour quitter sa localisation tumorale primitive, et aller s'installer ailleurs? I. La E-cadherine 1) Le rôle de la E-cadherine La E-cadhérine joue un rôle très important dans l'interaction entre les cellules épithéliales et les cellules tumorales, jusqu'au jour où la cellule épithéliale décide de quitter le lieu. À ce moment là, la cellule tumorale ne va plus exprimer de E-cadherine et va exprimer la N-cadherine. La N-cadherine, va permettre à la cellule tumorale de rentrer en interaction avec d'autres types cellulaires. Ex :La tumeur colorectale A gauche : C'est la tumeur primitive, on réalise une immunohistochimie avec la E-cadherine Le bleu correspond au noyau Le cytoplasme est blanc Le tour est marron, c'est la membrane plasmique avec la présence de E-cadherine à la surface 11/22

12 A droite : C'est toujours une tumeur primitive, au fur et à mesure que l'on quitte la tumeur primitive pour aller vers le front de migration, on observe une diminution de la coloration du marquage de la E-cadherine. Cela signifie clairement que le jour où la cellule tumorale décide de quitter la tumeur primitive, elle arrête l'expression de la E-cadherine pour aller rencontrer d'autres types cellulaires. Il existe plusieurs façons d'arrêter l'expression de la E-cadherine. RAPPEL : La E-cadherine est une protéine qui possède un rôle très important dans les jonctions adherens. Cette interaction entre les deux cellules se fait grâce à : deux cadhérines présentes de part et d'autre de la jonction : chaque cellule présente une cadhérine. la présence des caténines : α caténine et la β caténine, qui interagissent avec la E-cadherine du coté cytoplasmique, qui elle-même interagit avec le cytosquelette. Lors de la perte de la E-cadherine, la β caténine n'a plus d'appui, elle ne peut plus interagir avec la E-cadherine. Cette perte d'interaction va entraîner la présence de α caténine et de β caténine libres dans la cellule qui peuvent : être ubiquitinylées et être dégradées par le système du protéasome être transloquées dans le noyau (le plus souvent) pour aller rencontrer les facteurs de transcription (Tcf, LEF TFs) entraînant la mise en place d'un complexe de transcription actif pour les gênes cibles du complexe. On passe donc d'une molécule de structure à une molécule d'activation nucléaire. 2) Le contrôle de l'expression de la E-cadherine Répression de la transcription par Snail, Slug, SIP1, Twist, def1, E12/E47 : Rôle important dans l'arrêt de l'expression de la E-cadherine, si on sur-exprime un de ces facteurs de transcription, en moins de 24h il n'y a plus de E-cadherine qui sera exprimée. Ces facteurs de transcription jouent un rôle très important dans la transition épithélialemésenchymateuse. Mutation de la β caténine : Plus d'interaction avec la E-cadherine Clivage protéolytique du domaine extracellulaire de la E-cadherine par les MMPs : Il n'y aura donc plus d'interaction avec les autres cellules. Perturbation du cytosquelette Augmentation de la dégradation intracellulaire Perte de la E-cadherine pour être remplacée par la N-cadherine : C'est le «Cadherin Switch», associé au phénotype observé in vitro : EMT (CR : EMT = transition épithélio-mésenchymateuse). 12/22

13 II. Les modifications cellulaires et moléculaires associées à la EMT Perte : de la cytokératine qui est spécifique aux cellules épithéliales de la E-cadherine de la polarité La cellule tumorale va gagner beaucoup en passant d'un phénotype épithélial à un phénotype mésenchymateux : phénotype proche de celui des fibroblastes mobilité invasion expression des gènes trouvés spécifiquement dans le phénotype mésenchymateux grâce aux facteurs de transcription forte expression de la N-cadherine sécrétion de protéase : MMP2, MMP9 expression de la vimentine expression de fibronectine pour que la cellule tumorale puisse migrer expression du récepteur de PDGF expression de αvβ6 intégrine III. Expression des marqueurs et EMT 1) L'immunofluorescence La E-cadherine, la β caténine, la γ-caténine sont des marqueurs caractéristiques de la cellule épithéliale. On utilise deux vecteurs : Le vecteur contrôle : il ne possède rien, il permet de vérifier l'expérience. Le vecteur possédant le facteur de transcription Twist reconnu comme jouant un rôle important dans la transformation épithéliale-mésenchymateuse. La sur-expression de Twist va être à l'origine de l'arrêt de la transcription de la E-cadherine, de la β caténine et de la γ-caténine. Ainsi on observe que chez les cellules possédant le vecteur contrôle on a l'expression de la E-cadherine, de la β caténine et de la γ-caténine, alors que chez les cellules possédant le vecteur Twist, il y a absence de l'expression de la E-cadherine, de la β caténine et de la γ-caténine. Leur expression a été réprimée par le facteur de transcription Twist. La fibronectine et la vimentine sont des marqueurs caractéristiques de la cellule mésenchymateuse. 13/22

14 On utilise les deux mêmes vecteurs : Le vecteur contrôle : il ne possède rien, il permet de vérifier l'expérience. Le vecteur possédant le facteur de transcription Twist reconnu comme jouant un rôle important dans la transformation épithéliale-mésenchymateuse. On observe chez les cellules possédant le vecteur contrôle qu'il n'y a pas d'expression de la vimentine et de la fibronectine mais que chez les cellules possédants le vecteur Twist, il y a l'expression de la vimentine et de la fibronectine qui est favorisée par le facteur de transcription Twist. La transition épithéliale-mésenchymateuse entraîne l'activation du facteur de transcription Twist, avec pour conséquence une perte de l'expression de la E-cadherine, de la β caténine et de la γ-caténine et l'expression de la fibronectine et de la vimentine. 2) Western Blot 1er cas avec les marqueurs spécifiques des cellules épithéliales Dans les cellules contrôles en absence de Twist, il y a : absence de protéine Twist présence de E-cadherine, α caténine, β caténine, γ-caténine et de β actine Dans les cellules possédant Twist, il y a : absence de E-cadherine, α caténine, γ-caténine présence de Twist, de β caténine faiblement et de β actine CR : La présence de Twist va entraîner la disparition des éléments spécifiques des cellules épithéliales. La β actine est une protéine standard qui est utilisée pour montrer qu'il y a bien des protéines présentes dans les deux cas de figure. 2ème cas avec les marqueurs spécifiques des cellules mésenchymateuses Dans les cellules contrôles en absence de Twist, il y a : absence de Twist, de N-cadherine, d'α-sm-actinine présence de faiblement de fibronectine et de vimentine et présence normale de β actine Dans les cellules possédant Twist, il y a présence de Twist, surexpression de fibronectine, de vimentine, de N-cadherine (CR : la N-cadherine est nouvellement exprimée puisqu'elle était complètement absente de la cellule sans Twist), d'α-sm-a et de β actine 14/22

15 Sur le point moléculaire : en présence d'un micro-environnement propice, les facteurs de transcription vont être exprimés et vont inhiber l'expression des marqueurs de la composante épithéliale et stimuler l'expression des marqueurs de la composante mésenchymateuse. La conséquence de ce switch : La E-cadherine permet l'interaction entre le mélanocyte et le keratinocyte Lors de la bascule vers le phénotype mésenchymateux, le kératinocyte ne peut plus interagir avec le mélanocyte car il n'exprime plus la Ecadherine Rien qu'en changeant le panel d'expression de différents marqueurs, la cellule peut changer totalement de partenaire. Elle quitte son environnement et part interagir avec les différents types de cellules qui composent le stroma grâce à la N-cadherine. IV. La transformation EMT/MET La cellule sous le phénotype mésenchymateux ne pourra pas proliférer et donner des métastases, c'est la raison pour laquelle elle se retrouve dans l'obligation de subir une nouvelle transition mais cette fois ci de type mésenchymateuse-épithéliale (CR : MET) pour qu'elle puisse former des métastases. Ce phénomène est tellement important que les boites pharmaceutiques s'intéressent de très près à des médicaments empêchant cette transformation mésenchymateuse vers le phénotype épithélial. En effet, on remarque qu'entre 30 et 40% des patients, lorsqu'ils se présentent, sont déjà métastatiques. Et si il n'y a pas de métastases, il y a au moins des cellules tumorales circulantes. Tant que ces cellules n'ont pas subi le processus 15/22

16 de transformation mésenchymateux vers le phénotype épithélial, on peut empêcher la formation de métastases en stoppant cette transformation. C'est pour cette raison, qu'il y a des médicaments en cours d'essai pour stopper cette transformation. On peut donc dire qu'il existe une sorte de réversibilité du système EMT : Ex : Tumeur primaire : présence de marquage de la E-cadherine au niveau membranaire Front d'invasion : absence de marquage de la E-cadherine au niveau membranaire du à la EMT. Métastase : présence de marquage de la E-cadherine au niveau membranaire du à la MET, on obtient exactement la même chose que dans la tumeur primitive. Ex d'un cancer du sein ayant donné une métastase cérébrale. Tumeur primitive : présence de marquage nucléaire par le récepteur d'œstrogènes et marqueur membranaire par HER2 Métastase : présence de marquage nucléaire par le récepteur d'œstrogènes et marqueur membranaire par HER2 Le marquage est identique (CR : il y a donc une ressemblance entre la tumeur primitive et la métastase). V. La manifestation de EMT à l'interface tumeur/stroma Cette manifestation de EMT se trouve surtout au niveau du front de l'invasion, ce sont les cellules au contact entre le stroma et le tumeur qui vont subir cette transformation. Ce sont ces cellules qui sont concernées car il y a besoin de nouer un dialogue et de casser les différentes structures de la matrice cellulaire qui les empêchent de bouger. Il y a un changement de l'expression des intégrines : on passe de l'α5β1intégrine et α3β1 intégrine à la αvβ6 intégrine et la α6β4 intégrine. On retrouve la αvβ6 intégrine au niveau du front de migration de la tumeur. Ce sont les cellules au contact entre le stroma et la tumeur qui vont subir en premier l'emt. C'est donc le contact entre le stroma et la cellule tumorale qui est à l'origine de la transition épithéliale-mésenchymateuse. 16/22

17 La vimentine est une marqueur mésenchymateux et la cytokératine est un marqueur épithélial. On remarque que les cellules tumorales qui ne sont pas en contact avec le stroma gardent leur phénotype épithélial (présence de cytokératine) alors que les cellules tumorales en contact avec le stroma changent de phénotype, commencent à exprimer la vimentine, perdent l'expression de la cytokératine. Les cellules de la tumeur en contact avec le stroma possèdent de la vimentine alors que celles qui ne sont pas en contact avec le stroma n'en possèdent pas. Ce sont les cellules tumorales en contact avec le stroma qui vont réaliser la transformation. Le contact avec le stroma joue donc un rôle très important dans le changement de phénotype épithélial vers le phénotype mésenchymateux. VI.Les protéases 1) Les métalloprotéases Leur rôle correspond à la dégradation de la matrice cellulaire, elles sont sécrétées lors de la migration métastatique. 17/22

18 2) Mécanismes d'activation des pro-protéases en protéases actives Les cellules du stroma vont libérer la pro-upa (Urokinase Plasminogène Activateur). Le récepteur de l'upa se situe au niveau de la cellule cancéreuse. La pro-upa exprimée par la cellule stromale va être reconnue par le récepteur présent sur la membrane plasmique de la cellule cancéreuse et va être activée par le récepteur lui même : on obtient alors de l'upa. L'uPA va à son tour, dans l'espace extra-cellulaire, dégrader le plasminogène en plasmine. Le plasminogène correspond à la forme inactive de l'enzyme plasmine. La plasmine une fois active va jouer alors deux rôles : elle va rendre active la forme latente du TGF β1 en TGF β1activé elle va activer en même temps différentes enzymes présentes sous la forme de pro-mmps (inactives) en les dégradant pour les faire devenir des MMPs (actives) : ces MMPs vont dégrader la matrice extra cellulaire et permettre à la cellule tumorale d'avancer. Grâce à l'interaction de la cellule cancéreuse avec les cellules du stroma, la cellule cancéreuse va pouvoir sécréter des MMPs afin de dégrader la matrice extra cellulaire et réaliser sa migration. VII. Rôle du TGF β1 dans la EMT 18/22

19 On prend des cellules épithéliales que l'on marque avec la E-cadherine (gris clair), on traite ces cellules pendant 7 jours avec le TGF β1. Au 7ème jour, on arrête la prolifération cellulaire et le traitement, on fixe les cellules et on fait de l'immunohistochimie pour la E-cadherine. On observe alors que les cellules épithéliales contrôle expriment toujours la E-cadherine mais que la majorité des cellules que l'on a traité avec le TGF β1 ont perdu l'expression de la E-cadherine. Le TGF β1 doit donc jouer un rôle dans la EMT surtout pour les cellules tumorales qui sont dans le front d'interaction avec le stroma. L' αvβ6 intégrine est un des marqueurs de la cellule épithéliale, on remarque la présence du TGF β1dans le stroma au contact de la cellule tumorale. VIII. Similarité entre le signaling EMT durant l'embryogenèse et la progression tumorale Il existe une ressemblance frappante au niveau du signaling EMT avec l'embryologie surtout au niveau de l'inhibition de la E-cadherine grâce au facteur de transcription qui permettent la mise en route de l'emt. 19/22

20 E. Le système lymphatique I. Le système lymphatique au niveau de la glande mammaire Sur cette image nous pouvons voir les différents ganglions présents au niveau de la glande mammaire. La glande mammaire est une glande qui est très riche en réseaux vasculaires et lymphatiques. La cellule tumorale peut donc avoir le choix entre ces deux réseaux. II. Extravasation via les système vasculaire et lymphatique En haut c'est la voie vasculaire et en bas c'est la voie lymphatique. Au niveau de la voie lymphatique c'est exactement le même phénomène qui va se réaliser que celui dans la voie vasculaire vu précédemment. La voie lymphatique va mener jusqu'à un ganglion, et par le système de pompage on va avoir à un moment donné tout ce qui a été récolté par la voie lymphatique qui va se retrouver dans la circulation générale. III. Le ganglion sentinelle On a la tumeur qui est à droite. On va prendre une couleur bleue que l'on injecte au sein de la tumeur. C'est la méthode qui est utilisée par les anapaths pour localiser les ganglions. On attend que le produit emprunte la route lymphatique nous permettant alors de détecter le ganglion sentinelle. Une fois qu'il est récupéré, le ganglion est fixé, et on recherche des métastases. Présence de micro-métastases dans un ganglion sentinelle. 20/22

21 Marquage à la cytokératine pour mettre en évidence la présence de cellule tumorale à l'intérieur du ganglion sentinelle. F. Les principaux sites métastatiques Les principaux sites métastatiques sont le cerveau, les poumons, le foie et la moelle osseuse. On trouve 80% des métastases dans ces 4 zones et cela est du à des raisons physiques (premier passage, difficulté de circulation des cellules cancéreuses qui vont rester coincées dans des régions). La taille de la flèche renseigne sur la probabilité des tumeurs primitives à faire des métastases dans l'organe pointé. Le foie est beaucoup touché par les cancers du pancréas ou du colon du fait que le sang de ces organes passent dans un premier temps dans le foie avant de rejoindre la circulation générale, qui a un rôle de filtre. 21/22

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