Recherche h sur les MALADIES NEUROMUSCULAIRES
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1 Recherche h sur les MALADIES NEUROMUSCULAIRES Jacques P. Tremblay. PhD Université Laval Québec, Canada
2 LA RECHERCHE PROGRESSE BONNE NOUVELLE
3 Bonne nouvelle #1 Le progrès dans la capacité de séquencer le génome facilite l identification des gènes mutés
4 Le projet Génome Humain Durée: 13 ans ( ) Coût: $ 3 milliards Grosseur: 3.3 milliards de nucléotides Code pour gènes
5 Séquencage à haut débit 100, nucléotides / seconde Permet à un laboratoire de séquencer un génome humain en 3 jours pour $1000. Ceci a permis d identifier des mutations responsables de 7000 maladies héréditaires.
6 Bonne nouvelle #2 La thérapie génique progresse
7 Thérapies géniques pour les maladies héréditaires 1) Livrer le gène normale pour compenser pour le gène muté Possible pour les maladies récessives Livraison par: des cellules normales ou corrigées génétiquement des plasmides des vecteurs viraux 2) Corriger l ARNm avec des oligonucléotides Saut d exon 3) Corriger le gène muté TALENs CRISPR
8 Exemples de succès de la thérapie génique chez l'homme avec rétrovirus et lentivirus Syndrome d'immunodéficience défi i acquise (ADA-SCID) Garçons bulles traités avec des cellules souches hématopoïétiques génétiquement corrigées avec des rétrovirus ou avec des lentivirus
9 Virus Associé à l Adénovirus (AAV) 25 nm
10 Exemples de succès de la thérapie génique chez l'homme Amaurose congénitale de Leber (cécité héréditaire) traitée par injection d un AAV encodant le gène RPE65
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12 Autres exemples de succès de la thérapie génique chez l'homme Carence en lipoprotéine lipase. Le Glybera, le premier traitement de thérapie génique approuvé par le Comité des médicaments à usage humain de l'agence européenne des médicaments. Le traitement a été développé en Hollande par le Dr. Daniel Gaudet de Chicoutimi L'hémophilie de type B Publié en Décembre 2011 (groupe du Dr High) utilise une injection systémique d un AAV codant pour le facteur IX
13 DÉVELOPPEMENT DE TRAITEMENTS POUR LA DYSTROPHIE DE DUCHENNE
14 Livraison du gène de la micro-dystrophine Un essai clinique de livraison du gène de la micro- dystrophine avec un AAV a été fait par le groupe du Dr. Mendell. Malheureusement aucun succès
15 Le saut d exon Cette méthode ne peut s appliquer qu à des gènes qui ont plusieurs exons. Il faut que l on puisse enlever une partie de la q p p protéine codée par ce gène et qu elle soit néanmoins fonctionnelle
16 Le gène de la dystrophine contient t 79 exons
17 Dystrophie de Duchenne: délétion de un ou plusieurs exons change le cadre de lecture La délétion n est pas un multiple de 3 nucléotides: changement du cadre de lecture
18 Dystrophie de Becker: délétion de un ou plusieurs exons ne change pas le cadre de lecture La délétion est un multiple de 3 nucléotides: pas de changement du cadre de lecture
19 Le saut de 1 ou plusieurs exons permet de rétablir le cadre de lecture pour un patient Duchenne Saut de l exon 53
20 Abandon d un essai clinique de Phase III par GSK!!! L objectif de cet essai était d améliorer la marche Cet essai est repris avec des doses différentes et avec un objectif différent.
21 Nouveaux oligonucleotides l 2'-O-methylphosphorothionate yp p oligonucleotides Morpholino oligonucleotides Des essais de saut d exons se poursuivent avec ces nouveaux oligonucléotides
22 Bonne nouvelle #3 Un nouvel essai clinique de greffe de myoblastes aux patients Duchenne
23 La transplantation de myoblastes Essai clinique de phase I 26% des fibres musculaires ont exprimé la dystrophine dans un muscle de DMD 1 mois après la transplantation de myoblastes normaux collaboration avec Dr. Bouchard Nous commençons un essai clinique Phase I/II En collaboration avec Dr. Craig Campbell (London) Dr. Jack Puymirat (Quebec)
24 Problèmes et solutions pour la transplantation de myoblastes 1) Requiert une immunosuppression soutenue avec le Tacrolimus Solution: transplantation de myoblastes corrigés génétiquement 2) Les myoblastes des patient DMD sont sénescents Solution: nous avons différentié des cellules souches pluripotentes induite en myoblastes et transplanté avec succès 3) La faible migration des myoblastes nécessite beaucoup de trajectoires d injection Solution: prolifération et migration dans le muscle des myoblastes transplantés
25 Bonne nouvelle #4 Il y a de nouvelles techniques très efficace pour corriger les gènes
26 Correction du gène de la dystrophine ou de d autres gènes En coupant exactement le gène avec des TALENs ou le système CRISPR En induisant une réparation par recombinaison homologue.
27 Le système CRISPR Le protospacer adjacent motif (PAM) est NGG pour le Cas9 de Streptococcus pyogenes ARN guide (ARNg) complémentaire à une séquence de 20 nucléotides La nucléase Cas9
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29 Correction du gène de la dystrophine avec les TALENs ou le CRISPR/Cas9 TALEN-L TALEN-R - Blackburn Zebrafish 2013 Figure from: Li et al. Stem Cell Research in press - En collaboration avec Charles Gersbach (Duke univ.) -rétablissement t du cadre normal de lecture avec des TALENs -Ousterout et al. Mol. Ther. 2013
30 Correction d un gène par recombinaison i homologue Exon 16 A Cible de grna#8 Gene du patient Numéro de l exon Site Spe1 Brin d ADN donneur Autres mutations in exon 16 Exon 16 muté: T Gène corrigé Exon 16 T Site Spe1
31 Bonne nouvelle #5 Un essai clinique aux Etats-Unis pour pour une nouvelle thérapie pour la Dystrophie Myotonique de Steinert développée par le Dr. Jack Puymirat
32 ANOMALIE GÉNÉTIQUE: une longue répétition de CTG dans une partie non-codante du gène <CTG 38 CTG Anomalie génique: 1 gène localisé sur le chromosome 19
33 LES MÉCANISMES RESPONSABLES DE LA MALADIE ADN CUGBP MBNL DMPK ARN TF? Accumulation sur les ARNm de protéines impliquées dans l épissage: résultats plusieurs ARNm sont anormaux.
34 APPROCHE ANTISENSE POUR LA DYSTROPHIE MYOTONIQUE Élimination des ARN mutants GÈNE MÉDICAMENT (un oligonucléotide) AAAAAAA
35 Bonne nouvelle #6 Bon résultats de thérapie génique sur des souris modèles de l Ataxie de Friedreich
36 Ataxie de Friedreich Maladie héréditaire Due à une mutation du gène de la frataxine Sur le chromosome 9 Mutation dans l intron 1 - Augmentation du nombre de trinucléotides (GAA) - Normalement de 6 à 34 répétitions - chez les patients ts 150 à 1700 répétitions t GAA La mutation réduit l expression de la protéine frataxine une protéine mitochondriale cela mène à du stress oxidatif Induit la mort de cellules neurones: problème neurologique: ataxie cellules cardiaques: hypertrophie mort prématurée
37 Plusieurs traitements possibles 1) Livraison de la protéine frataxine 2) Augmentation de l expression du gène de la frataxine 3) Correction du gène muté de la frataxine 4) Livraison du gène normal de la frataxine
38 Livraison du gène normal de la frataxine -avec un vecteur AAV9
39 Les souris NSE traitées avec un AAV-frataxine ont gagné g du poids plus rapidement Souris males normales Souris NSE traitées Souris NSE non-traitées Souris femelles normales Souris NSE traitées Souris NSE non-traitées
40 Le AAV-frataxine a permis de prévenir l hypertrophie cardiaque des souris NSE Normal NSE AAV Frataxin NSE pas traitées
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42 Bonne nouvelle #7 Création d IMAGINE Institut des maladies génétiques à Paris
43 19000 m chercheurs Nouveau bâtiment Financement AFM INSERN Mairie de Paris Université Paris Descartes Fondation des hôpitaux de Paris Assistance publique hopitaux de Paris
44 Unité de Production Biothérapeutique
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46 Nous entrons dans une ère où il sera possible de développer des traitements pour beaucoup de maladies génétiques! Le principal facteur limitant est le financement de ce type de recherche
47 Ce qu il faut au Canada Donner de la visibilité à la cause des maladies rares Un téléthon commun est nécessaire Le publique français connaît les maladies rares Ensemble ces maladies ne sont pas rares Un reconnaissance des maladies rares par les gouvernement Fédéral Provinciaux Augmentation des budget de recherche De nouvelles techniques permettent de corriger les gènes Un partie du budget pourrait venir de Génome Canada Génome Québec Les Instituts Canadiens de Recherche en Santé
48 FIN
49 Correction du gène muté de la frataxine Objectif enlever la répétition de GAA dans l intron 1 avec des TALENs avec des grna et Cas9 on peut cibler des séquences de nucléotides commençant par NGG Blackburn Zebrafish 2013 Longue répétition de GAA On enlève la répétition de GAA
50 ESSAIS CLINIQUES EN COURS Amyotrophie spinale - Phase 1. Étude de tolérance de l injection d un gène médicament chez 24 enfants atteints d amyotrophie spinale. Dystrophie des ceintures - Injection d un virus produisant la protéine déficiente dans la dystrophie des ceintures de type 2C et 2D Dystrophie oculo-pharyngée - Transplantation de cellules musculaires du patient dans les muscles pharyngées
51 La sclérose latérale amyotrophique
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53 Mak et al. Science 2012
54 Le nombre de nucléotides entre les séquences ciblées (spacer) doit être de 12 à 21 La séquence de nucléotides ciblés doit être précédée d un thymidine (T) Kim Nature Reviews Genetics 2014
55 ÉVALUATION DU MÉDICAMENT CHEZ LA SOURIS Avant traitement MESURE DE LA FORCE Traitement: 8 semaines Injection 2 fois / semaine pendant 4 semaines Médicament Médicament inactif Solution Solution DMSXL.. DMSXL. DMSXL. WT G1 n=10 Females 4m G2 n=10 Females 4m G3 n=10 Females 4m G4 n=10 Females 4m Après traitement *Mesure de la force: *Analyse des muscles *Quantification de l anomalie génétique
56 EFFECT DU MÉDICAMENT DANS DES CULTURES DE CELLULES DE MUSCLE MALADE DE CELLULES DE MUSCLE MALADE EXPÉRIENCE Cellules sont traitées avec le médicament Mesure l anomalie génétique Le médicament élimine l anomalie génétique Non transfecté Control AO AO 2467T (74%) AO 2467U (71%) AO 2700 (82%)
57 INJECTION INTRAMUSCULAIRE DU MÉDICAMENT CHEZ LA SOURIS MALADE MÉDICAMENTS Diminution de l anomalie (% decrease) Médicament 1 94 ± 3 Médicament 2 Médicament 3 Médicament 4 Médicament 5 Médicament 6 Médicament 7 Médicament 8 62 ± 6 66 ± 8 42 ± ± ± 7
58 SOURIS STEINERT AVANT TRAITEMENT
59 SOURIS STEINERT APRÈS 2 MOIS DE TRAITEMENT
60 3 TALE-VP64 augmentent l expression d un dun gène placé sous le contrôle du promoteur de la frataxine
61 Le AAV-frataxine améliore la fonction cardiaque des souris MCK et NSE MCK NSE Volume de sang éjecté par contraction Normal No treatment AAV-frataxin MCK Normal No treatment AAV-frataxin NSE Volume de sang éjecté par minute minute Normal No treatment AAV-frataxin Normal No treatment AAV-frataxin MCK NSE Diamètre du cœur en systole Diamètre du cœur en diastole Normal No treatment AAV-frataxin MCK Normal No treatment AAV-frataxin MCK Normal No treatment AAV-frataxin NSE Normal No treatment AAV-frataxin NSE
62 Le AAV-frataxine a amélioré plusieurs paramètres de comportement des souris MCK * * * Distance parcourue Temps immobile Normal No treatment AAV-frataxin Normal No treatment AAV-frataxin * * * Temps debout Normal No treatment AAV-frataxin Normal No treatment AAV-frataxin
63 AAV-frataxin increased the survival of NSE-Cre mice AAV Frataxin No treatment
64 MODE DE TRANSMISSION DES MALADIES NEUROMUSCULAIRES Maladies à transmission autosomale pas sur chromosome sexuel Dominante Récessive Maladies liées au sexe gène défectueux est sur un chromosome sexuel sur le chromosome X, récessive
65 TRANSMISSION AUTOSOMALE DOMINANTE Parent sain a 2 gènes normaux (bleu) Parent atteint à un gène normal (bleu) et un gène malade (rouge) Parent atteint t a 1 chance / 2 de transmettre tt le gène normal enfant non atteints Parent atteint a 1 chance / 2 de transmettre le gène malade enfant atteints Conclusion: Transmission dominante Enfant a 1 chance / 2 d être atteint Enfant a 1 chance / 2d êt être normal Touche les garçons et les filles
66 PRINCIPALES MALADIES NEUROMUSCULAIRES À TRANSMISSION DOMINANTE Dystrophie myotonique de Steinert Dystrophie oculo-pharyngée Dystrophie facio-scapulo humérale Dystrophie d Emery-Dreyfuss Certaines dystrophies des ceintures Myotoniecongénitale de Thomsen Certaines formes de maladie de Charcot-Marie-Tooth
67 AVENUES THÉRAPEUTIQUES POUR LES MALADIES DOMINANTES MALADIES DOMINANTES Normal Défecteux Production de la maladie 50% 0% La protéine est produite à 50% Traitement: Destruction du gène défectueux Respecter le gène normal Méth Méthode: Thérapie génique
68 TRANSMISSION AUTOSOMALE RÉCESSIVE Rôle de la consanguinité UNION D UN PORTEUR ET D UN NON PORTEUR A chaque grossesse, ce couple a un risque: 1/2 d avoir un enfant porteur du gène malade 1 / 2 d avoir une enfant non porteur du gène malade Touche garçons et les filles UNION DE DEUX PORTEURS A chaque grossesse, ce couple a un risque 1/4 d avoir un enfant porteur du gène normal 1/2 d avoir un enfant porteur du gène anormal 1/4 d avoir un enfant porteur de 2 gènes malades, enfant atteint Touche les garçons et les filles
69 PRINCIPALES MALADIES NEUROMUSCULAIRES À TRANSMISSION RÉCESSIVE À TRANSMISSION RÉCESSIVE Polyneuropathie avec ou sans agénésie du corps calleux Ataxie Spastique de Charlevoix (ARSAC) Certaines dystrophie des ceintures Myotonie congénitale de Becker Certaines formes de maladie de Charcot-Marie-Tooth Amyotrophie spinale Certaines ataxies: Ataxie Friedreich
70 QU EST CE QUI INDUIT LA MALADIE DANS LES MALADIES À TRANSMISSION RÉCESSIVE? MALADIES À TRANSMISSION RÉCESSIVE? 2 gènes malades Traitement: Restaurer la protéine dans les muscles Absence complète de production de la protéine normale. Méthode Thérapie cellulaire Injecter des cellules musculaires normales Injecter des cellules l souches Thérapie génique Réintroduire le gène défectueux à l aide d un virus Correction du gène
71 MALADIES DONT LA TRANSMISSION LIÉE AU SEXE UNION ENTRE UN HOMME MALADE ET UNE FEMME SAINE NON PORTEUSE - Aucun garçon ne peut être atteint - Toutes les filles sont porteuses mais pas malades - 1/2 d avoir un enfant non porteur du gène malade UNION ENTRE UN HOMME SAIN ET UNE FEMME PORTEUSE -1/4 d avoir un garçon porteur du gène malade: - sujet atteint -1/4 d avoir un garçon non porteur du gène malade - 1/4 d avoir une fille porteuse du gène malade - 1/4 d avoir une fille non porteur du gène malade
72 PRINCIPALES MALADIES NEUROMUSCULAIRES LIÉES AU SEXE LIÉES AU SEXE Dystrophie de Duchenne / Becker Certaines formes de la maladie de Charcot-Marie-Tooth: CMTX
73 QU EST CE QUI INDUIT LA MALADIE DANS LES MALADIES À TRANSMISSION LIÉE AU SEXE? MALADIES À TRANSMISSION LIÉE AU SEXE? X Y Absence complète de production de la protéine normale Traitement: Restaurer la protéine dans les muscles Méthode Thérapie cellulaire Injecter des cellules musculaires normales Thérapie génique: Introduire le gène de la dystrophine à l aide d un virus Correction du gène avec -les TALENs -les CRISPR
74 ÉTAPES DU DÉVELOPPEMENT THÉRAPEUTIQUE IDENTIFICATION MUTATION MÉCHANISMES DÉVELOPPEMENT THÉRAPEUTIQUE Dystrophie de Duchenne 25 ans après l identification de la mutation, toujours pas de traitement, mais plusieurs essais cliniques en cours
75 ÉTAPES DU DÉVELOPPEMENT THÉRAPEUTIQUE Démonstration de l efficacité et de l absence de toxicité d un médicament Évaluation Préclinique chez l animal Culture cellulaire Modèle murin de la maladie Cohorte patients Registre de patients Marqueurs de la maladie Recherche sur développement Evaluation clinique standardisée de protocoles d évaluation clinique Essai clinique
76 PLAN DE DÉVELOPPEMENT D UN MÉDICAMENT Phase I Tester la toxicité du médicament chez un nombre limité de sujets Phase II Tester l efficacité du médicament chez un nombre limité de sujets Phase III Étude de l efficacité du médicament chez un grand nombre de sujets Si positifs, commercialisation
77 MODÈLE DE SOURIS DE LA MALADIE (G Gourdon Lab) INTRODUCTION DU GÈNE HUMAIN ANORMAL CHEZ LA SOURIS 1. Mortalité élevée pendant le 1er mois: 60% 2. Pèsent moins: 50% inférieur à 1 souris normale durant le 1er mois 1. Le muscle a des anomalies voisines de celles observées chez l homme 2. Faiblesse musculaire
78 Augmentation de l expression du gène de la frataxine Les protéines TALE peuvent cibler des séquences de nucléotides commençant par un T Avec une protéine TALE-VP64 ciblant le promoteur de la frataxine Activation du gène Promoter Promoteur Promoter Promoteur Gène d intérêt
79 Nous avons fabriqué 12 génes codant pour des protéines TALEs qui s attachent t au promoteur du gène de la fratatine Binding site of TALE#8
80 Une des protéines TALE Frat#8 -VP64 ciblant le promoteur du gène de la frataxine augmente la protéine frataxine dans des cellules de patients Friedreich Protéine β-actine Protéine Frataxine Control TALE Frat#8-VP64 Control Control TALE Control Frat#8 -VP64
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