TECHNOLOGIES DE SÉQUENÇAGE. M2BI Benjamin Noel

Transcription

1 TECHNOLOGIES DE SÉQUENÇAGE M2BI Benjamin Noel 18 OCTOBRE 2016

2 TECHNOLOGIES DE SÉQUENÇAGE Introduction Différentes technologies de séquençage Illumina Oxford Nanopore Technology Pacific Biosciences Cartes optiques Bionano

3 TECHNOLOGIES DE SÉQUENÇAGE Introduction Différentes technologies de séquençage Illumina Oxford Nanopore Technology Pacific Biosciences Cartes optiques Bionano

4 INTRODUCTION Séquençage Définition de l enchainement des bases contenues dans une molécule d ADN Waterston et al., On the sequencing of the human genome. Proc Natl Acad Sci U S A Mar 19; 99(6):

5 INTRODUCTION Couverture homogène des NGS Fragment d ADN Reads Répartition de la couverture sur une séquence chromosomique Sanger 454 Illumina Couverture = Nombre de fois qu une base est séquencée

6 INTRODUCTION Changements apportés par les NGS Diminutions du nombre d étapes et du temps nécessaires à la préparation des échantillons Augmentation du volume de données générées Diminution du coût de séquençage Par rapport à la 1 ère génération de séquenceur: Diminution de la taille des lectures Augmentation (acceptable) du taux d erreurs compensé par la capacité de séquençage 454 : erreurs type insertion/deletion Illumina : erreur type missmatch

7 INTRODUCTION

8 L INSTITUT DE GÉNOMIQUE CEA : Commissariat à l énergie atomique et aux énergies alternatives Direction de la Recherche Fondamentale Institut de Génomique CNS = Genoscope (Centre National de Séquençage) CNG = Centre National de Génotypage Among the largest sequencing center in Europe Part of the CEA Institut de Génomique since 05/2007 Provide high-throughput sequencing data to the French Academic community, and carry out in-house genomic projects

9 CAPACITÉ DE SÉQUENÇAGE DE L INSTITUT Illumina 2+1 HiSeq HiSeq HiSeq HiSeq X 2+2 MiSeq 1 NextSeq Oxford Nanopore 6+1 MinIon Mk1 10X Genomics 1 Chromium Irys Systems

10 TECHNOLOGIES DE SÉQUENÇAGE Introduction Différentes technologies de séquençage Illumina Oxford Nanopore Technology Pacific Biosciences Cartes optiques Bionano

11 ILLUMINA SEQUENCING HiSeq MiSeq

12 ILLUMINA SEQUENCING Library preparation Cluster generation Sequencing

13 ILLUMINA SEQUENCING Library preparation Préparation des échantillons spécifiques à la technologie de séquençage Différents types de banque : Paired End : séquençage de fragments de 300 à 1000pb Paired End chevauchante : séquençage de fragments de taille précise (exemple : autour de 315pb) Mate Pair : séquençage des extrémités de grands fragments (entre 3 et 10Kb) Moleculo : séquençage de fragments pb conduisant à la production de pseudo molécules de grandes tailles (autour de 10Kb) RNAseq Eucaryote : séquençage d ARN fragmentés RNAseq Procaryote : séquençage d ARN fragmentés Library preparation Cluster generation Sequencing

14 ILLUMINA SEQUENCING Résultat du séquençage Fragment d ADN Reads GAP (taille?) Taille connue

15 ILLUMINA SEQUENCING Construction de banques pour le séquençage Plusieurs types de banques variant selon protocole d obtention Distance entre les lectures connues pour les banques PE et MP

16 ILLUMINA SEQUENCING Banque Mate pair (Illumina) L objectif est d obtenir les séquences des extrémités de fragments de grandes tailles (3,5,10 kb) Fragmentation (5kb par Covaris, 10kb par hydroshear) Ajout d une biotine aux extrémités Circularisation Utile pour l assemblage des séquences ~ 5-10 Kb Fragmentation de l ADN circulaire (~ pb) et sélection des fragments biotinilés Ligation des adaptateurs Solexa Sequençage en paired end Read 1 Read 2

17 ILLUMINA SEQUENCING RNAseq Eucaryote SMARTER Kit

18 ILLUMINA SEQUENCING RNAseq Procaryote ARN totaux Déplétion rrna avec kit RiboZero Bacteria (EPICENTRE)

19 ILLUMINA SEQUENCING RNAseq: protocoles non orienté vs orienté Non orienté Orienté

20 ILLUMINA SEQUENCING Cluster generation Patterned Flow Cell Library preparation Cluster generation Sequencing

21

22 ILLUMINA SEQUENCING Library preparation Cluster generation Sequencing

23 Performances ILLUMINA SEQUENCING

24 TECHNOLOGIES DE SÉQUENÇAGE Introduction Différentes technologies de séquençage Illumina Oxford Nanopore Technology Pacific Biosciences Cartes optiques Bionano

25 LONGUEUR DES LECTURES L importance de la taille des fragments

26 OXFORD NANOPORE TECHNOLOGY

27 OXFORD NANOPORE TECHNOLOGY Portable device, plugs into a computer using a USB interface Low-cost device : 1000$ with 2 flowcells Doesn t require DNA synthesis : low-cost Produces reads up to 100 kb Error rates around 10% Early access in

28 OXFORD NANOPORE TECHNOLOGY

29 OXFORD NANOPORE TECHNOLOGY Nanopore sequencing at Genoscope 1 Bench 6 Laptops 6 MinIONs At least 1 technician

30 OXFORD NANOPORE TECHNOLOGY Une technologie évoluant (très) rapidement 2014 : R6 / MAP4 5 Mb > 80% d identité (run 48h) 2015 : R7.3 / MKI 100 Mb > 80% d identité (run 48h) 2016 : R9 / Fast Mode / basecall RRN 525 Mb > 80%, 175Mb > 90% (run 24h)

31 OXFORD NANOPORE TECHNOLOGY Taux d exactitude Lectures 1D de qualité supérieure aux lectures 2D avant R9 Pics à 90% pour les lectures 1D et 95% pour les lectures 2D Médiane à 85% pour les lectures 1D et 91% pour les lectures 2D

32 OXFORD NANOPORE TECHNOLOGY Méthode de correction des erreurs de séquences DAY 1 DAY 3 3-6H 48H 15H 5H Library prep MinION sequencing NaS workflow Perfect and Long Reads Genome Assembly Perfect Genome Library prep Illumina MiSeq sequencing

33 STRATÉGIE DE SÉQUENÇAGE AU GENOSCOPE Lectures courtes (150 pb) Taux d erreur très faible (<0,1%) Coût à la base faible Lectures longues (>100 Kbp) Taux d erreur élevé pour le moment (~15%) Coût à la base faible

34 OXFORD NANOPORE TECHNOLOGY PromethION

35 TECHNOLOGIES DE SÉQUENÇAGE Introduction Différentes technologies de séquençage Illumina Oxford Nanopore Technology Pacific Biosciences Cartes optiques Bionano

36 PACIFIC BIOSCIENCES

37 PACIFIC BIOSCIENCES PacBio RSII metrics RSII Output Range 5-10 Gb / SMRT cell Number of reads ~50k Average read length 8kb 12kb Max. read length >20kb Average run time >2h Number of SMRT cell / run

38 TECHNOLOGIES DE SÉQUENÇAGE Introduction Différentes technologies de séquençage Illumina Oxford Nanopore Technology Pacific Biosciences Cartes optiques BioNano

39 CARTES OPTIQUES BioNano (Irys)

40 Irys workflow CARTES OPTIQUES

41 CARTES OPTIQUES Irys sytem: DNA Linearization in Nanochannel Arrays 75 kbp