ENZYMES, AGENT DE CATALYSE

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1 THÈME : Du génotype au phénotype, relations avec l environnement Niveau : 1 re S EXTRAIT DU BO: ENZYMES, AGENT DE CATALYSE Notions et contenus : Les enzymes ont une double spécificité : d action et de substrat. Activités envisageables : Étude expérimentale de la catalyse enzymatique et de la double spécificité. ExAO: mesure de la vitesse initiale en fonction de la concentration du substrat. CADRE PÉDAGOGIQUE : Chapitre : Des protéines actives dans la catalyse : les enzymes Quelles sont les propriétés des enzymes pour activer une réaction chimique? Objectifs de méthode : o réaliser :suivre un protocole o communiquer : construire un tableau de résultats, légender un graphe o raisonner : adopter une démarche explicative Objectifs de connaissances o La vitesse de catalyse enzymatique dépend de la concentration en substrat et de la concentration en enzyme. 1 / 9

2 COIN LABORATOIRE : Gestion du temps : TP réalisable le jour-même, pas de préparation préalable. Achats à prévoir : Matériel végétal frais : radis rose ou radis noir ou navet produits chimiques : gaïacol, eau oxygénée - Matériel frais : radis rose ou radis noir ou navet - Matériel de mesure : o Soit un colorimètre autonome : le Mesura-color o Soit une chaîne EXAO : l interface orphy GTS ou portable 2 + module photocolor - Matériel d extraction du jus de radis : de la gaze - Verrerie : cuve à face parallèle, pipettes, - produits chimiques : gaïacol, 3 solutions d eau oxygénée aux concentrations suivantes : à 0,1 volume, à 0,05 volume, et à 0,01 volume, eau distillée - Sécurité : o attention à la peau lors de l utilisation des produits chimiques : gaïacol et eau oxygénée port lunettes de protection et gants o particularité : odeur persistante du gaïacol aération à mettre en œuvre + fermer le flacon aussitôt après le prélèvement de façon hermétique. 2 / 9

3 Fiche TP avec Mesura Color I- Principe On utilise une réaction enzymatique qui transforme un réactif incolore : le gaïacol en un produit coloré rouge foncé : la gaïaquinone. Cette oxydation a lieu si on ajoute d une part l enzyme peroxydase et d autre part l eau oxygénée qui fournit le dioxygène nécessaire à la réaction. Cette enzyme est extraite du radis pelé puis broyé et enfin filtré dans de la gaze. Le colorimètre mesure soit la transmission de la lumière blanche ou d une longueur d onde spécifique au cours de la réaction enzymatique ci-dessous, soit une tension. Bilan de la réaction Gaïacol incolore (= réactif) + eau oxygénée (= substrat) + jus de radis (= enzyme peroxydase) Gaïaquinone rouge + eau + dioxygène Quand la coloration vire de l incolore au rouge : - la transmission enregistrée avec Mesura Color diminue, - la tension mesurée avec le module photocolor d Orphy visuel diminue. II- Pistes d exploitation A- Mise en évidence de la réaction enzymatique 1- Réaliser une extraction de l enzyme de radis en suivant les indications du protocole. 2- Réaliser une mesure de transmission de la solution testée pour une concentration en substrat à 0,1 volume en suivant les indications de la fiche technique de l utilisation du Mesura Color. 3- Construire un tableau de résultats. 4- Construire le graphe montrant l évolution de la transmission en fonction du temps. 5- Exploiter le graphe obtenu ( voir fiche méthode «exploiter un graphe»). B- Variation des facteurs jouant sur la réaction enzymatique Groupe 1 : Variation de la concentration en substrat 1- Réaliser une deuxième mesure avec une autre concentration en substrat. Superposer le graphe obtenu au précédent. 2- Comparer les 2 graphes. Groupe 2 : Variation de la concentration en enzyme 1. Réaliser une dilution de l enzyme à : 50%, 25% Réaliser une nouvelle mesure avec une autre concentration en enzyme. Superposer le graphe obtenu au précédent. 3. Comparer les 2 graphes. 3 / 9

4 III- Exemples de résultat avec Mesura Color Vitesse de la réaction enzymatique de l oxydation du gaïacol par l enzyme peroxydase du radis ( pour une dilution du filtrat enzymatique de 1/5 ème et une durée de 21 minutes ) % T mesuré à une longueur d'onde de 585 nm % T Temps en secondes % T mesuré à une longueur d'onde de 585 nm 4 / 9

5 Protocole enzymologie Intégrant Mesura Color 1- Préparer les différentes solutions a. l extrait de radis : Peler 2 radis, les couper finement en dès, placer les morceaux dans de la gaze puis tremper dans un bécher rempli d eau distillée, serrer le sac de gaze plusieurs fois avec les doigts b. Préparer différentes concentrations : o soit de substrat (eau oxygénée ) groupe 1 o soit de l enzyme (jus de radis filtré) groupe 2 2- Tester visuellement la réaction enzymatique dans un tube à essai pour effectivement se rendre compte du temps nécessaire au virage de couleur de la réaction. On étalonne ainsi le temps de la réaction avant de placer la cuve dans le colorimètre où son contenu sera masqué. 3- Placer dans une cuve : 0,5 ml de gaïacol 1 ml d eau oxygénée 0,5 ml d eau distillée 4- Sélectionner la longueur d onde 585 nm. 5- Etalonner avec une cuve remplie d eau en appuyant simultanément sur les 2 boutons de la face avant de l appareil, la valeur de transmission s affiche au bout de quelques secondes soit 100 %. 6- Placer la cuve dans son emplacement. Déclencher la mesure en ajoutant 0,5 ml de filtrat enzymatique, fermer le plus rapidement possible avec le bouchon noir fourni et déclencher alors le chronomètre du Mesura Color. Effectuer des mesures à intervalle régulier (toutes les 30 secondes par exemple). 7- Appeler le professeur pour vérifier la saisie des mesures. 5 / 9

6 Fiche TP avec Orphy I- Principe On utilise une réaction enzymatique qui transforme un réactif incolore : le gaïacol en un produit coloré rouge foncé : la gaïaquinone. Cette oxydation a lieu si on ajoute d une part l enzyme peroxydase et d autre part l eau oxygénée qui fournit le dioxygène nécessaire à la réaction. Cette enzyme est extraite du radis pelé puis broyé et enfin filtré dans de la gaze. Le colorimètre mesure soit la transmission de la lumière blanche ou d une longueur d onde spécifique au cours de la réaction enzymatique ci-dessous, soit une tension. Bilan de la réaction Gaïacol incolore (= réactif) + eau oxygénée (= substrat) + jus de radis (= enzyme peroxydase) Gaïaquinone rouge + eau + dioxygène Quand la coloration vire de l incolore au rouge la transmission ou la tension mesurée diminue. II- Consignes élèves A- Mise en évidence de la réaction enzymatique 1. Réaliser une extraction de l enzyme de radis en suivant les indications du protocole. 2. Utiliser les fonctionnalités du logiciel orphy visuel pour réaliser une mesure de transmission pour une concentration en substrat. Appeler le professeur pour montrer la courbe obtenue à l écran 3. Exploiter le graphe obtenu ( voir fiche méthode «exploiter un graphe»). B- Variation des facteurs jouant sur la réaction enzymatique Groupe 1 : Variation de la concentration en substrat 1- (Re) Réaliser une deuxième mesure avec une autre concentration en substrat. Superposer le graphe obtenu au précédent. 2- (Ra) Comparer les 2 graphes. Groupe 2 : Variation de la concentration en enzyme 1- (Re) Réaliser une dilution de l enzyme à : 50%, 25% (Re) Réaliser une nouvelle mesure avec une autre concentration en enzyme. Superposer le graphe obtenu au précédent. 3- (Ra) Comparer les 2 graphes. 6 / 9

7 III- Exemples de résultat avec Orphy portable 2 Graphe de référence extrait de orphy visuel 7 / 9

8 Protocole enzymologie Intégrant l interface Orphy 1- Préparer les différentes solutions l extrait de radis : Peler 2 radis, les couper finement en dès, placer les morceaux dans de la gaze puis tremper dans un bécher rempli d eau distillée, serrer le sac de gaze plusieurs fois avec les doigts Préparer différentes concentrations : o soit de substrat (eau oxygénée ) groupe 1 o soit de l enzyme (jus de radis filtré) groupe 2 2- Tester visuellement la réaction enzymatique dans un tube à essai pour effectivement se rendre compte du temps nécessaire au virage de couleur de la réaction. On étalonne ainsi le temps de la réaction avant de placer la cuve dans le colorimètre où son contenu sera masqué. 3- Placer dans une cuve : 0,5 ml de gaïacol 1 ml d eau oxygénée à 10 volumes 0,5 ml d eau distillée 4- Utiliser les fonctionnalités du logiciel orphy visuel ( voir fiche technique) pour paramétrer la mesure 5- Etalonner avec une cuve remplie d eau, la valeur de tension U en volts s affiche. 6- Placer la cuve dans son emplacement. Déclencher la mesure en ajoutant 0,5 ml de filtrat enzymatique à l aide de la seringue, à travers l ouverture ménagée dans le couvercle. 8- Appeler le professeur pour montrer la courbe obtenue : la recopier ou l imprimer. 8 / 9

9 Fiche Labo SVT Fiche technique EXAO : COLORIMÉTRIE I- Pour LANCER le logiciel ORPHY Visuel 1- Poste de travail disque local C : EXAO cliquer sur VISUEL puis sur PROGRAM cliquer sur le logo visuel : 2- Un écran apparaît et lance la détection automatique de l interface utilisée : GTS ou portable. ( Si la détection échoue, choisir Configurer manuellement puis choisir GTS ou portable). 3- Sélectionner Ouvrir un thème SVT lycée Activité enzymatique peroxydase de raifort 4- Ouvrir le thème un écran de contrôle des capteurs apparaît, cliquer sur poursuivre à chaque fois. 5- A l écran 2 fenêtres apparaissent : - à gauche : Fermer la fenêtre rapport de l élève - à droite : agrandir la fenêtre Graphes d acquisition II- POUR PARAMETRER LES MESURES pour régler la durée elle est pré-réglée sur 100 secondes S il faut modifier la durée : Cliquer sur Expérience menu acquisition paramètres constante L unité de l axe y : est U soit une tension pour régler le module photocolor ou colorimètre vérifier au préalable la présence d une pile 9 volts dans le boîtier tourner le bouton sur bleu : B = 470 nm (le bouton ne doit pas être sur arrêt). remplier la cuve à face parallèle selon le protocole donné. Placer la cuve à face parallèle remplie dans la fente. La recouvrir par le couvercle transpercé. pour lancer une mesure Cliquer sur l icône pour réinitialiser de façon à refaire une mesure à partir de l icône III- POUR LÉGENDER LE GRAPHE Si l impression est autorisée, annoter le graphe avant de l imprimer à l aide du traitement de texte dont les principales fonctions sont rappelées ci-dessous. Pour écrire un titre, un texte Pour placer un repère sur le graphe Pour gommer un repère, un titre ou un graphe A la fin du TP : Remettre l ordinateur à son état initial en fermant toutes les applications, Nettoyer la surface paillasse et le matériel pour le rendre disponible pour le groupe suivant 9 / 9

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