Influence du milieu d étude sur l ctivité (suite) Inhibition et ctivtion Influence de l tempérture Influence du ph 1 Influence de l tempérture Si on chuffe une préprtion enzymtique, l ctivité ugmente jusqu à un mximum puis décroît rpidement. L ugmenttion d ctivité (réversible) est liée à l vrition exponentielle des constntes et K M L diminution d ctivité (irréversible) est liée à l dénturtion de l enzyme. 0 10 20 30 40 50 60 70 Tempérture d ctivité mximum T : Dépend du milieu d étude et de l nture de l enzyme. Dns un milieu proche du milieu biologique, l mjorité des enzymes se dénturent à prtir de 50 C. Cependnt certines, sont plus stbles ou même moins stbles. 2 1
Activtion thermique Augmenttion réversible d ctivité vec l tempérture qui se produit vnt que l enzyme se dénture. Protocole expérimentle [S à sturtion On mesure l ctivité ( mx ) d une préprtion d enzyme à diverses tempértures et on trce l courbe = f(t) : Résultts : 0 5 10 15 2 0 2 5 30 35 4 0 4 5 5 0 T Celle-ci est liée ux vritions des constntes crctéristiques K M et 3 Activtion thermique (suite) Interpréttion des résultts Interpréttion : On démontre en chimie que les constntes cinétiques des réctions simples vrient toute en vitesse exp(-e /). Or est l constnte cinétique de l étpe lente. = infini e = f(1/t) E -3,5 Ln -3 = = Ln,infini infini Ln = f(1/t) E 3,0E-03 3,1E-03 3,2E-03 3,3E-03 3,4E-03 3,5E-03 3,6E-03 3,7E-03 e E Ln -4-4,5 -E /R 270 280 290 300 310 320 330 1/T (K -1 ) -5-5,5-6 1/T (K -1 ) E est dit «énergie d ctivtion». Elle est comprise entre 20 et 80 J4 elvin = Celsius 273.15 2
Activtion thermique (suite) Interpréttion des résultts Etude du Q 10 L énergie d ctivtion suffit pour crctériser l effet de l tempérture mis est «peu prlnte». On défini de fçon plus simple d utilistion le Q 10. Q 10 : Fcteur pr lequel est multiplié l ctivité si l tempérture ugmente de 10 C. E R(T 10) T 10 infinie Q10 = = = e E T infinie Le Q10 des enzymes vrie entre 1,5 et 2,5. 10E (T 10) Pr pproximtion Q 10 = e 10 E Remrque : Le Q 10 d une réction lysée est inférieur à celui de l réction spontnée (l énergie d ctivtion est plus fible) 2 Exemple : Hydrolyse du scchrose Spontnée E A = 400 J Q 10 = 4,5 Scchrse E A = 80 J Q 10 = 2,5 5 Activtion thermique [S hors sturtion Hors sturtion l ctivité vrie de l même fçon que à sturtion : = infini e E' Ln = Ln infini E' L énergie d ctivtion est plus fible. Ceci est du à l vrition du K M vec l tempérture. 6 3
Dénturtion Thermique L dénturtion est l rupture des liisons fibles stbilisnt les structures secondires, tertiires et quternires d une protéine. L protéine s orgnise en pelote sttistique de volume beucoup plus grnd que l protéine ntive. Remrque : les ponts disulfures ne sont ps détruits. 7 Dénturtion L dénturtion est obtenue si l protéine est dissoute dns un milieu dont l composition est éloignée de celle du milieu biologique : - Lors qu on chuffe une protéine, - ph très cide ou bsiques, - Concentrtion sline insuffisnte, - Présence d gents dénturnts formnt des liisons hydrophobes ou hydrogène vec les restes d minocides. L protéine dénturée perd les propriétés d intérêt biologique de l protéine ntive. S réctivité chimique ugmente cr les restes d minocides sont tous plus ccessibles (en prticulier, les petites molécules pénètrent à l intérieur de l protéine dénturée). 8 4
Dénturtion thermique L vitesse de dénturtion dépend de l protéine et du milieu d étude. Dns un milieu suffismment proche du milieu biologique, l mjorité des protéines sont stbles jusqu à 50 C et sont dénturées en quelques secondes à tempérture supérieure à 60 C. Certines sont beucoup plus stbles et quelques unes moins stbles. Sous forme solide les protéines se dénturent très lentement Appliions 1) Une solution protéique doit être préprée et conservée à tempérture proche de 0 C (dns de l glce pilée) Elle ser portée à tempérture mbinte uniquement u moment d effectuer des mesures. 2) Une fois purifiées, les protéines sont conservées sous forme lyophilisées à tempérture inférieure à 0 C ou précipitée dns une solution de sulfte d mmonium à tempérture comprise entre 0 et 5 C. 9 Cinétique de dénturtion L dénturtion est une réction du premier ordre : d[e = d[e dt [E = [E dt 0e Ln[E = Ln[E 0 d t d = d,infini e E,d E,d est très élevée (plusieurs centines de J) Pour une enzyme, l ctivité résiduelle s exprime selon : r = 0 e d t Ln r = Ln 0 d t 10 5
Dénturtion thermique Protocole expérimentl L méthode de double incubtion est utilisée (comme pour l étude de tout phénomène «lent» ) Première incubtion (dite pré-incubtion) : On incube l enzyme à une tempérture dénturnte (choisie pour que celle-ci s effectue en 10 à 20 min) Il se fit l réction : E E dént Deuxième incubtion (nlytique) : A des temps fixés, on effectue des prélèvements dont on mesure l ctivité résiduelle r à tempérture mbinte ([S en générl à sturtion). Pour déterminer d à une tempérture, on trce l droite : Ln r = f(t) (pente - d ). Pour détermine E,d, on trce l courbe : Ln d = f(1/t) (pente E,d /R) 11 Tritement des données expérimentux: r = f(t) Ln(r)=f(t) r 1 0,8 Ln r 0 t (min) 0 5 10 15 20-0,2 0,6 0,4 0,2 0 0 5 10 15 20 t (min) -0,4-0,6-0,8-1 -1,2 - dént Pour une tempérture de preincubtion donnée 12 6
Dénturtion thermique (suite) Interpréttion des résultts Interpréttion : Comme pour l ctivtion, on démontre en chimie que les constntes cinétiques des réctions simples vrient toute en exp(-e /). Or dént est une constnte cinétique: dént = E dént,infinie Ln d = f(1/t) Ln dént = Ln dént, infini E,d Lnd 3,0E-03 3,1E-03 3,2E-03 3,3E-03 3,4E-03 3,5E-03 3,6E-03 3,7E-03-3 -3,5-4 -4,5 -E,d R -5-5,5-6 1/T (K -1 ) On s intéresse à déterminer E est dit «énergie de dénturtion». elvin = Celsius 273.15 13 Dénturtion thermique (suite) Protection pr le substrt ou un lignd Si on incube l enzyme en présence d un substrt ou plus générlement, un lignd, l vitesse de dénturtion est plus fible Ln r Témoin Substrt Les sites de fixtion sont des points de frgilité de l enzyme où commence l dénturtion. L jout d un lignd crée des liisons fibles supplémentires qui stbilisent l enzyme. Appliion L dénturtion thermique en bsence ou présence de lignds peut être utilisée pour svoir si un composé X se fixe sur l enzyme : d est diminuée s il se fixe t 14 7
Effet du ph Les enzymes ont un domine d ctivité limité à une zone de ph. Elles s inhibent de fçon réversible en milieu trop cide ou trop bsique. INHIBITION REVERSIBLE PAR LE ph L ctivité est liée à l étt de ionistion des groupes de fixtion et lytiques H qui diminue : ctivteur (groupes protonés) (U) NH 3 NH 2 H qui diminue : Inhibiteur (groupes non protonés) COOH ph COO - Cette ctivtion et inhibition porte sur le K M et/ou le mx. Remrque :Il n y ps de différence de nture entre l modultion pr H et celle pr un utre inhibiteur. Cependnt, l méthode d étude diffère cr pour fixer [H on utilise un système tmpon. 15 Interpréttion de l modultion réversible liée u ph Cet effet est en générl lié u propriétés cido-bsiques de certins des groupes de fixtion ou lytiques. 1 er exemple : Supposons une enzyme ynt un groupe de fixtion sprtte (-COO - ) de pk 6. Il fixe le substrt pr liison ionique. A ph < 6, l sprtte se protonne (-COOH) et ne porte plus de chrge. L enzyme lie moins bien le substrt : K M De même si une lysine chrgée (-NH 3 ) est un groupe de fixtion, K m ugmente à ph élevée. 16 8
2 ème exemple : Supposons une enzyme ynt un groupe lytique sprtte (-COO - ) Celui-ci est nucléophile. À ph < 6, l sprtte se protonne (-COOH) devient électrophile : Remrque : L effet inhibiteur ou ctivteur de H peut être lié à un chngement de conformtion de E : En effet le chngement d étt de protontion d un minocide stbilisnt le structure tertiire crée ou détruit une liison ionique, ce qui peut déformer l enzyme. 17 Il est possible de déterminer les cides minées impliquées dns le mécnisme en déterminnt les pks. (U) ln ph pk A ph pk B NB : En milieu très cide ou bsique, l enzyme se dénture, ce qui correspond à une inhibition irréversible. Cependnt, l enzyme est en générle inctive vnt d être dénturée. 18 9
Interpréttion de l inhibition liée u ph (suite) Ne ps oublier que le pk d un reste d minocide dns une protéine peut différer d u mximum 2 unités de pk de même groupe dns l enzyme libre. Exemple : L sprtte, le glutmte, l histidine et l lysine ont des chînes ltérles de pk respectivement 3,9 4,2 6 et 9,1. En étudint l vrition de mx et K M vec le ph, on peut voir une première idée de groupes lytique et de fixtion intervennt. Un ugmenttion du K M à ph inférieur à 6 suggère qu il existe un groupe de fixtion Asp, Glu ou His (mis ps Lys). 19 Il fut ussi considérer que l perte d ctivité peux être ussi le résultt de l dénturtion de l enzyme et ps uniquement de sont étt de ionistion. Dénturtion? (U) ph On utilise le protocole de double incubtion pour étudier l dénturtion : -Pre-incuber l enzyme u ph d étude -Déterminer l ctivité résiduelle ( r ) à chque ph r ph 20 10
Modèle d inhibition pr le ph Il y trop de possibilité pour donner un modèle générl, nous prendrons un exemple illustrnt les principles possibilités. Considérons une enzyme ctive sous forme EH mis existnt sous forme EH 2 en milieu plus cide et E - en milieu plus bsique. EH 2 et E - fixent S mis ont une ffinité inférieure à EH K 1 H E H 2 S S H E H E H...S K E H P M c t K H 2 S H K ' 2 E - E H 2...S K ' 1 E -...S K 1 > K 2 p K 1 < p K 2 K ' 1 > K ' 2 pk ' 1 < p K ' 2 R e m rq u e : il n 'y p s d e re l tio n en tre p K 1 et p K 2 C e pe nd n t, so u v en t : p K 1 = p K ' 1 et p K 2 =p K ' 2 (H ) = K [H K2 1 K 1 [H [H 2 1 [H Attention : une enzyme n est ps forcément ctive sous forme neutre : EH 21 2 et E - sont des chrge reltives. K M (H ) = [H 1 2 1 [H M 1 (H Vrition de log vec le ph ) = [H 1 2 1 [H ph < pk 1 < pk 2 [H > K 1 > K 2 1 (H ) = log (H ) = log 1 ph [H pk 1 < ph <pk 2 K 1 > [H > K 2 (H ) = log (H ) = log pk 1 < pk < ph K 1 > K 2 [> H [H [ (H ) = log (H ) = log - ph 2 2 22 11
Vrition de log vec le ph : discussion A sturtion, le modèle devient : H H EH 2...S 1 EH...S 2 EH P E -...S Simplifiions du modèle Les constntes d cidité des complexes enzyme substrt interviennent seules (H ) = [H 1 2 1 [H Milieu d ctivité mximum : pk 1 < pk < ph 2 K 1 > K 2 [> H : [ES = [E T EH...S EH P (H ) = log (H ) = log Milieu cide : pk 1 < ph <pk 2 K 1 > [H > K 2 : [EH S = [E T EH 1 2...S EH...S EH P (H ) = log (H ) = log 1 ph 1 [H Milieu bsique : ph < pk 1 < pk 2 [H > K 1 > K 2 : [EH - S = [E T E -...S H K '2 EH...S EH P [H [ (H ) = log (H ) = log - ph 2 2 23 Vrition de log K M vec le ph Il fut tenir compte de tous les domines de ph correspondnt ux diverses formes mjoritires de l enzyme libre et du complexe enzyme substrt. Dns chcun d eux, l éqution se simplifie : l courbe log K M =f(ph) est un segment de droite. Vrition de log K M et log mx vec le ph : conclusion Le trcé des courbes log K m = f(ph) et log mx =f(ph) permet de déterminer les pk des groupes de fixtion et lytiques déterminnt l zône d ctivité mximum de l enzyme. 24 12