Table des matières Intrductin............................................................................................... 1 Chapitre 1 AD et AR........................................................................... 3 1.1 Fnctin des acides nucléiques............................................................................... 3 1.2 Structure d un nuclétide et d un plynuclétide............................................................ 4 1.3 Cmplémentarité des brins de l AD et duble hélice....................................................... 6 1.4 Plarité d un brin d AD..................................................................................... 8 1.5 Histnes, chrmatine et chrmsmes........................................................................ 8 1.6 Différences entre eucarytes et prcarytes................................................................. 9 1.7 Cycle de vie d une cellule.................................................................................. 10 1.7.1 Cycle cellulaire......................................................................................... 10 1.7.2 Divisin cellulaire : mitse................................................................................ 11 1.7.3 Divisin cellulaire : méise............................................................................... 12 1.8 Résumé...................................................................................................... 13 1.9 Exercices.................................................................................................... 15 Chapitre 2 De l AD aux prtéines..................................................... 17 2.1 Réplicatin.................................................................................................. 17 2.1.1 Définitin............................................................................................. 17 2.1.2 Initiatin............................................................................................. 18 2.1.3 Réplicatin semi-cnservative............................................................................. 18 2.1.4 Plarité de réplicatin................................................................................... 19 2.1.5 Mécanisme............................................................................................ 20 2.2 Transcriptin................................................................................................ 20 2.2.1 Définitin............................................................................................. 20 2.2.2 Initiatin............................................................................................. 21 2.2.3 Élngatin du transcrit d AR messager..................................................................... 22 2.2.4 Terminaisn........................................................................................... 22 2.2.5 Maturatin de l ARm................................................................................... 22 2.3 Traductin................................................................................................... 23 2.3.1 Définitin............................................................................................. 23
2.3.2 Cde génétique........................................................................................ 23 2.3.3 Initiatin............................................................................................. 24 2.3.4 Élngatin............................................................................................ 24 2.3.5 Terminaisn........................................................................................... 25 2.4 Structure des prtéines..................................................................................... 26 2.5 Résumé...................................................................................................... 26 2.6 Exercices.................................................................................................... 28 Chapitre 3 Enzymes de mdificatin de l AD.................................. 29 3.1 Enzymes de restrictin...................................................................................... 29 3.1.1 Origine............................................................................................... 29 3.1.2 Utilité................................................................................................ 30 3.1.3 Mde de fnctinnement................................................................................. 30 3.1.4 Sites de recnnaissance.................................................................................. 30 3.2 Digestin de l AD.......................................................................................... 31 3.2.1 Digestin partielle et activité étile........................................................................ 32 3.3 Autres enzymes de mdificatin de l AD................................................................... 33 3.3.1 Remplissage u digestin des extrémités saillantes............................................................ 33 3.3.2 Ligatin de fragments d AD............................................................................. 34 3.3.3 Phsphrrylatin de l AD............................................................................... 34 3.3.4 Déphsphrylatin de l AD.............................................................................. 35 3.3.5 Tampns de réactin.................................................................................... 35 3.4 Résumé...................................................................................................... 36 3.5 Exercices.................................................................................................... 36 Chapitre 4 Mutatins et transmissin des caractères génétiques... 37 4.1 Définitin................................................................................................... 37 4.2 Terminlgie................................................................................................ 38 4.2.1 Géntype et phéntype.................................................................................. 38 4.2.2 Haplïdie et diplïdie................................................................................... 38 4.2.3 Dminance et récessivité................................................................................. 38 4.2.4 Mutant et type sauvage.................................................................................. 39 4.3 Types de mutatins......................................................................................... 40 4.4 Mutatins chez les humains................................................................................. 42 4.4.1 Mutatins récessives liées au chrmsme X................................................................. 42 4.4.2 Mutatins dminantes liées au chrmsme X................................................................ 42 4.4.3 Mutatins autsmiques récessives......................................................................... 42 4.4.4 Mutatins autsmiques dminantes........................................................................ 43 4.5 Plymrphisme.............................................................................................. 44 4.5.1 Plymrphisme de lngueur de fragments de restrictin (RFLP).................................................. 44 4.5.2 mbre variable de répétitins en tandem (VTR)............................................................ 44 4.5.3 Curtes répétitins en tandem (STR)....................................................................... 44 4.5.4 Plymrphisme d un seul nuclétide (SP)................................................................... 45 4.6 Résumé...................................................................................................... 46 4.7 Exercices.................................................................................................... 46 Chapitre 5 Clnage mléculaire.......................................................... 47 5.1 Définitin................................................................................................... 47 XII H H 2
5.2 Plasmides................................................................................................... 49 5.3 Vecteurs de clnage......................................................................................... 49 5.3.1 Cmpsantes de base.................................................................................... 50 5.3.1.1 Origine de réplicatin (ri)..................................................................... 50 5.3.1.2 Gène de sélectin............................................................................. 51 5.3.1.3 Site de clnage multiple....................................................................... 51 5.3.2 Cmpsantes facultatives................................................................................. 51 5.3.2.1 Marqueur de criblage.......................................................................... 52 5.3.2.2 Prmteur et terminateur de transcriptin......................................................... 52 5.3.2.3 Marqueur nutritinnel et rigine de réplicatin supplémentaire........................................ 54 5.3.2.4 Épitpes..................................................................................... 55 5.3.2.5 Séquences brdant le site de clnage multiple...................................................... 55 5.4 Résumé...................................................................................................... 56 5.5 Exercices.................................................................................................... 56 Chapitre 6 Techniques d analyse de l AD......................................... 57 6.1 Analyse sur gel d agarse................................................................................... 58 6.1.1 Préparatin et chargement d un gel d agarse................................................................ 58 6.1.2 Migratin de l AD...................................................................................... 59 6.1.2.1 Migratin de l AD seln sa cnfrmatin tridimensinnelle........................................... 59 6.1.2.2 Migratin de l AD seln la taille des mlécules.................................................... 60 6.1.2.3 Migratin de l AD seln la charge des mlécules................................................... 62 6.1.3 Visualisatin de l AD dans un gel d agarse................................................................. 62 6.2 Analyse de la cncentratin de l AD....................................................................... 64 6.2.1 Dsage de l AD à l aide d un gel d agarse................................................................. 64 6.2.2 Dsage de l AD par spectrphtmétrie.................................................................... 64 6.2.3 Dsage de l AD à l aide de clrants flurescents............................................................ 65 6.3 Analyse sur gel de plyacrylamide.......................................................................... 66 6.4 Prtcles................................................................................................... 68 6.4.1 Quelques ntes sur la manipulatin de l AD................................................................ 68 6.4.2 Préparatin d un gel d agarse............................................................................ 68 6.4.2.1 Préparatin des slutins...................................................................... 69 6.4.2.2 Préparatin du gel............................................................................ 70 6.4.2.3 Préparatin des échantillns.................................................................... 71 6.4.2.4 Migratin et visualisatin de l AD............................................................... 71 6.4.3 Préparatin d un gel de plyacrylamide (nn dénaturant)....................................................... 72 6.4.3.1 Préparatin des slutins...................................................................... 72 6.4.3.2 Préparatin du gel............................................................................ 73 6.4.3.3 Préparatin des échantillns.................................................................... 74 6.4.3.4 Migratin et visualisatin de l AD............................................................... 74 6.5 Résumé...................................................................................................... 75 6.6 Exercices.................................................................................................... 75 Chapitre 7 Utilisatin d Escherichia cli en bilgie mléculaire.... 77 7.1 Transfrmatin d une bactérie par un plasmide............................................................. 78 7.1.1 Définitin de la transfrmatin............................................................................ 78 7.1.1.1 Transfrmatin par la chaleur................................................................... 79 7.1.1.2 Électrpratin............................................................................... 79 XIII h
7.1.2 Suches utilisées........................................................................................ 80 7.2 Sélectin u criblage des transfrmants.................................................................... 82 7.3 Extractin d AD plasmidique............................................................................... 83 7.3.1 Mini-préparatin........................................................................................ 84 7.3.2 Midi-préparatin et maxi-préparatin....................................................................... 86 7.4 Prductin et purificatin de prtéines recmbinantes..................................................... 86 7.4.1 Système d inductin...................................................................................... 86 7.4.1.1 Principales étiquettes utilisées................................................................... 86 7.5 Prtcles................................................................................................... 88 7.5.1 Transfrmatin par la chaleur............................................................................. 88 7.5.1.1 Préparatin des slutins...................................................................... 89 7.5.1.2 Transfrmatin................................................................................ 90 7.5.2 Mini-préparatin d AD plasmidique........................................................................ 91 7.5.2.1 Préparatin des slutins...................................................................... 92 7.5.2.2 Mini-préparatin d AD plasmidique («mini-prep»)................................................. 94 7.5.3 Purificatin d une prtéine à l aide de sn étiquette histidine................................................... 96 7.5.3.1 Préparatin des slutins...................................................................... 97 7.5.3.2 Purificatin des prtéines...................................................................... 98 A. Culture bactérienne et inductin de la prtéine................................................ 98 B. Préparatin de l extrait cellulaire............................................................ 98 C. Préparatin de la clnne d affinité......................................................... 99 D1. Purificatin de la prtéine (cas d une prtéine sluble, surnageant A).............................. 99 D2. Purificatin de la prtéine (cas d une prtéine insluble, surnageant B)............................ 100 7.6 Résumé..................................................................................................... 101 7.7 Exercices................................................................................................... 101 Chapitre 8 Étapes détaillées d un clnage mléculaire.................. 103 8.1 Cartes de restrictin....................................................................................... 103 8.2 Étapes d un clnage mléculaire........................................................................... 106 8.2.1 Élabratin d une stratégie de clnage..................................................................... 106 8.2.1.1 Chix du vecteur et de l insert................................................................. 106 8.2.1.2 Chix des sites de restrictin.................................................................. 108 A. Si pssible, chisir des sites de restrictin chésifs entre eux.................................... 108 B. Chisir des sites différents de chaque côté du vecteur et de l insert.............................. 110 C. Chix de site unique dans le vecteur....................................................... 110 D. Chix de site unique dans l insert.......................................................... 110 E. Chisir des enzymes de restrictin curamment utilisées........................................ 111 F. Vérifier la cmpatibilité de réactin entre les enzymes chisies................................... 111 8.2.1.3 Déphsphrylatin du vecteur.................................................................. 115 8.2.1.4 Autres pints à planifier...................................................................... 115 8.2.2 Digestin du vecteur et de l insert........................................................................ 115 8.2.3 Purificatin du vecteur et de l insert sur gel................................................................ 115 8.2.4 Déphsphrylatin du vecteur............................................................................ 117 8.2.5 Changement de tampn de réactin....................................................................... 117 8.2.6 Ligatin de l insert avec le vecteur........................................................................ 119 8.2.7 Digestin pst-ligatin de prduits nn désirés.............................................................. 121 8.2.8 Témins............................................................................................. 121 8.2.9 Transfrmatin de la bactérie avec le prduit de ligatin...................................................... 122 8.2.10 Sélectin u criblage des transfrmants.................................................................... 122 XIV H H 2
8.2.11 Identificatin des clnes cntenant la cnstructin recherchée.................................................. 122 8.2.12 Entrepsage des transfrmants intéressants................................................................. 124 8.3 Prtcles.................................................................................................. 124 8.3.1 Précipitatin de l AD.................................................................................. 124 8.3.1.1 Préparatin des slutins..................................................................... 125 8.3.1.2 Précipitatin de l AD........................................................................ 125 8.3.2 Extractin d AD à partir d un gel d agarse............................................................... 127 8.3.2.1 Préparatin des slutins..................................................................... 127 8.3.2.2 Extractin d AD à partir d un gel d agarse..................................................... 128 8.4 Résumé..................................................................................................... 129 8.5 Exercices................................................................................................... 129 Chapitre 9 Réactin de plymérisatin en chaîne u PCR............. 133 9.1 Principe du PCR........................................................................................... 133 9.1.1 Dénaturatin de l AD.................................................................................. 135 9.1.2 Hybridatin des amrces................................................................................ 135 9.1.3 Plymérisatin........................................................................................ 135 9.1.4 Prductin d un grand nmbre de cpies d un fragment d AD grâce à l enchaînement de plusieurs cycles.............. 136 9.2 Température de fusin (T m ) d un fragment d AD.......................................................... 136 9.3 Cnstituants essentiels d un mélange réactinnel de PCR...................................................137 9.3.1 AD matrice.......................................................................................... 137 9.3.2 Amrces cmplémentaires au fragment cible................................................................ 138 9.3.3 Désxynuclétides...................................................................................... 139 9.3.4 Plymérase thermrésistante............................................................................. 139 9.3.5 Tampn de réactin.................................................................................... 140 9.4 Utilités fréquentes d un PCR............................................................................... 140 9.4.1 Ajut de séquences.................................................................................... 140 9.4.2 Clnage d un fragment d AD amplifié par PCR dans un vecteur T.............................................. 142 9.4.3 Intrductin de mutatins dans un fragment d AD.......................................................... 143 9.4.4 Amplificatin d un ensemble de fragments d AD............................................................ 144 9.5 Thermcycleur.............................................................................................. 145 9.6 PCR en temps réel......................................................................................... 145 9.6.1 Méthdes de détectin de l AD amplifié................................................................... 147 9.6.1.1 Clrant SYBR green......................................................................... 147 9.6.1.2 Sndes d hybridatin......................................................................... 147 9.6.1.3 Sndes Taqman.............................................................................. 148 9.6.1.4 Balises mléculaires.......................................................................... 149 9.7 RT-PCR..................................................................................................... 151 9.8 Analyse d une réactin de PCR............................................................................. 151 9.9 Précautins à prendre au mment de préparer une réactin de PCR...................................... 151 9.10 Prtcle de PCR.......................................................................................... 152 9.10.1 Préparatin des slutins............................................................................... 153 9.10.2 Préparatin des bactéries............................................................................... 154 9.10.3 Prgrammatin du thermcycleur......................................................................... 154 9.10.4 Préparatin du mélange réactinnel....................................................................... 154 9.10.5 Analyse du prduit de réactin.......................................................................... 155 9.11 Résumé..................................................................................................... 155 9.12 Exercices................................................................................................... 156 XV h
Chapitre 10 Sndes nucléiques.......................................................... 157 10.1 Marquage des sndes avec des grupements radiactifs................................................... 158 10.1.1 Radiactivité.......................................................................................... 158 10.1.1.1 Utilisatin d istpes radiactifs en bilgie mléculaire............................................. 158 10.1.1.2 Radiprtectin............................................................................. 159 10.1.1.3 Demi-vie des istpes radiactifs............................................................... 159 10.1.2 Marquage d un fragment d AD.......................................................................... 160 10.1.2.1 Marquage interne............................................................................ 160 A. Marquage aléatire...................................................................... 160 B. Marquage d un fragment d AD par PCR.................................................... 160 10.1.2.3 Marquage aux extrémités...................................................................... 162 A. Marquage par incrpratin de nuclétides marqués........................................... 162 B. Marquage en 5 par un phsphate radiactif................................................. 163 10.1.3 Marquage d AR....................................................................................... 163 10.2 Autres méthdes de marquage..............................................................................165 10.2.1 Chimiluminescence..................................................................................... 165 10.3 Enlèvement des nuclétides libres.......................................................................... 166 10.4 Prtcles.................................................................................................. 167 10.4.1 Marquage aléatire d un fragment d AD duble brin......................................................... 167 10.4.1.1 Préparatin des slutins..................................................................... 168 10.4.1.2 Marquage de l AD.......................................................................... 168 10.4.2 Marquage en 5 d un phsphate radiactif par une réactin d échange........................................... 169 10.4.2.1 Préparatin des slutins..................................................................... 169 10.4.2.2 Marquage de l AD.......................................................................... 169 10.5 Résumé..................................................................................................... 170 10.6 Exercices................................................................................................... 170 Chapitre 11 Séquençage de l AD..................................................... 171 11.1 Principe.................................................................................................... 171 11.2 Autmatisatin............................................................................................. 175 11.3 Séquençage du génme humain............................................................................ 176 11.4 Résumé..................................................................................................... 176 11.5 Exercices................................................................................................... 177 Chapitre 12 Extractin et analyse de l AD.................................... 179 12.1 Analyse in vitr de l AD.................................................................................. 179 12.1.1 Extractin et purificatin de l AD........................................................................ 179 12.1.2 Buvardage à la Suthern (Suthern blt)................................................................... 180 12.1.2.1 Digestin et migratin de l AD................................................................ 182 12.1.2.2 Transfert de l AD........................................................................... 182 A. Type de tampn de transfert.............................................................. 183 B. Type de transfert....................................................................... 183 12.1.2.3 Fixatin de l AD sur la membrane............................................................. 184 12.1.2.4 Hybridatin................................................................................. 184 12.1.2.5 Lavages et expsitin de la membrane........................................................... 184 12.2 Analyse in viv de l AD.................................................................................. 185 12.2.1 Carytypage.......................................................................................... 185 12.2.1.1 Anmalies chrmsmiques.................................................................... 186 XVI H H 2
A. Anmalies de nmbre.................................................................... 186 B. Anmalies de structure................................................................... 187 12.2.2 Hybridatin in situ.................................................................................... 187 12.2.2.1 Hybridatin in situ par flurescence (FISH)....................................................... 188 12.2.2.2 Hybridatin génmique cmparative (CGH)........................................................ 189 12.2.2.3 Peinture chrmsmique...................................................................... 190 12.2.2.4 Élngatin d amrce in situ (PRIS)............................................................. 190 12.3 Prtcles.................................................................................................. 190 12.3.1 Extractin d AD à partir de prélèvements sanguins.......................................................... 190 12.3.1.1 Préparatin des slutins..................................................................... 191 12.3.1.2 Extractin de l AD.......................................................................... 192 12.3.2 Extractin d AD à partir de queues de suris.............................................................. 193 12.3.2.1 Préparatin des slutins..................................................................... 193 12.3.2.2 Extractin de l AD.......................................................................... 194 12.3.3 Buvardage à la Suthern................................................................................ 194 12.3.3.1 Préparatin des slutins..................................................................... 195 12.3.3.2 Digestin de l AD........................................................................... 197 12.3.3.3 Migratin de l AD........................................................................... 199 12.3.3.4 Transfert................................................................................... 199 A. Traitement du gel....................................................................... 199 B. Préparatin de la membrane et des papiers de transfert....................................... 200 C. Préparatin du mntage de transfert....................................................... 200 D. Transfert.............................................................................. 200 12.3.3.5 Hybridatin................................................................................. 201 12.3.3.6 Lavages.................................................................................... 202 12.3.3.7 Expsitin.................................................................................. 202 12.4 Résumé..................................................................................................... 203 12.5 Exercices................................................................................................... 203 Chapitre 13 Analyse de l AR............................................................ 205 13.1 Enzymes qui dégradent l AR : les Rases................................................................. 205 13.1.1 Surces de cntaminatin par les Rases................................................................... 206 13.2 Extractin de l AR........................................................................................ 207 13.2.1 Extractin à l isthicyanate de guanidine.................................................................. 207 13.2.2 Purificatin de l ARm................................................................................. 207 13.2.3 Dsage de l AR...................................................................................... 207 13.3 Analyse de l ARm......................................................................................... 207 13.3.1 Buvardage à la nrthern................................................................................ 208 13.3.2 RT-PCR.............................................................................................. 208 13.3.3 Puces à AD......................................................................................... 209 13.3.3.1 Exemple d applicatin des puces à AD.......................................................... 211 13.3.4 Analyse de la lcalisatin de l AR par hybridatin in situ.................................................... 211 13.3.5 Autres méthdes d analyse de l AR....................................................................... 211 13.4 Prtcles.................................................................................................. 211 13.4.1 Extractin de l AR.................................................................................... 211 13.4.1.1 Préparatin des slutins..................................................................... 212 13.4.1.2 Extractin de l AR.......................................................................... 213 13.4.2 RT-PCR.............................................................................................. 214 13.4.2.1 Préparatin des slutins..................................................................... 214 XVII h
13.4.2.2 Transcriptin inverse......................................................................... 215 13.4.2.3 PCR....................................................................................... 215 13.5 Résumé..................................................................................................... 215 13.6 Exercices................................................................................................... 216 Chapitre 14 Analyse des prtéines.................................................... 217 14.1 Extractin des prtéines....................................................................................217 14.2 Purificatin des prtéines.................................................................................. 218 14.2.1 Précipitatin différentielle des prtéines.................................................................... 218 14.2.2 Chrmatgraphie sur clnne............................................................................ 219 14.2.3 Stabilité des prtéines.................................................................................. 220 14.3 Dsage des prtéines...................................................................................... 221 14.3.1 Méthde spectrphtmétrique........................................................................... 221 14.3.2 Méthdes clrimétriques................................................................................ 222 14.4 Électrphrèse des prtéines............................................................................... 222 14.4.1 Gels de plyacrylamide dénaturants (SDS-PAGE)............................................................. 223 14.4.2 Gels de plyacrylamide natifs............................................................................ 225 14.4.3 Électrphrèse en deux dimensins....................................................................... 225 14.4.4 Clratin des prtéines d un gel......................................................................... 226 14.5 Buvardage à la western (western blt).................................................................... 226 14.5.1 Types d anticrps...................................................................................... 227 14.6 Séquençage de prtéines................................................................................... 228 14.7 Analyse des prpriétés enzymatiques des prtéines........................................................ 228 14.8 Analyse des interactins prtéine-prtéine................................................................. 229 14.8.1 Cimmunprécipitatin.................................................................................. 229 14.8.2 Cpurificatin en chrmatgraphie........................................................................ 230 14.8.3 Duble hybride....................................................................................... 230 14.8.4 FRET................................................................................................ 231 14.9 Interactins prtéine AD............................................................................. 232 14.9.1 Retardement sur gel................................................................................... 232 14.9.2 Immunprécipitatin de la chrmatine (ChIP)............................................................... 232 14.10 Analyse de la lcalisatin des prtéines................................................................... 234 14.10.1 Immunhistchimie et immunflurescence.................................................................. 234 14.10.2 Étiquette GFP........................................................................................ 234 14.11 Prtcles.................................................................................................. 234 14.11.1 Dsage des prtéines................................................................................... 234 14.11.1.1 Préparatin des slutins..................................................................... 235 14.11.1.2 Méthde spectrphtmétrique................................................................. 235 14.11.1.3 Méthde de Bradfrd......................................................................... 236 14.11.2 Électrphrèse des prtéines sur gel de plyacrylamide-sds (SDS-PAGE).......................................... 236 14.11.2.1 Préparatin des slutins..................................................................... 237 14.11.2.2 Préparatin du gel........................................................................... 238 A. Mntage des vitres...................................................................... 238 B. Gel de séparatin 10 % ( 10 ml)......................................................... 238 C. Gel de cncentratin 5% ( 4ml).......................................................... 239 14.11.2.3 Mntage du gel dans l appareil................................................................. 240 14.11.2.4 Préparatin des échantillns................................................................... 240 14.11.2.5 Migratin des prtéines....................................................................... 240 14.11.3 Clratin au bleu de Cmassie......................................................................... 241 XVIII H H 2
14.11.3.1 Préparatin des slutins..................................................................... 241 14.11.3.2 Clratin du gel............................................................................ 242 14.11.4 Buvardage à la western................................................................................ 242 14.11.4.1 Préparatin des slutins..................................................................... 243 14.11.4.2 Transfert des prtéines....................................................................... 244 14.11.4.3 Blcage de la membrane...................................................................... 245 14.11.4.4 Incubatin avec les anticrps et lavages.......................................................... 245 14.11.4.5 Révélatin.................................................................................. 245 14.12 Résumé..................................................................................................... 246 14.13 Exercices................................................................................................... 246 Chapitre 15 Utilisatin des techniques de bilgie mléculaire en milieu clinique.................................................................................. 247 15.1 Maladies génétiques héréditaires........................................................................... 248 15.1.1 Hémchrmatse héréditaire (HH)......................................................................... 248 15.1.1.1 Méthdes diagnstiques classiques............................................................... 250 15.1.1.2 Méthdes diagnstiques mléculaires............................................................. 250 A. PCR cmbiné à l analyse des sites de restrictin.............................................. 250 B. PCR allèle spécifique..................................................................... 250 15.1.2 Syndrme du X fragile.................................................................................. 252 15.1.2.1 Méthdes diagnstiques........................................................................ 252 A. Méthde d analyse du gène FMR1 par buvardage à la Suthern.................................. 252 B. Méthde d analyse du gène FMR1 par PCR................................................... 254 15.1.3 Autres maladies génétiques héréditaires.................................................................... 254 15.2 Onclgie.................................................................................................. 255 15.2.1 Leucémie myélïde chrnique (LMC)....................................................................... 255 15.2.1.1 Méthdes diagnstiques........................................................................ 256 A. Identificatin du chrmsme de Philadelphie par carytypage................................... 256 B. Identificatin de la translcatin t(9;22) par FISH............................................. 257 C. Identificatin de l ARm hybride BCR/ABL par RT-PCR.......................................... 257 15.2.2 Autres types de leucémies dnt le diagnstic mléculaire est pssible............................................ 258 15.3 Maladies infectieuses....................................................................................... 258 15.3.1 Chlamydia et gnrrhée................................................................................ 258 15.3.1.1 Méthdes diagnstiques classiques............................................................... 259 15.3.1.2 Méthdes diagnstiques mléculaires............................................................. 259 A. Prélèvements et préparatin des échantillns................................................. 259 B. Amplificatin des cibles.................................................................. 259 C. Détectin des amplicns.................................................................. 260 15.3.2 Autres maladies infectieuses............................................................................. 260 15.4 Identificatin d individus................................................................................... 261 15.4.1 Analyse des plymrphismes............................................................................. 262 15.4.1.1 Analyse des VTR............................................................................ 262 15.4.1.2 Analyse des STR............................................................................. 262 15.4.1.3 Analyse des STR du chrmsme Y.............................................................. 263 15.4.1.4 Analyse de l AD mitchndrial................................................................. 263 15.4.1.5 Analyse des SP............................................................................. 264 15.5 Résumé..................................................................................................... 265 XIX h
Chapitre 16 Série de labratires 1................................................. 267 16.1 Diagnstic mléculaire de l hémchrmatse héréditaire de type 1........................................ 267 16.1.1 Extractin d AD à partir de prélèvements sanguins.......................................................... 268 16.1.2 Détectin de la mutatin C282Y par PCR allèle spécifique..................................................... 268 16.1.2.1 Préparatin des mélanges réactinnels........................................................... 270 16.1.3 Migratin sur gel d agarse des réactins de PCR............................................................ 271 16.2 Diagnstic de la leucémie myélïde chrnique............................................................. 271 16.2.1 Extractin d AR à partir de prélèvements sanguins.......................................................... 273 16.2.1.1 Préparatin des slutins..................................................................... 273 16.2.1.2 Extractin de l AR.......................................................................... 275 A. Purificatin des glbules blancs............................................................ 275 B. Extractin de l AR..................................................................... 276 16.2.2 Transcriptin inverse de l ARm en ADc................................................................... 277 16.2.3 Première rnde de PCR................................................................................. 277 16.2.4 Deuxième rnde de PCR................................................................................ 278 16.2.5 Migratin sur gel d agarse.............................................................................. 278 16.3 Élabratin d une stratégie pur le diagnstic mléculaire du syndrme du X fragile.................... 279 16.3.1 Recherche de la séquence du prmteur et du gène FMR1 dans des bases de dnnées publiées dans Internet.................................................................................. 280 16.3.2 Créatin d amrces de PCR pur amplifier un fragment apprprié............................................... 280 16.3.3 Clnage de la snde................................................................................... 280 Chapitre 17 Série de labratires 2................................................. 281 17.1 Préparatin du gène cdant pur le facteur σ 32 d Escherichia cli........................................ 282 17.1.1 Amplificatin du gène par PCR........................................................................... 282 17.1.2 Vérificatin du PCR sur gel d agarse...................................................................... 282 17.1.3 Purificatin du fragment de PCR......................................................................... 282 17.2 Clnage du gène dans un vecteur d expressin............................................................ 284 17.2.1 Digestin de l insert et du vecteur........................................................................ 284 17.2.2 Vérificatin et purificatin des digestins sur gel d agarse.................................................... 285 17.2.3 Ligatin de l insert et du vecteur, puis transfrmatin........................................................ 285 17.2.4 Vérificatin du clnage................................................................................. 286 17.3 Inductin de l expressin de la prtéine et purificatin par chrmatgraphie d affinité................... 286 17.3.1 Transfrmatin de la bactérie BL21(DE3)................................................................... 286 17.3.2 Inductin de l expressin et purificatin de la prtéine de fusin................................................ 286 17.4 Vérificatin de la purificatin de la prtéine de fusin................................................... 287 17.4.1 Gel SDS-PAGE......................................................................................... 287 17.4.2 Immundétectin de la prtéine par buvardage à la western.................................................. 287 Annexe I Crrigé des exercices.......................................................... 289 Annexe II Aide mémire..................................................................... 297 Médiagraphie.......................................................................................... 301 Glssaire................................................................................................. 307 Index...................................................................................................... 323 XX H H 2
Liste des tableaux Tableau 1.1 Structure des cmpsantes des acides nucléiques...................................................... 5 Tableau 1.2 Principales différences entre prcarytes et eucarytes................................................ 10 Tableau 1.3 Différences entre la mitse et la méise............................................................ 14 Tableau 2.1 Cde génétique.................................................................................. 24 Tableau 3.1 Quelques enzymes de restrictin cmmunes et leur site de recnnaissance.............................. 32 Tableau 3.2 Exemple d une réactin de digestin avec une enzyme de restrictin................................... 33 Tableau 3.3 Enzymes de mdificatin de l AD à utiliser seln le besin.......................................... 33 Tableau 7.1 Principaux antibitiques et cncentratins suggérées.................................................. 82 Tableau 7.2 Types de préparatins d AD plasmidique........................................................... 83 Tableau 7.3 Principales étiquettes utilisées pur la purificatin de prtéines........................................ 88 Tableau 8.1 Exemple d une réactin de ligatin................................................................ 119 Tableau 9.1 Quantité d AD matrice à utiliser pur une réactin de PCR seln la surce de l AD...................138 Tableau 9.2 Efficacité de cupure de quelques enzymes de restrictin sur des extrémités d AD..................... 142 Tableau 10.1 Équivalence entre les unités de radiactivité....................................................... 160 Tableau 14.1 Purcentage de plyacrylamide requis seln la taille des prtéines à séparer........................... 224 Tableau annexe-ii.i Tableau péridique des éléments chimiques......................................................... 300 Liste des figures Figure 0.1 De la bilgie générale à la bilgie mléculaire................................................... 1 Figure 1.1 Structure d un nuclétide............................................................................ 4 Figure 1.2 Structure du pentse de l AD et de l AR......................................................... 6 Figure 1.3 Structure de l AD.................................................................................. 7 Figure 1.4 iveaux de cmpactin de la chrmatine........................................................... 9 Figure 1.5 Schéma d un cycle cellulaire typique............................................................... 11 Figure 1.6 Mitse.............................................................................................. 12 Figure 1.7 Méise.............................................................................................. 13 Figure 2.1 Réplicatin de l AD................................................................................ 18 Figure 2.2 Réplicatin semi-cnservative....................................................................... 19 Figure 2.3 Schéma d un gène et des éléments nécessaires à la transcriptin.................................. 21 Figure 2.4 Maturatin d un ARm.............................................................................. 23 Figure 2.5 ARt et principales étapes de la traductin........................................................ 25 Figure 2.6 Hémglbine........................................................................................ 27 Figure 3.1 Digestin par des enzymes de restrictin.......................................................... 31 Figure 3.2 Remplissage u digestin des extrémités saillantes................................................. 34 Figure 3.3 Réactin catalysée par la plynuclétide kinase du phage T4...................................... 35 Figure 4.1 Transmissin des caractères dminants et récessifs :. expérience de mnhybridisme de Mendel.......................................................... 39 Figure 4.2 Mutatins chrmsmiques et pnctuelles.......................................................... 41 Figure 4.3 Types de mutatins transmissibles chez les humains............................................... 43 Figure 4.4 Exemple de RFLP................................................................................... 45 Figure 5.1 Exemple du clnage du gène de l insuline......................................................... 48 Figure 5.2 Présence de plasmides à l état naturel chez plusieurs bactéries................................... 49 Figure 5.3 Exemple d un vecteur de clnage : puc19.......................................................... 50 XXI h
Figure 5.4 Exemple d un site de clnage multiple............................................................. 51 Figure 5.5 Exemple d un criblage à l aide du gène lacz....................................................... 53 Figure 5.6 Exemple de vecteur navette bactérie-levure........................................................ 54 Figure 6.1 Exemple d appareil de migratin pur l électrphrèse de l AD sur gel d agarse................ 58 Figure 6.2 Exemple d un gel d agarse clré au brmure d éthidium........................................ 60 Figure 6.3 Cncentratin d agarse à utiliser seln la taille des fragments d AD à séparer................. 61 Figure 6.4 Exemple de graphique pur déterminer la taille d un fragment d AD............................. 61 Figure 6.5 Exemple de calcul de cncentratin d AD......................................................... 65 Figure 6.6 Exemple d appareil de migratin pur l électrphrèse de l AD. sur gel de plyacrylamide.......................................................................... 66 Figure 6.7 Puvir de réslutin des gels de plyacrylamide.................................................. 67 Figure 7.1 Schéma d une transfrmatin....................................................................... 78 Figure 7.2 Différence entre sélectin et criblage.............................................................. 81 Figure 7.3 Mini-préparatin d AD plasmidique................................................................ 85 Figure 7.4 Exemple de surexpressin et de purificatin d une prtéine....................................... 87 Figure 8.1 Cartes de restrictin............................................................................... 104 Figure 8.2 Exemples de vecteurs de clnage.................................................................. 107 Figure 8.3 Extrémités saillantes et chésives................................................................. 109 Figure 8.4 Différentes pssibilités d intrductin d un insert dans un vecteur. seln les extrémités créées par la digestin....................................................... 111 Figure 8.5 Purificatin sur gel d un fragment d AD digéré.................................................. 116 Figure 8.6 Déphsphrylatin du vecteur digéré.............................................................. 118 Figure 8.7 Exemple de calcul pur respecter le rati d une mlécule de vecteur. pur cinq mlécules d insert...................................................................... 120 Figure 8.8 Exemple d une cnfirmatin de clnage........................................................... 123 Figure 9.1 Schéma représentant quatre cycles d une réactin de PCR........................................ 134 Figure 9.2 T m d un fragment d AD........................................................................... 137 Figure 9.3 Ajut de séquences dans un fragment d AD amplifié par PCR................................... 141 Figure 9.4 Clnage d un fragment de PCR dans un vecteur T................................................ 143 Figure 9.5 Le LM-PCR......................................................................................... 144 Figure 9.6 Phases d un PCR................................................................................... 146 Figure 9.7 Méthdes de détectin de l AD amplifié.......................................................... 147 Figure 10.1 Sndes nucléiques................................................................................. 157 Figure 10.2 Marquage aléatire................................................................................ 161 Figure 10.3 Marquage par remplissage d une extrémité 5 saillante............................................ 162 Figure 10.4 Marquage par la plymérase à AD du phage T4..................................................163 Figure 10.5 Marquage d un AR par transcriptin in vitr..................................................... 164 Figure 10.6 Exemple de chimiluminescence..................................................................... 166 Figure 11.1 Séquençage seln la méthde de Sanger.......................................................... 173 Figure 12.1 Détectin de l anémie falcifrme par buvardage à la Suthern................................... 181 Figure 12.2 Buvardage à la Suthern...........................................................................183 Figure 12.3 Psitin du centrmère sur un chrmsme....................................................... 185 Figure 12.4 Carytypes humains................................................................................ 186 Figure 12.5 Détectin des sndes marquées.................................................................... 188 Figure 12.6 Hybridatin in situ par flurescence (FISH)....................................................... 189 XXII H H 2
Figure 13.1 Puce à AD........................................................................................ 210 Figure 14.1 Exemples de chrmatgraphie..................................................................... 220 Figure 14.2 Électrphrèse des prtéines sur gel de SDS-plyacrylamide...................................... 223 Figure 14.3 Électrphrèse de prtéines en deux dimensins.................................................. 225 Figure 14.4 Buvardage à la western........................................................................... 227 Figure 14.5 Cimmunprécipitatin............................................................................. 229 Figure 14.6 Système duble hybride chez la levure............................................................ 231 Figure 14.7 Retardement sur gel............................................................................... 232 Figure 14.8 Immunprécipitatin de la chrmatine............................................................ 233 Figure 15.1 Analyse mléculaire du gène HFE pur la présence de la mutatin C282Y par analyse des sites de restrictin............................................................... 251 Figure 15.2 Analyse du gène FMR1 par buvardage à la Suthern.............................................. 253 Figure 15.3 Chrmsme de Philadelphie...................................................................... 256 Figure 15.4 Principe de la méthde diagnstique de la trusse Amplicr TM (test CT/G)...................... 261 Figure 15.5 Analyse de SP par micrséquençage.............................................................. 264 Figure 16.1 Détectin de la mutatin C282Y par PCR allèle spécifique........................................ 269 Figure 16.2 Dérulement des étapes du diagnstic mléculaire de la leucémie myélïde chrnique........... 272 Figure 17.1 Cnstructin plasmidique.......................................................................... 283 XXIII h